CN109207557A - 一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法 - Google Patents
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Abstract
一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法，包括：DNA片段化；末端修复；用磁珠纯化末端修复产物，并保留磁珠在体系中；接头连接；用磁珠纯化接头连接产物两次，并去除磁珠；以纯化的接头连接产物为模板，进行PCR扩增；用磁珠筛选第一次PCR扩增产物；将片段筛选的产物与芯片进行杂交；用磁珠对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其它杂质；以洗脱后的带磁珠的DNA为模板进行PCR扩增，以进一步放大目的基因信号；用磁珠纯化第二次PCR扩增产物两次。本发明的方法可同时检测SNV、Indel、融合和CNV四种突变类型样本，建库起始量降低至100ng以下，可以满足绝大多数穿刺样本的检测。
Description
技术领域
本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法。
背景技术
穿刺活检是骨与软组织肿瘤获取组织病理诊断的主要方法，通过特殊的穿刺针穿刺或抽吸活组织检查***、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏等抽取组织标本。检验穿刺样本的相关现有技术主要有：Ion Ampliseq技术和常规捕获建库。
Ion Ampliseq技术，通过多重PCR获得目的基因片段，然后进行接头连接、预-PCR(pre-PCR)等操作。Ion Ampliseq技术可分为Ampliseq DNA和Ampliseq RNA两种，AmpliseqDNA主要针对单核苷酸变异(SNV)和***删除(Indel)两种突变类型；Ampliseq RNA主要针对融合(Fusion)突变类型。Ion Ampliseq技术通过超高多重PCR扩增，可将建库起始量降低至10ng，但该方法需要分别提取DNA和RNA，然后分别建库才能将一个样本的SNV、Indel和Fusion三种突变类型样本检测完。
常规捕获建库，通过对DNA进行片段化并纯化，然后进行末端修复和纯化、接头连接和纯化、预-PCR(pre-PCR)和纯化、杂交和洗脱、后-PCR(post-PCR)和纯化等步骤。常规捕获建库技术可同时检测SNV、Indel、Fusion和基因拷贝数变异(CNV)四种突变类型样本，但建库起始量要求高，因为常规捕获建库技术中需要针对每一步反应进行纯化，每增加一步纯化就会损失大量的DNA信息，从而导致传统的针对肿瘤组织的建库方法需要有很高的建库起始量。小样本(如穿刺样本)在临床肿瘤组织样本中占很高比例，但小样本由于组织量少，很难从中获得高于500ng的DNA，因此常规捕获建库技术无法对穿刺样本检测。
发明内容
本发明提供一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法，可同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本，建库起始量降低至100ng以下，可以满足绝大多数穿刺样本的检测。
根据本发明的一种实施例中提供一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法，包括如下步骤：
(1)DNA片段化：将提取的DNA打断成片段；
(2)末端修复：将打断的DNA片段加入到末端修复反应液中，进行孵育；
(3)第一次纯化：用磁珠纯化末端修复产物，并保留磁珠在体系中；
(4)接头连接：将纯化后的末端修复产物连同磁珠一起加入到连接反应液中，同时加入接头，进行孵育；
(5)第二次纯化：用磁珠纯化接头连接产物两次，并去除磁珠；
(6)第一次PCR扩增：以纯化的接头连接产物为模板，进行PCR扩增；
(7)片段筛选：用磁珠筛选第一次PCR扩增产物；
(8)杂交：将片段筛选的第一次PCR扩增产物与芯片进行杂交；
(9)捕获和洗脱：用磁珠对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其它杂质；
(10)第二次PCR扩增：以洗脱后的带磁珠的DNA为模板进行PCR扩增，以进一步放大目的基因信号；
(11)第三次纯化：用磁珠纯化第二次PCR扩增产物两次。
进一步地，上述步骤(1)中DNA来源于肿瘤穿刺样本。
进一步地，上述步骤(1)中DNA的量是10ng至100ng。
