CN109219347A

CN109219347A - 制剂

Info

Publication number: CN109219347A
Application number: CN201780029270.7A
Authority: CN
Inventors: B.J.穆雷; T.F.威尔; T.W.威尔森; G.J.莫里斯
Original assignee: University of Leeds; Asymptote Ltd
Current assignee: University of Leeds; University of Leeds Innovations Ltd; Asymptote Ltd
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2019-01-15
Also published as: WO2017194954A1; US20190281816A1; JP7262709B2; JP2019515940A; GB201608356D0; EP3454651A1

Abstract

本发明涉及一种在含水量的生物实体的冻结处理过程中促进冰的非自发形成(成核)的制剂，其包含能够用作冰成核剂的框架硅酸盐矿物和铵盐。

Description

制剂

本发明涉及一种在含水量的生物实体的冻结处理过程中促进冰的非自发形成(成核)的制剂，并且涉及其在含水量的生物实体的冻结处理中的用途。

生物材料的保存有两个相关的过程。在冷冻保存中，生物材料被冻结并以冻结状态贮存。在冻结干燥(冻干)中，水从冻结的生物样品中去除，然后以干燥状态贮存。

冷冻保存被广泛用来维持用于医学、生物技术和兽医科学的生物样品的长期活力。为了在解冻后获得高活力，有必要添加保护性化合物(称为防冷冻添加剂或防冻剂)并以受控的速度冷却样品。对于许多细胞类型，有必要通过受控的成核来诱导冰的形成，而不是允许在不受控制的过饱和下自发冰成核。

用于冷冻保存的样品一般放在专门的冷冻容器中，例如以下容器：

•吸管，其为直径2-4 mm，长度至多140 mm，容量0.2 ml-0.5 ml的薄壁管；

•冷冻瓶，其为约12.5 mm直径和0.5 ml-5.0 ml容量的宽短管；

•软袋，其容量为5 ml-1000 ml，用于较大体积的冷冻保存；和

•微量滴定板、矩阵管和其它SBS格式，用于机器人学和高通量筛选。

一系列设备可用于以受控的速度冻结吸管和冷冻瓶。这些可以使用液氮作为冷冻剂，或者通过机械制冷来冷却。此外，存在许多被动冷却装置。这些装置中的一些允许样品内的冰的受控成核，其可手动或自动执行。

在以受控的速度冻结后，样品在低温(通常为液氮的温度(-196℃))下保持冻结。在该温度下，如果细胞在冷却中存活，其活力与储存时间无关。当需要使用时，将样品快速解冻(一般在维持于37℃的水浴中)并除去防冻剂。

冻结干燥(冻干)被广泛应用于生物技术、医学和兽医科学，用于细胞、疫苗、蛋白质和其它生物活性化合物的长期稳定。冻结干燥也用来生成结构化材料，例如应用于再生医学和新型陶瓷生产的支架和基质。在冻结干燥过程中，将含水样品放在专门的容器(通常为玻璃小瓶)中并在冻结干燥机的冷却架上冻结。冻结后，局部气体压力降低，冻结样品内的冰升华。从样品中除去水后，在真空下温热小瓶并密封。样品可在环境温度下分配，并通过加水而重构。

对于冷冻保存样品的受控冰成核，已检查了许多冰成核剂(有时称为冰成核剂(nucleator)、冰成核催化剂、冰成核粒子或冰核)。这些冰成核剂促进了一种称为异质成核的现象。实例包括碘化银晶体、细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、胆固醇晶体和框架硅酸盐类的矿物(见例如WO-A-2014/091216)。将冰成核剂加入样品，所述样品然后冷却。当样品内达到足够水平的过度冷却时，冰成核发生。Zimmerman et al J. Geophys.Res. Atmos., 2008, 113, D23204的一项调查通过长石的冰成核的之前研究已经证明，它们在对于含水量的生物实体的冻结处理足够温暖的温度下不有效地使冰成核。Nedava et al SELSKOKHOZYAISTVENNAYA BIOLOGIYA (Agricultural Biology), 1992, No. 4, 20-24描述了向公羊***的悬浮液中加入细碎的硅石，旨在改善冷冻生物学程序过程中的结果。这样做是为了稳定***细胞的膜，而不是诱导成核。

