CN107987126B - 4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物及其合成方法和应用，涉及内***肽类似物及其合成方法和应用。本发明提供4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物及其合成和应用。本发明的内***肽类似物为酪氨酸‑脯氨酸‑色氨酸‑苯丙(N‑羟基)酰胺和酪氨酸‑脯氨酸‑苯丙氨酸‑苯丙(N‑羟基)酰胺。合成方法：一、N‑叔丁氧羰基‑苯丙(N‑羟基)酰胺的合成；二、苯丙(N‑羟基)酰胺的合成；三、苄氧羰基‑色氨酸‑苯丙(N‑羟基)酰胺的合成；四、苄氧羰基‑酪氨酸‑脯氨酸的合成；五、苄氧羰基‑酪氨酸‑脯氨酸‑色氨酸‑苯丙(N‑羟基)酰胺的合成；六、酪氨酸‑脯氨酸‑色氨酸‑苯丙(N‑羟基)酰胺的合成。本发明用于制备多肽镇痛药物。
Description
技术领域
本发明涉及内***肽类似物及其合成方法和应用。
背景技术
内***肽是哺乳动物体内广泛存在的内源性的μ-阿片受体配体，分为内***肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2,EM-1)和内***肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2,EM-2)。在所有已知的阿片物质中，内***肽对μ-阿片受体具有极高的亲和性和选择性。内***肽通过与G蛋白偶联的μ-阿片受体结合，参与诸多功能的调节，但其主要作用是强效的镇痛活性，可产生活性强于***而副作用较少的镇痛作用。特别是在神经性疼痛动物模型中也表现出明显的镇痛活性，比大多数阿片肽都更有效，使其具有潜在的开发前景。当然，基于内***肽的主链骨架和芳香侧链的经典特性，它们也是研究结构活性关系的模型肽。
大多数天然阿片肽都具有信使序列和地址序列两个重要组成部分。信使序列即N-末端的三肽或者四肽片断，对配体与受体相互作用尤为重要。而地址序列为剩下的C-末端片断，对多肽的稳定性起决定性作用。研究表明，经典阿片肽的重要特征是在于1位具有阳离子化基团和酚基团，2位具有空间子，3位具有亲脂性的和芳香的残基，4位具有C-末端酰胺化的的地址域。对于内***肽，其1位酪氨酸具有严格的氨基和酚基团，2位脯氨酸作为合适的空间子，3位的芳香氨基酸残基，以及4位酰胺化的苯丙氨酸。
然而内***肽对μ-阿片受体亲和性、阿片激动活性、及镇痛特性还有待提高。此外，内***肽能够引起血压降低和心搏徐缓，即对心血管***具有一定的副作用。
发明内容
本发明提供4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物及其合成方法和应用，在制备高效、低副作用的多肽镇痛药物方面具有很高的临床意义和应用价值。
本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽-1类似物为酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：
上述4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，包括以下步骤：
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；
三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-色氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。
本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽-2类似物为酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：
上述4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，包括以下步骤：
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；
三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。
本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物，是通过将内***肽-1和内***肽-2的第4位苯丙酰胺羟基化修饰，构建一种高效的内***肽类似物。
内***肽的N-末端的三肽为信使序列，4位苯丙酰胺为地址序列。这两个序列的3D结构对于阿片受体亲和以及生物活性构象的形成起着重要作用。尤其4位苯丙酰胺决定着内***肽生物学功能的发挥。将内***肽的4位苯丙酰胺去氨基化，即C-末端羧基裸露，将导致内***肽在DMSO溶液中的分子构象更加柔性，内***肽的C-末端自由的氨基酸将导致其与μ-阿片受体的亲和活性和激动活性几乎完全丧失。同样，在morphiceptin中，C-末端去酰胺化也降低了多肽的生物活性。此外，羟基基团影响多肽分子内氢键的形成，进而改变多肽的生物活性。将内***肽的1位酪氨酸的酚羟基去掉，将极大降低内***肽的μ-阿片受体亲和性和阿片活性，证明内***肽中的羟基基团的重要性。
本发明能够提高内***肽类似物与μ-阿片受体的亲和性与阿片活性，以及降低药物的镇痛耐受。通过同位素标记的配体-受体亲和实验，离体GPI/MVD标本阿片活性及在体镇痛与耐受实验，对本发明合成的内***肽类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，与内***肽相比，本发明的内***肽类似物具有较高的μ-阿片受体亲和性，阿片激动活性，及高效低耐受的镇痛特性。经过实验证实最大镇痛效力在注射药物5min后产生，能达到％MPE约80％左右，且镇痛持续时间较长。另外，***肽类似物对心血管***的作用效果明显降低，具备了较低的心血管副作用的优点。因此，本发明的内***肽类似物在制备高效、低耐受副作用、低心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为侧脑室注射内***肽-1类似物EM-1-NHOH的镇痛效应-时间曲线；
图2为侧脑室注射内***肽-2类似物EM-2-NHOH的镇痛效应-时间曲线；
图3为侧脑室注射内***肽-1的镇痛耐受剂量曲线；
图4为侧脑室注射内***肽-1类似物EM-1-NHOH的镇痛耐受剂量曲线；
图5为侧脑室注射内***肽-2的镇痛耐受剂量曲线；
图6为侧脑室注射内***肽-2类似物EM-2-NHOH的镇痛耐受剂量曲线；
图7为静脉注射内***肽-1及类似物EM-1-NHOH对大鼠***动脉压的作用；
图8为静脉注射内***肽-2及类似物EM-2-NHOH对大鼠***动脉压的作用；
图9为静脉注射内***肽-1及类似物EM-1-NHOH对大鼠心率的作用；
图10为静脉注射内***肽-2及类似物EM-2-NHOH对大鼠心率的作用。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物为内***肽-1类似物，酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：
具体实施方式二：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，包括以下步骤：
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；