进一步地，上述步骤(1)中DNA打断成大小为200bp左右的片段。
进一步地，上述步骤(3)中用1.8倍AMPure XP磁珠纯化末端修复产物。
进一步地，上述步骤(5)中用1.2倍AMPure XP磁珠纯化接头连接产物。
进一步地，上述步骤(7)中分别用0.8倍和0.2倍AMPure XP磁珠筛选第一次PCR扩增产物。
进一步地，上述步骤(8)中第一次PCR扩增产物与芯片进行杂交之前，按每张芯片杂交800ng的DNA总量计算，将4-8个样本按比例混合成一个文库。
进一步地，上述步骤(9)中用链霉亲和素磁珠对杂交产物进行捕获。
进一步地，上述步骤(11)中用1.5倍AMPure XP磁珠纯化第二次PCR扩增产物。
本发明的建库方法是基于捕获建库建立的检测方法。相较于其他建库方法，具有以下优势：
(1)低起始量，针对传统的杂交捕获法的文库构建，本发明通过对技术体系的优化，使得整个文库构建体系能适用于小样本量(≤100ng)的穿刺样本的临床检测；具体地，技术体系优化包括：(a)DNA被打断后直接进行末端修复，经过AMPure XP磁珠纯化后，将带着磁珠的DNA直接进行接头连接反应，既能保证连接反应的效率，也能避免纯化造成的DNA损失。(b)在接头连接的过程中，将接头的3’端单链补齐成双链，然后与末端修复产物进行平末端连接，这样可以缩短PCR反应时间，提高PCR扩增效率。
(2)变异类型检测种类多，使用芯片捕获技术，可同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型。
(3)灵敏度高，相对于Ion Ampliseq技术，本发明在SNV、InDel的检测突变频率可低至1％，在Fusion、CNV的检测突变频率可低至10％。
(4)应用较广泛，通过杂交不同的芯片，可适用于各种肿瘤组织样本的检测。
(5)建库时间短，本发明相对于常规捕获建库流程，步骤更简洁，建库时间更短。
附图说明
图1为本发明的一个实施例的建库方法流程图；
图2本发明实施例中Agilent 2100定量结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
如图1所示，在本发明的一种实施例中，适用于下一代测序平台的低起始量建库方法，包括如下步骤：
(1)DNA提取：例如，利用QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒从***固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE)样本中提取DNA。DNA可以来源于肿瘤穿刺样本。
(2)DNA片段化：将提取的DNA打断成片段。例如，取10ng至100ng DNA稀释成50μL体积，然后利用超声破碎仪将DNA打断成大小为200bp左右(例如，100-300bp、150-250bp、180-220bp或190-210bp)的片段。
(3)末端修复：将打断的DNA片段加入到末端修复反应液中，进行孵育，例如，在20℃孵育30min。
(4)第一次纯化：用磁珠(例如，1.8倍AMPure XP磁珠)纯化末端修复产物一次，并保留磁珠在体系中。
(5)接头连接：将纯化后的末端修复产物连同磁珠一起加入到连接反应液中，同时加入接头(例如，A接头和P接头)，吹打混匀后，进行孵育，例如，在20℃孵育30min。
(6)第二次纯化：用磁珠(例如，1.2倍AMPure XP磁珠)纯化接头连接产物两次，并去除磁珠。
(7)第一次PCR(Pre-PCR)扩增：以纯化的接头连接产物为模板，进行PCR扩增。
(8)片段筛选：用磁珠(例如，分别用0.8倍和0.2倍AMPure XP磁珠)筛选第一次PCR扩增产物。
(9)杂交：将片段筛选的第一次PCR扩增产物与芯片进行杂交。例如，按每张芯片杂交800ng DNA总量计算，将4-8个样本按比例混合(pooling)成一个文库，然后与芯片进行杂交。
(10)捕获和洗脱：用磁珠(例如，M-280链霉亲和素磁珠)对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其它杂质。
(11)第二次PCR(Post-PCR)扩增：以洗脱后的带磁珠的DNA为模板进行PCR扩增，以进一步放大目的基因信号。
(12)第三次纯化：用磁珠(例如，1.5倍AMPure XP磁珠)纯化第二次PCR扩增产物两次。
(13)文库质控：例如，用qubit/qPCR及Agilent 2100对文库进行核酸定量与片段大小质控。
(14)上机测序：对质控合格的文库进行上机测序。
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例一