一般来说，铵盐的可察觉的毒性影响已强烈阻止了它们在冷冻保存中的使用。尽管如此，H T Meryman (1968) Modified Model for the Mechanism of Freezing Injury in Erythrocytes. Nature 218, 333-336显示，与在其它防冻剂例如钠盐的存在下冻结的细胞比较，在高浓度(2M、3M和4M)的作为防冻剂的乙酸铵存在下冻结的红细胞具有显著减少的冻结损伤。这是一种归因于渗透压梯度的物理现象且与成核无关。Meryman称氯化铵作为保护剂是无用的。

对于冰成核剂例如框架硅酸盐类的矿物，有必要加入相对大的量(10 mg)以在低水平(3℃)的过度冷却下实现冰成核。这在处理小样品体积(例如在多孔板格式中冷冻保存期间使用的那些，其中体积可以是50µL-200 µL (96孔多孔板)或10µL (384孔多孔板))时受到限制。此外，即使用接近熔点的冰成核，观察到冷冻保存后许多细胞类型的活力和细胞恢复率可能令人失望地低。一般在冻结后立即观察到细胞活力(如通过染料排除分析法测定的)是高的(95%)，但这在细胞孵育24小时后可能下降到低于50%。一种类似的模式可以用细胞数密度观察到，在解冻后培养过程中随着细胞溶解，在孵育后细胞数密度可减少50%。得到的细胞恢复率(细胞活力 x细胞数密度)可能是原始未冻结对照值的25%。这种细胞恢复率的损失可能限制冻结和解冻的样品在应用诸如高通量筛选和再生医学中的效用。

大气体(atmospheric community)的范例是：任何溶质的身份对于异质冰成核是不重要的，且除了溶质的依数作用外，没有其它作用。例如，Zobrist et al J. Phys.Chem. A 2008, 112, 3965-3975声称，对于悬浮在各种水性溶液中的十九烷醇、无定形硅石、碘化银和亚利桑那试验粉尘(Arizona test dust)的异质冰成核温度可各自通过单线描述，而不管溶质的性质如何。Knopf et al Faraday Discuss., 2013, 165, 513声称，当使用悬浮在各种水性溶液中的各种冰成核剂时，沉浸冻结温度和动力学可仅用温度和溶液水活度来描述。然而，情况并不总是这样。Gobinathan et al Mat. Res. Bull., Vol 16,1527-1533报道，在某些盐的存在下，碘化铅在温度较高时使冰成核。Salem et al Atmos.Chem. Phys. 7, 3923-3931, 2007使粘土矿物暴露在氨气中，并发现，“处理过的”粘土(蒙脱石)更好地使冰成核。Rieschel和Vali, Tellus, 27(4), 414 (1975)报道，当加入铵盐时，对于落叶(leaf litter)中的材料的成核温度通常降低，而在添加铵盐后，对于粘土的成核温度通常升高。Abbatt et al Science, 22 Sep 2006: Vol. 313, Issue 5794, pp.1770-1773表明，固体硫酸铵晶体在水饱和度以下可以使冰成核。

本发明基于这样的认识，即在(例如)含水量的生物实体的冻结处理过程中，通过加入至含水产物的框架硅酸盐矿物作为冰成核剂，铵盐的存在导致冰形成功效的意想不到的增强。

因此，从第一个方面来看，本发明提供一种在含水量的生物实体的冻结处理过程中促进冰的非自发形成的制剂，其包含：

能够用作冰成核剂的框架硅酸盐矿物；和

铵盐。

通过促进冰的非自发形成，所述制剂有利地提供一种控制冰成核的更大元素，这然后有助于保持生物实体的完整性。这在过程例如冷冻保存或冻结干燥中可能是有用的。可以对冰晶的数量和大小施加控制元素，并(例如)允许冰晶的数量增加，导致较小的冰晶。