三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-色氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中洗涤方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤一中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤三中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤四中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤四中洗涤的步骤为：用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤五中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物为内***肽-2类似物，酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：
具体实施方式十一：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，包括以下步骤：
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；
三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十一不同的是：步骤一中洗涤方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十一或十二不同的是：步骤一中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11。其它与具体实施方式十一或十二相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十一至十三之一不同的是：步骤三中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11。其它与具体实施方式十一至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十一至十四之一不同的是：步骤三中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一至十四之一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十一至十五之一不同的是：步骤四中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11。其它与具体实施方式十一至十五之一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十一至十六之一不同的是：步骤四中洗涤的步骤为：用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一至十六之一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十一至十七之一不同的是：步骤五中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一至十七之一相同。
具体实施方式十九：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：内***肽-1类似物(EM-1-NHOH)的合成
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，再将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将2.6mmol的盐酸羟胺溶于少量水中，用2mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为91％。
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于1mL的浓盐酸和5mL的乙酸乙酯组成的混合液中，室温反应2h。减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺，产率为96％。
三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将2mmol的苄氧羰基-色氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将2mmol的苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为79％。
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为83％。
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入12mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为73％。
六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.6mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为92％。
实施例2：内***肽-2类似物(EM-2-NHOH)的合成
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将2.6mmol的盐酸羟胺溶于少量水中，用2mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为90％。
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于1mL的浓盐酸和5mL的乙酸乙酯组成的混合液中，室温反应2h。减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺，产率为94％。
三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将2mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将2mmol的苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为80％。
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为86％。
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入12mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为75％。
六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.6mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为91％。
以上实施例制备的内***肽类似物的质谱和色谱分析检测结果如表1所示。
表1.内***肽-1和内***肽-2类似物的质谱和色谱分析检测结果
表1的结果表明，本发明方法得到的内***肽类似物的检测值与理论值相符。