选取10例上肺腺癌患者的FFPE样本，首先利用FFPE样本DNA提取试剂盒提取总DNA，然后通过本发明的文库构建方法构建文库。
1.文库构建
1.1DNA片段化：用无核酸酶的水(Nuclease-free water)将100ng的DNA稀释到50μL，混匀后，用超声破碎仪将DNA打断至200bp左右的片段。
如使用Covaris S220打断样本，打断条件如下：Peak Incident Power(w)：175；Duty Factor：10％；Treatment Time(s)：170。
如使用Bioruptor打断仪，则按如下条件进行：开30s，关30s，6个开关循环；重复打断3次。
需要注意的是：每次打断完，将样本从仪器中取出，涡旋振荡10s混匀瞬离，冰浴3min再进行下一次打断。
将打断好的样本转移到干净的EP管中。
1.2末端修复：将打断后的片段化DNA加入到末端修复反应液中，配置成表1所示的配制末端修复反应体系，在20℃孵育30min，然后用1.8倍AMPure XP磁珠纯化末端修复产物一次，最后洗脱DNA，不去磁珠。
表1
1.3接头连接：在纯化后的DNA溶液中加入连接反应液和接头(A接头和P接头)，配置成表2所示的连接反应体系，在20℃孵育30min。
表2
A-X-接头与P-接头，具体序列如下表3(其中*表示前面碱基的硫代修饰)：
表3
1.4接头连接产物的纯化：用1.2倍AMPure XP磁珠纯化接头连接产物1次，洗脱DNA时不去磁珠，然后加入1.2倍的20％PEG溶液再纯化连接产物1次。具体包括：
1.4.1使用前将PEG溶液置于室温下平衡30min；
1.4.2将装有50μL接头连接后的DNA的EP管瞬时离心后，加入1.2倍体积的PEG溶液，用移液器吹打10次混匀；
1.4.3室温下静置6min使磁珠与DNA充分结合，然后瞬时离心3s；
1.4.4将EP管放到磁力架上至液体澄清；
1.4.5用移液器小心去除上清(注意不要吸到磁珠)；
1.4.6保持EP管在磁力架上，加入400μL 80％的乙醇，转管两周洗涤磁珠表面，以除去盐离子以及未吸附的DNA等；
1.4.7静置，待溶液澄清后除去乙醇；
1.4.8重复步骤1.4.6至步骤1.4.7；
1.4.9稍微离心后上磁力架1min，尽量完全去除乙醇，并将磁珠开盖置于磁力架上，至磁珠表面没有光泽；
1.4.10加入50μL洗脱缓冲液，轻轻将磁珠从管壁冲洗下来并吹打10次混匀，进入下一步骤。
1.4.11重复步骤1.4.1至步骤1.4.10；
1.4.12室温静置10min以使DNA从磁珠上完全洗脱下来；
1.4.13将EP管放到磁力架上至液体澄清，将33μL洗脱下来的DNA转入一个新的EP管中。
1.5Pre-PCR：以纯化的连接产物为模板，配置如下表4所示的PCR反应体系，扩增12个循环，PCR程序为：98℃45s；(98℃15s，65℃30s，72℃30s)11个循环；72℃5min，4℃∞。
表4
A引物与P1引物的具体序列如下表5所示：
表5
1.6片段筛选：先用0.8倍AMPure XP磁珠纯化PCR产物，去磁珠(磁珠吸附大片段)，留上清液；然后往上清液中加0.2倍AMPure XP磁珠(5倍体积浓缩)。具体步骤包括：
1.6.1使用前将磁珠置于室温下平衡30min；
1.6.2将100μL Pre-PCR反应后的DNA转入1.5mL的EP管中，加入0.8倍体积的磁珠，用移液器吹打10次混匀；
1.6.3室温下静置6min，使磁珠与DNA充分结合，然后瞬时离心3秒；
1.6.4将EP管放到磁力架上至液体澄清；
1.6.5用移液器小心转移上清至新的1.5mL的EP管中(注意不要吸到磁珠)；
1.6.6往步骤1.6.5中装有上清的EP管中加入0.2倍磁珠(浓缩5倍)，用移液器吹打10次混匀；
1.6.7室温下静置8min使磁珠与DNA充分结合，然后瞬时离心3秒；
1.6.8将EP管放到磁力架上至液体澄清；
1.6.9保持EP管在磁力架上，加入400μL 80％的乙醇，转管两周洗涤磁珠表面，以除去盐离子以及未吸附的DNA等；
1.6.10静置，待溶液澄清后除去乙醇；
1.6.11重复步骤1.6.9至步骤1.6.10；
1.6.12稍微离心后上磁力架1min，尽量完全去除乙醇，并将磁珠开盖置于磁力架上，至磁珠表面没有光泽；
1.6.13加入33μL无核酸酶的水，轻轻将磁珠从管壁冲洗下来并吹打10次混匀；
1.6.14室温静置10min以使DNA完全从磁珠上洗脱下来；
1.6.15将EP管放到磁力架上至液体澄清，将30μL洗脱下来的DNA转入一个新的EP管中；
1.6.16利用Qubit HS对Pre-PCR产物进行DNA定量。