通过用作冰成核剂，框架硅酸盐矿物促成异质成核。

在优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是多元素的。框架硅酸盐矿物可具有至少两个(如一对)选自1A或2A族(如选自K、Ca和Na)的元素。一个或多个选自1A或2A族的元素可被铵离子进行离子取代。

框架硅酸盐矿物可通过处理(如精炼或汰选)矿物来源(如岩石、宝石或矿石)，通过(例如)一种或多种物理(如机械)处理例如粉碎和重力、磁或电分离或通过化学处理获得。框架硅酸盐矿物可能是一种为商业级或工业级的精矿。框架硅酸盐也可合成。

框架硅酸盐矿物的一般特点是某种晶体结构占优势。框架硅酸盐矿物中可能存在微量的其它物质(如微量矿物，如粘土或方解石，或微量非矿物)，其对于矿物来源可能是内成的。

优选地，框架硅酸盐矿物选自长石、硅石(如石英、鳞石英、方石英、玉髓或碧玉)、霞石、透锂长石、白榴石、方钠石、钙霞石(如钙霞石-硫酸钙霞石)、方柱石、方沸石和沸石。

在优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是框架铝硅酸盐。

在优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是硅石(如石英)。

在优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是长石或似长石。在一个特别优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是长石。

长石可以是CaAl₂Si₂O₈、NaAlSi₃O₈和KAlSi₃O₈的三元固溶体(或基本上由其组成)。

在一个特别优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是NaAlSi₃O₈和KAlSi₃O₈占优势的长石(即Na和K阳离子占优势——一种碱性长石)。碱性长石可选自正长石、透长石、微斜长石和歪长石。

在一个更优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是KAlSi₃O₈占优势的长石(即K阳离子占优势——钾长石或K-spar)。微斜长石是优选的。

在一个特别优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是CaAl₂Si₂O₈和NaAlSi₃O₈占优势的长石(即Ca和Na阳离子占优势——一种斜长石)。斜长石可选自钠长石、奥长石、中长石、拉长石、倍长石和钙长石。

在一个更优选的实施方案中，框架硅酸盐矿物是NaAlSi₃O₈占优势(即Na阳离子占优势)的长石。

框架硅酸盐矿物可以是微粒。框架硅酸盐矿物的平均粒径可以是亚微米或在1-5µm范围内。框架硅酸盐矿物可以是纳米微粒。框架硅酸盐矿物可以是粉末。

框架硅酸盐矿物可以呈离散的形式。离散的形式可以是任选结合膜的颗粒、珠粒、片或碎片或粉末。珠粒通常具有毫米的尺寸。

典型地，所述制剂是水性制剂。制剂可以是溶液、悬浮液、分散液、乳液或胶体。

优选地，所述制剂在生物学(如生理学)上是可以容忍的。特别优选地，所述制剂是细胞可以容忍的。

所述制剂可以是细胞内、细胞间或细胞外液体模拟物。

框架硅酸盐矿物可以每等分试样的含水量超过3 x10^-6 cm²的表面积的量存在于制剂中。

优选地，框架硅酸盐矿物以每等分试样1x10^-5-400 cm²范围的表面积的量，特别优选以每等分试样1x10^-3-400 cm²范围的表面积的量，更优选每等分试样1-400 cm²范围的量存在于制剂中。

优选地，所述制剂还包含一种或多种防冻剂。

一种或多种防冻剂可选自二甲亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、糖(如海藻糖、蔗糖、棉子糖或葡萄糖)、聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮或聚丙二醇)或葡聚糖。

一种优选的防冻剂以存在多个羟基为特征(如糖或多元醇)。

优选铵盐是氯化铵、硫酸铵、碘化铵、乙酸铵或氢氧化铵。

特别优选铵盐是氯化铵。

优选地，铵盐的浓度是在1 x 10^-5-10 M范围内，特别优选在10-350 mM范围内，更优选在50-300mM范围内，还更优选在100-200mM范围内(如约150mM)。