实施例1-2制备的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的生物活性实验如下：
1、同位素标记的配体-受体亲和实验
利用制备大鼠脑膜蛋白获得阿片受体，实验分为总结合管、竞争结合管和非特异性结合管，每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone，Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(pH＝7.4)和脑膜蛋白。其中，在总结合管中只加入[3H]DAMGO(0.5nM)或[3H]DPDPE(1nM)和脑膜蛋白，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM Nx/不同浓度的类似物和脑膜蛋白，最后补充Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)至总体积0.5mL。振荡器混匀反应液，37℃摇床反应1h，取出离心管，反应液经ZT-II型细胞收集器收集，GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后取出滤膜，放入24孔板中，每孔加入0.7mL闪烁液，封盖膜封盖。隔夜用β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。利用成都泰盟BL-420F生物记录***计算类似物对特异性结合的抑制率，以浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，线性回归求得IC50值，根据公式Ki＝IC50/(1+[L]/KD)计算Ki值。每个实验数据分别平行做3组实验求平均值。
实验结果见表2。表2的数据显示，内***肽-1类似物EM-1-NHOH的μ-阿片受体的亲和性明显高于母体，约2倍左右，对δ-阿片受体的亲和性略高于母体，其阿片受体选择性也明显提高。此外，内***肽-2类似物EM-2-NHOH对μ-阿片受体的亲和性也略有提高。这表明对内***肽的4位苯丙酰胺进行羟基化修饰得到的类似物对μ-阿片受体具有较高的亲和性特征。
表2.内***肽-1和-2及对应类似物的阿片受体亲和性
2、离体生物标本阿片活性测定
豚鼠回肠纵行肌实验(GPI实验)：豚鼠250-300g，雌雄不限，实验前禁食12h，饮水不限。棒击枕部处死，剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95％O2和5％CO2混合气的Kreb’s液(g/L：NaCl 6.9，CaCl2 0.28，KCl 0.35，KH2PO4 0.16，MgSO4·7H2O 0.30，NaHCO3 2.1，苯海拉明5×10-5，氯化胆碱2.8×10-3，葡萄糖1.98)中，湿润后套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O2和5％CO2)的Kreb’s液、恒温37±0.2℃的玻璃浴管中，预负荷500mg。前30min每5min换一次营养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽0.3-0.5ms单方波，频率6次/min，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量***鉴定其活性；然后选定待测药物3-4个不同的浓度，加入浴管，测得其抑制标本电刺激引起收缩的百分率，抑制程度应在20％-80％之间。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。抑制百分率＝(反应前收缩高度-反应后收缩高度)/反应前收缩高度×100％。然后用剂量-效应半对数作图法，以抑制百分率为纵坐标，以待测药物的浓度的对数为横坐标作图，求得抑制50％收缩高度的药物浓度(IC50)。
小鼠输精管实验(MVD实验)：体重30-35g雄性昆明系小白鼠，颈椎脱臼处死，剖腹取出两侧输精管，浸入持续通入95％O2和5％CO2混合气的Kreb’s液(g/L：NaCl 6.9，CaCl20.28，KCl 0.35，KH2PO4 0.16，NaHCO3 2.1，葡萄糖1.98)中，剥离附着于其上的脂肪及血管。剪去输精管的一端，用小棉花球轻轻地从末端向开口端压出管内的***，变成一条空心管，然后用零号丝线将其一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O2和5％CO2)的Kreb’s液、恒温36.5±0.5℃的玻璃浴管中，预负荷100mg。前30min每5min换一次营养液，以后每10min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽2ms，频率6次/min，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量***鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。IC50测定方法同GPI实验。
实验结果见表3。表3的数据显示，GPI和MVD标本实验的结果与同位素标记的配体-受体亲和实验结果的趋势一致。GPI标本中主要含有μ-阿片受体，MVD标本中主要含有μ-和δ-阿片受体。在GPI实验中，内***肽-1类似物EM-1-NHOH的阿片生物活性比母体内***肽-1高约4倍左右，内***肽-2类似物EM-2-NHOH的活性也明显高于母体。而且，在MVD实验中，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH的IC50值明显低于母体内***肽。该结果表明，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对离体生物标本具有较高的阿片激动活性。
表3.内***肽-1和-2及对应类似物的GPI/MVD标本阿片活性
3、镇痛与耐受实验
采用昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<3s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室给药后第5,10,15,20,25,30,40and 50min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。利用PE-10插管对小鼠侧脑室埋管，手术后3天给药。根据内***肽及类似物的镇痛活性，确定药物剂量，测定急性镇痛耐受。小鼠提前1小时侧脑室注射药物或生理盐水1次，之后分别注射不同剂量的药物，测定疼痛阈值变化，对内***肽及类似物进行镇痛耐受评估。
镇痛活性实验结果如图1和2所示(其中■表示注射剂量10nmol，●表示注射剂量3nmol，▲表示注射剂量1nmol，▼表示注射剂量0.3nmol，◆表示生理盐水)，通过中枢侧脑室注射0.3-10nmol剂量的内***肽-1类似物EM-1-NHOH和内***肽-2类似物EM-2-NHOH，两个类似物均表现浓度依赖型的高效镇痛效果。最大镇痛效力在注射药物5min后产生，能达到％MPE约80％左右，且镇痛持续时间较长，表明这两个类似物具有高效的中枢镇痛活性。此外，内***肽及类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH的镇痛耐受结果如图3、4、5和6所示，提前1小时侧脑室注射生理盐水，之后侧脑室注射0.3-10nmol剂量的内***肽及类似物均产生显著的镇痛作用。图3中■表示生理盐水+内***肽-1，●表示内***肽-1(10nmol)+内***肽-1；图4中■表示生理盐水+EM-1-NHOH，●表示EM-1-NHOH(10nmol)+EM-1-NHOH；图5中■表示生理盐水+内***肽-2，●表示内***肽-2(10nmol)+内***肽-2；图6中■表示生理盐水+EM-2-NHOH，●表示EM-2-NHOH(10nmol)+EM-1-NHOH。然而，分别提前1小时侧脑室注射内***肽-1或内***肽-2，之后再注射不同剂量的内***肽-1或内***肽-2，其镇痛耐受剂量曲线明显右移，即镇痛效果降低，产生了镇痛耐受。但是，分别提前1小时侧脑室注射类似物EM-1-NHOH或EM-2-NHOH，再注射不同剂量的相应类似物，镇痛耐受剂量曲线则右移不明显，两个类似物的镇痛耐受明显降低。