1.7杂交：每张芯片(芯片由Aglient公司设计合成，其实质为带有生物素标记的RNA探针集，该芯片覆盖ALK、BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、PIK3CA、DDR2、ERBB2、RET、ROS1、MET等肺癌相关基因热点突变)对应DNA杂交总量为800ng，分别将每5个样本的Pre-PCR纯化产物按1:1比例混合成一个文库，在相应的杂交反应液中，65℃孵育24h。具体包括如下步骤：
1.7.1根据数据需要按比例将不同标签序列的样本混合成一个文库，总量为800ng，震荡混匀，瞬时离心；
1.7.2打开管盖，用封口膜将管口封闭，取干净10μL枪头在封口膜上戳若干小洞，置于真空浓缩仪中旋转蒸干，温度设置为45℃；
1.7.3在离心管中按照表6配制用于富集目的片段的样品文库体系：
表6
注：Ion Xpress_A_X block(500μM)按照混合时混合样本的标签序列，取对应的A_block各0.5μL混合，再加入0.6μL的A_block混合液。
将反应体系全部转入一个新的PCR管中，按照表7反应条件进行预杂交：
表7
1.7.4在一个新的1.5ml离心管中按照表8配制杂交缓冲液反应体系：
表8
根据样品反应个数，按每个反应13μL的量分别加入到PCR管中，盖好管盖，然后将其放入PCR仪中，65℃孵育至少2min，确认体系中没有晶体沉淀才能使用。
1.7.5在一个新的PCR管中按照表9配制寡核苷酸文库混合物(Oligo LibraryMix)：
表9
将反应体系放入PCR仪中65℃孵育2min。
1.7.6保持各反应体系于65℃，揭开样品文库管和杂交缓冲液管的管盖，迅速把13μL的杂交缓冲液转移到样品文库管中，孵育至少5min。
1.7.7保持各反应体系于65℃，揭开寡核苷酸文库混合物管盖，迅速将样品文库管中的所有反应体系全部转移到寡核苷酸文库混合物管中，用移液器吹打混匀。
1.7.8确保杂交反应液全部聚集在管底，此时的杂交混合液约29μL。
1.7.9保持PCR管于65℃(PCR仪热盖设为105℃)杂交24小时。
1.8杂交后洗脱：利用M-280链霉亲和素磁珠对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去掉非捕获目的基因和其它杂质。具体包括如下步骤：
1.8.1提前将恒温混合器调至65℃，每个杂交反应准备1.8mL Wash Buffer#2进行预热；
1.8.2提前从冰箱中拿出链霉素磁珠并涡旋混匀，室温平衡30min；
1.8.3每个杂交反应取50μL Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠于一新的1.5ml离心管；
1.8.4取200μL结合缓冲液(Binding buffer)加入磁珠中，用漩涡混合仪剧烈振荡5秒钟重悬磁珠；
1.8.5将离心管置于磁力架上2min，待液体完全澄清；小心吸取并弃去上清；
1.8.6重复步骤1.8.4至1.8.5两次，总共洗三次。
1.8.7加入200μL结合缓冲液(Binding buffer)重悬磁珠；
1.8.8捕获DNA的洗涤与洗脱：经24小时孵育后，取出杂交液，测量杂交体积，若蒸发体积超过8μL则认为杂交实验失败；
1.8.9将全部杂交混合液转移到准备好的磁珠中，反复吹打混匀，使用封口膜封闭管口；
1.8.10将装有杂交混合液和磁珠的离心管在垂直混匀仪上旋转混匀，室温下混匀至少45min；
1.8.11将样品从混匀装置取下，去掉封口膜，瞬时离心5s确保管盖上没有液体残留；
1.8.12将1.5ml离心管转移放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；
1.8.13用500μL洗涤缓冲液(Wash Buffer)#1重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5秒混匀样品，室温下孵育样品15min；
1.8.14将离心管瞬时离心3s，然后放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；
1.8.15用500μL 65℃预热的洗涤缓冲液(Wash Buffer)#2重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5秒以混匀样品，将其置于恒温混合器中65℃孵育10min；
1.8.16颠倒离心管以混匀样品，瞬时离心3s，然后将其放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；
1.8.17重复步骤1.8.15到步骤1.8.16两次，共洗涤三次；