所述制剂还可包含以微量加入的矿物添加剂或非矿物添加剂。矿物添加剂可以是如上定义的框架硅酸盐矿物。

通过促进冰的非自发形成，本发明的制剂使含水量在降低的过度冷却下冻结。在优选的实施方案中，所述制剂使含水量在10℃或更低，优选8℃或更低，更优选6℃或更低的过度冷却下冻结。

过度冷却(也称为过冷)是持续处于熔点以下的液体的温度。例如在-5℃，水会过冷5℃，而10%的甘油溶液(熔点-2℃)会过冷3℃。

从进一步的方面来看，本发明提供如上定义的制剂在容器中冻结处理含水量的生物实体的用途。

含水量可以是生物实体的溶液、悬浮液、分散液、乳液或胶体。

生物实体通常为随着时间的推移和/或在环境刺激(如物理刺激例如热，或化学刺激例如酶)的存在下具有失去完整性的倾向的生物实体。

生物实体可源自植物或动物(如源自哺乳动物，例如人)。

生物实体可以是天然食物，例如水果、坚果、草本或种子(如咖啡)。

优选地，生物实体是细胞或细胞聚集体(如微生物(microorganism)、微生物(microbe)、单细胞生物、组织、器官或多细胞生物)。

举个例子，所述细胞可以是干细胞、***、***细胞或胚细胞。

举个例子，所述组织可以是皮肤、肿瘤、胚胎、睾丸或卵巢。

生物实体可以是蛋白质、酶、疫苗、细菌、病毒、原生生物、原生动物、寄生虫、孢子、种子或真菌。

容器可以是样品容器或冷冻容器，例如吸管、冷冻瓶、袋、微量滴定板或混合室。含水量的生物实体可加入到制剂中。例如，细胞悬浮液可加入到制剂中或细胞可被离心并再次悬浮于制剂中。

在冻结处理过程中，容器可浮在冷冻剂(通常为液氮)上或浸没在其中。或者，冻结处理可通过机械制冷(如在冻结干燥器或热交换器中)或通过可以是基于液氮的控制速率制冷器进行。

冻结处理可进行至低于-130℃的温度，优选至低于-150℃的温度，特别优选至约-196℃的温度。

冻结处理可递增(如逐步或持续)执行。典型地，冻结处理以范围1-2℃/min的速率持续执行。

冻结处理可包括：使含水量的生物实体脱水。脱水的步骤可通过升华进行。升华可通过对容器施加减压(如部分真空)引起。

现在将参考以下实施例和附图，仅以示例的方式描述本发明的实施方案，其中：

图1显示在实施例1中测试的各种冰成核剂的液滴分数的温度依赖性；

图2显示在实施例2中测定的细胞活力；和

图3显示在实施例2中测定的细胞密度。

实施例1 在铵盐的存在下用长石提高冰成核

在浸泡粒子仪器中，以μL-成核规模执行实验，其详细描述于Whale et al (2015)Technique for Quantifying Heterogeneous Ice Nucleation in Microlitre Supercooled Water Droplets. Atmos. Meas. Tech. 8, 2437−2447。这种仪器测定1 μL体积约50个液滴的冻结温度。在这些实验中，使框架硅酸盐(IceStart^TM (Asymptote Ltd))的0.1 wt%悬浮液在纯水中和在氯化铵、硫酸铵和氢氧化铵的0.07 M溶液中冻结。结果示于图1中，从图中可以看出铵化合物降低过度冷却约2.5℃。