4、整体血压实验
Wistar大鼠，200-300g，用20％的氨基甲酸乙酯麻醉(l.2g/kg,i.p.)，为了保持麻醉状态良好，可能需要临时补加***物。切开大鼠的气管，清除管内粘液，动物能自主呼吸。PE-50导管***到颈外静脉以备静脉给药，PE-50导管***颈大动脉，并与YP-100压力传感器相连，记录给药后血压的变化。***动脉压和心率数据主要通过成都泰盟BL-420F生物记录***平均化处理获得。药物静脉每次注射100μL，10～15秒内注射完成。
内***肽及类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对大鼠心血管作用的实验结果如图7、8、9和10所示，图7中■表示内***肽-1，表示EM-1-NHOH；图8中■表示内***肽-2，表示EM-2-NHOH；图9中■表示内***肽-1，表示EM-1-NHOH；图10中■表示内***肽-2，表示EM-2-NHOH。静脉注射1-10nmol的内***肽-1和类似物EM-1-NHOH剂量依赖的降低大鼠***动脉压，但是类似物EM-1-NHOH对***动脉压降低的百分率明显低于母体内***肽-1。类似物EM-2-NHOH具有同样的作用效果，即EM-2-NHOH对***动脉压降低的百分率也明显低于内***肽-2。此外，静脉注射1-10nmol的内***肽及类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH剂量依赖的降低大鼠的心率。同样，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对大鼠心率的降低效果显著低于各自的母体。该结果表明，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对心血管***的作用效果明显降低，即具备了较低的心血管副作用的优点。
综上所述，本发明通过对内***肽-1和内***肽-2的第4位苯丙酰胺羟基化修饰，构建一种新型高效的内***肽类似物，目的为了提高内***肽类似物与μ-阿片受体的亲和性与阿片活性，增强类似物的中枢镇痛活性并降低镇痛耐受的不良副作用。通过同位素标记的配体-受体亲和实验，离体GPI/MVD标本阿片活性及在体镇痛与耐受实验，对本发明合成的内***肽类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的内***肽类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH具有比母体更高的μ-阿片受体亲和性，阿片激动活性和中枢镇痛效果，且镇痛耐受的不良副作用明显降低。类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对心血管***的作用效果明显降低，具备了较低的心血管副作用的优点。因此，本发明的内***肽类似物在制备高效、低耐受副作用、低心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的临床应用价值。
Claims (9)
1.4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物，其特征在于该内***肽类似物为内***肽-1类似物，酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：
2.如权利要求1所述的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；
三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-色氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。
3.根据权利要求2所述的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，其特征在于步骤一中洗涤方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。
4.根据权利要求2所述的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，其特征在于步骤三中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。
5.根据权利要求2所述的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，其特征在于步骤四中洗涤的步骤为：用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤。
6.4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物为内***肽-2类似物，酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：
7.根据权利要求6所述的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，其特征在于4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，包括以下步骤：
一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；
二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；
三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；
将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；
过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；
减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；
六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成
将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。
8.根据权利要求6所述的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物的合成方法，其特征在于步骤一中洗涤方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。
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