1.8.18用38μL无核酸酶的水重悬磁珠。
1.9Post-PCR：
1.9.1以带M-280链霉亲和素磁珠的DNA杂交产物为模板，配置如下表10的反应体系，进行PCR扩增，相应条件下扩增10个循环。
表10
1.9.2置于PCR仪中按照下列程序反应：98℃45s；(98℃15s，65℃30s，72℃30s)10个循环；72℃1min；4℃∞。
1.9.3PCR结束后，使用Qubit HS Kit定量PCR产物，若PCR产物浓度低于1.6ng/μL，则对低于此浓度的文库增加一个PCR循环，程序如下：98℃45s；(98℃15s，65℃30s，72℃30s)1个循环；72℃1min；4℃∞。
1.10Post-PCR产物的纯化：
1.10.1使用前将磁珠置于室温下平衡30min；
1.10.2将100μL Post-PCR反应后的DNA转入1.5mL的EP管中，加入1.5倍体积的磁珠(150μL)，用移液器吹打10次混匀；
1.10.3室温下静置10min使磁珠与DNA充分结合，然后瞬时离心3秒；
1.10.4将EP管放到磁力架上至液体澄清；
1.10.5用移液器小心的去除上清(注意不要吸到磁珠)；
1.10.6保持EP管在磁力架上，加入400μL 80％的乙醇，转管两周洗涤磁珠表面，以除去盐离子以及未吸附的DNA等；
1.10.7静置，待溶液澄清后除去乙醇；
1.10.8重复步骤1.10.6至1.10.7；
1.10.9稍微离心后上磁力架1min，尽量完全去除乙醇，并将磁珠开盖置于磁力架上，至磁珠表面没有光泽(约10分钟)；
1.10.10加入52μL无核酸酶的水，轻轻将磁珠从管壁冲洗下来并吹打10次混匀；
1.10.11室温静置10min以使DNA完全从磁珠上洗脱下来；
1.10.12将EP管放到磁力架上至液体澄清，将50μL洗脱下来的DNA转入一个新的EP管中；
1.10.13Post-PCR产物的二次纯化：使用前将磁珠置于室温下平衡30min；
1.10.14将装有50μL PCR第一次纯化后的DNA的EP管离心后，加入1.5倍体积的磁珠，用移液器吹打10次混匀；
1.10.15室温下静置10min使磁珠与DNA充分结合，然后瞬时离心3秒；
1.10.16将EP管放到磁力架上至液体澄清；
1.10.17用移液器小心的去除上清(注意不要吸到磁珠)；
1.10.18保持EP管在磁力架上，加入400μL 80％的乙醇，转管两周洗涤磁珠表面，以除去盐离子以及未吸附的DNA等；
1.10.19静置，待溶液澄清后除去乙醇；
1.10.20重复步骤1.10.18至1.10.19；
1.10.21稍微离心后上磁力架1min，尽量完全去除乙醇，并将磁珠置于开盖置于磁力架上，至磁珠表面没有光泽(约10分钟)；
1.10.22加入33μL无核酸酶的水，轻轻将磁珠从管壁冲洗下来并吹打10次混匀；
1.10.23室温静置10min以使DNA完全从磁珠上洗脱下来；
1.10.24将EP管放到磁力架上至液体澄清，将31μL洗脱下来的DNA转入一个新的EP管中。
1.11文库质控：用Qubit仪器测定文库浓度，然后用Aglient2100仪器测定文库浓度和片段大小，比对Qubit仪器与Aglient2100测定的文库的浓度值是否一致。具体包括如下步骤：
1.11.1Qubit HS定量：取1μL文库使用dsDNA HS Assay Kit定量，记录文库浓度；
1.11.2Agilent 2100定量：取1μL文库使用Agilent 2100high sensitivity DNAKit检测文库大小和浓度；
1.11.3文库检测后，要求文库DNA的主峰范围在200bp-400bp之间，主带集中在200-300bp，呈良好的单峰状态，没有小于100bp的引物污染，结果如图2所示。
2.上机测序
2.1乳液PCR扩增：
根据文库定量结果，按每个运行(run)上样5-10pM计算，将文库按等比例混合在一起(每个run可以测≤16例样本)；然后以混合后的文库为模板进行乳液PCR。
2.2上机测序：乳液PCR结束后，按照BGISEQ-100操作说明书进行PCR反应液的纯化和上机测序。
3.测序质控数据
从测序质控数据(表11)看，文库的捕获效率能够达到30％以上，平均测序深度可达400X以上，覆盖率98％以上，重复率基本在65％以下。由于FFPE样本质量参差不齐，会导致质控数据有一定波动性，但这些测序质控数据均能满足信息分析的要求。
表11
4.突变基因检测结果分析
从检测结果(表12)看，本发明的低起始量建库方法与常规建库方法的检测结果一致性为100％，本发明在将建库起始量降低到100ng以下时，依然能够很好的同时检测出SNV、INdel、Fusion、CNV四种突变基因，并且对SNV、Indel的最低检测限能够达到3％以下，说明本方法能够很好的应用于临床肿瘤组织小样本(如穿刺样本)的检测。