实施例2 用本发明的制剂冷冻保存包封的肝细胞后的活力和细胞数

细胞培养和包封

HepG2细胞按单层培养。在达到80-90%汇合时，使细胞传代。含2%藻酸盐(Manugel, FMCbio-polymers)的水性溶液在含4百万个细胞/ml的培养基中按1:1的比例混合。使这种混合物通过Genialab Jetcutter封装***以产生半径500μm的球形液滴，其在0.204M CaCl₂溶液中聚合。这产生了具有分布在内部的单个细胞的球体。将所述球体按1:32的球体:培养基比例加入到在T175烧瓶中的改良α-MEM的温热培养物中，所述改良α-MEM补充有50 U/ml青霉素、50 μg/ml链霉素(Invitrogen plc)、1M 0.5% CaCl₂ (v/v)和10%人血浆。将这些在加湿孵化器中，于37℃、5% CO₂中培养。每2-3天更换100%培养基。

冷冻保存

冷冻保存通过将球体冷却至4℃并与以下预冷却的溶液按1:1比例混合来执行：

24%二甲亚砜(DMSO)，在含0.2wt%长石作为成核剂的Viaspan溶液中(DMSO + Nuc)

24% DMSO，在Viaspan溶液(v/v)中(DMSO – Nuc)

24% DMSO，在含0.2wt%长石作为成核剂的300 mM氯化铵(v/v)中(NH ₄ Cl + Nuc)

24% DMSO，在300 mM氯化铵(v/v)中(NH ₄ Cl – Nuc)

使溶液平衡5分钟。此后，每个条件下将1ml上清液加入到5 x 1.8ml冷冻瓶中，然后将其在EF600控制速率制冷器中，以0.3℃/min从4℃冷却至-100℃。冷却运行完成后，将冷冻瓶转移至液氮贮存。

温热方案

将样品从液氮贮存中取出并于37℃水浴中解冻，直至最后的冰晶刚好融化。这花费了330秒。使用冷却至4℃的培养基，以逐步的方式洗去防冻剂。洗去防冻剂后，加入升温至37℃的培养基并将ELS于37℃、5% CO₂的加湿孵化器中放置培养。

解冻后的功能评估

活力

在指定时间点，从培养物中移出ELS并用20μl碘化丙锭溶液(PI, 1 mg/ml, Sigma)和10μl二乙酸荧光素溶液(FDA，1 mg/ml, Sigma)染色，以在荧光显微镜下观察。因为PI染色具有非功能性膜的细胞的核，因此它是死细胞的指示物。FDA染色代谢活性细胞。通过使用校准的宏比较PI和FDA发射的强度，可测定活力。结果示于图2。

细胞计数

总细胞数使用核计数器***测定。使用16mM EDTA溶液(Applichem)，从藻酸盐中释出ELS，然后在PBS中洗涤和解聚。在溶液中溶解所有细胞并用PI染色核。这种溶液被抽吸到核计数盒(nucleocassette)中并对染色的核计数。因为HepG2细胞是单核的，因此这可被转化为ELS中的细胞密度。结果示于图3。

Claims

1. 一种在含水量的生物实体的冻结处理过程中促进冰的非自发形成的制剂，其包含：

能够用作冰成核剂的框架硅酸盐矿物；和

铵盐。

2.权利要求1的制剂，其中框架硅酸盐矿物是多元素的。

3.权利要求2的制剂，其中框架硅酸盐矿物是框架铝硅酸盐。

4.权利要求2或3的任一项的制剂，其中框架硅酸盐矿物是长石。

5.权利要求4的制剂，其中框架硅酸盐矿物是NaAlSi₃O₈和KAlSi₃O₈占优势的长石。

6.权利要求4或5的制剂，其中框架硅酸盐矿物是KAlSi₃O₈占优势的长石。

7. 前述权利要求的任一项的制剂，其中铵盐的浓度是在1 x 10^-5-10 M的范围内。

8.前述权利要求的任一项的制剂，其在使用中导致含水量在8℃或更低的过度冷却下冻结。

9.前述权利要求的任一项的制剂，其还包含一种或多种防冻剂。

10.权利要求9的制剂，其中每种防冻剂以多个羟基的存在为特征。

11.前述权利要求的任一项的制剂，其在生物学上是可以容忍的。

12.任一项前述权利要求定义的制剂在容器中冻结处理含水量的生物实体的用途。

13.权利要求12的用途，其中生物实体是细胞或细胞聚集体。