表12
实施例二
利用肿瘤细胞系DNA和YH DNA模拟制备突变频率为3％的阳性标准品，以该标准品为样本评估该体系针对50ng样本起始建库的性能。建库方法同实施例一。测试结果如下表13、表14所示，从测序质控数据(表13)看，文库的捕获效率能够达到25％以上，平均测序深度可达300X以上，覆盖率98％以上，重复率基本在50％以下。从检测结果(表14)来看，50ng起始建库能够检测肿瘤组织样本中突变频率在3％以上的突变。
表13
表14
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因股份有限公司,广州华大基因医学检验所有限公司
<120> 一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法
<130> 17I24114
<160> 52
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
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<213> 人工序列
<400> 1
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atcgtccgtt agactgagtc ggagacacgc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ccactacgcc tccgctttcc tctctatg 28
Claims (10)
1.一种适用于下一代测序平台的低起始量建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）DNA片段化：将提取的DNA打断成片段；
（2）末端修复：将打断的DNA片段加入到末端修复反应液中，进行孵育；
（3）第一次纯化：用磁珠纯化末端修复产物，并保留磁珠在体系中；
（4）接头连接：将纯化后的末端修复产物连同磁珠一起加入到连接反应液中，同时加入接头，进行孵育；
（5）第二次纯化：用磁珠纯化接头连接产物两次，并去除磁珠；
（6）第一次PCR扩增：以纯化的接头连接产物为模板，进行PCR扩增；
（7）片段筛选：用磁珠筛选第一次PCR扩增产物；
（8）杂交：将片段筛选的第一次PCR扩增产物与芯片进行杂交；
（9）捕获和洗脱：用磁珠对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其它杂质；
（10）第二次PCR扩增：以洗脱后的带磁珠的DNA为模板进行PCR扩增，以进一步放大目的基因信号；
（11）第三次纯化：用磁珠纯化第二次PCR扩增产物两次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中DNA来源于肿瘤穿刺样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中DNA的量是10ng至100ng。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中DNA打断成大小为200bp左右的片段。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中用1.8倍AMPure XP磁珠纯化末端修复产物。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中用1.2倍AMPure XP磁珠纯化接头连接产物。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中分别用0.8倍和0.2倍AMPure XP磁珠筛选第一次PCR扩增产物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）中第一次PCR扩增产物与芯片进行杂交之前，按每张芯片杂交800ng的DNA总量计算，将4-8个样本按比例混合成一个文库。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（9）中用链霉亲和素磁珠对杂交产物进行捕获。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（11）中用1.5倍AMPure XP磁珠纯化第二次PCR扩增产物。
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