CN109200060B - 氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其用途，具体而言，本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其在肿瘤治疗、抗感染治疗和污水处理中的用途。

Description

氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其用途
技术领域
本申请属于纳米生物医学、纳米技术、肿瘤生物学等的交叉领域。特别地，本申请涉及纳米材料的医学应用。更具体而言，本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其在肿瘤治疗、抗感染治疗和污水处理中的用途。
背景技术
氮掺杂纳米碳材料(N-doped carbon nanomaterials)的研究已经成为国际碳材料领域的热点之一。氮原子比碳原子多一个价电子，氮掺杂进入碳的六元环结构后可形成吡啶、吡咯、石墨氮、吡啶氧化物等含氮官能团，不仅可以提高纳米碳材料的表面化学活性，还可对其电子结构进行调节，从而改变纳米碳球的催化活性、导电性和吸附性能等[1,2]。传统的氮掺杂纳米材料广泛用于氧还原反应(oxygen reduction reaction，ORR)[3]，超级电容器 [4]以及电化学和生物传感器[5]等领域。但是迄今为止，未有将其应用于生物医学的报道。
在2007年，本发明人在国际上首次发现无机Fe3O4纳米颗粒等本身就具有内在的生物酶活性[6]，并将这种具有内在酶活性的纳米材料称为纳米酶[7]。发现纳米酶的报道引领了纳米酶颗粒研究的热潮，有近百种纳米材料的不同纳米酶颗粒活性被陆续报道[8,9]，并被广泛应用于纳米生物医学技术领域，比如生物传感、生物成像、组织工程、肿瘤的诊断和治疗等等 [10-12]。
截至目前，未有氮掺杂纳米碳材料或氮掺杂纳米碳球是否具有类酶活性的报道。
发明内容
本发明的第一方面涉及氮掺杂纳米碳球用作氧化酶的用途。
在一些实施方案中，所述用途是体外用途或体内用途。在一些实施方案中，所述用途是治疗和/或诊断用途。在一些实施方案中，所述用途是非治疗和/或非诊断用途。
本发明的第二方面涉及氮掺杂纳米碳球在制备用于治疗受试者中的肿瘤的药物中的用途。
本发明的第三方面涉及利用氮掺杂纳米碳球治疗受试者中的肿瘤的方法，其包括向受试者施用所述氮掺杂的纳米碳球。
本发明的第四方面涉及氮掺杂纳米碳球，其用于治疗受试者中的肿瘤。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤，优选地，所述肿瘤选自脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌或黑色素瘤，更优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌或肝母细胞瘤。
本发明的第五方面涉及氮掺杂纳米碳球在制备抗感染药物中的用途。
本发明的第六方面涉及利用氮掺杂纳米碳球治疗受试者中的感染的方法，其包括向受试者施用所述氮掺杂的纳米碳球。
本发明的第七方面涉及氮掺杂纳米碳球，其用于制备抗感染药物。
在一些实施方案中，所述感染选自细菌感染、放线菌感染、真菌感染、病毒感染、衣原体感染、支原体感染、立克次体感染、螺旋体以及朊病毒感染的一种或多种，优选地，所述感染选自细菌感染、放线菌感染和真菌感染的一种或多种，优选地，所述感染是细菌感染，更优选地，所述感染是链球菌、葡萄球菌或铜绿假单胞菌感染。
本发明的第八方面涉及氮掺杂纳米碳球用于处理含有机物污水的用途。
在一些实施方案中，所述有机物选自酚类、醛类、碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素的一种或多种，优选地，所述有机物是苯。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球的粒径范围为20-200nm之间，优选地，粒径范围为50-150nm，更优选地，粒径范围为70-140nm。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球进一步掺入金属元素，优选地，所述金属元素选自Fe、Co、Ni、Cu、Ce和Mn的一种或多种，更优选地，所述金属元素选自是Fe、Ni、Ce、Mn和Cu的一种或多种。更优选的，所述金属元素是Fe。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球用靶向性蛋白进一步进行修饰，优选地，所述靶向性蛋白选自抗体、配体或受体，优选地，所述靶向性蛋白是全人H铁蛋白。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：
1)在形成碳前驱体的过程中引入含氮物质；
2)进行碳化。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：
1)在形成碳前驱体的过程中引入三聚氰胺，其中碳前驱体为苯酚，且三聚氰胺与苯酚的质量比为1:5～5:1，优选地，1:3～3:1，更优选地，1:2～2:1，最优选地，1:1；2)在500-1200℃下碳化1-8hr，优选地，温度为600-1000℃，更优选地，700-900℃，更优选地，750-850℃，优选地，碳化时间为1.5-6hr，更优选地，2-5hr，更优选地，2.5-4hr，更优选，2.5-3.5hr，最优选地，3hr。
换言之，在本发明中，申请人首次发现，氮掺杂纳米碳球(N-carbon) 具有天然的氧化酶活性，其中氧化酶活性与生物体中氧化酶蛋白类似，在氧气存在的条件下，可产生强自由基，从而对底物进行氧化反应。并且铁等金属原子的掺杂可以有效提高其类氧化酶催化活性。本发明人将具有氧化酶活性的N-Carbon应用于肿瘤的体内治疗，发现无需任何其他药物的添加， N-carbon可显著性的杀伤肿瘤细胞，具有良好的治疗效果。而且，利用 N-carbon的氧化酶活性，还可以实现抗感染治疗和含有机物废水的处理。因此，本发明不仅首次证实了氮掺杂纳米碳球具有氧化酶活性，还发现其可以用于***、抗感染和污水处理等用途。
附图说明
图1Carbon(A图)、N-carbon(B图)的透射电子显微镜(TEM)表征及对两种材料的光电子能谱分析(C图)。TME电镜结果表明，N掺杂不会影响纳米碳球的形貌及尺寸，光电子能谱分析表明N掺杂成功。
图2N-carbon的高分辨率投射电子显微镜(A图)及扫描投射电子显微镜(B-D图)表征。
图3不同纳米材料氧化酶活性的测定。***p<0.001,One way ANOVA分析不同浓度下，N-carbon与Carbon或者Fe3O4纳米酶的差异值。
图4O2含量对N-carbon氧化酶活性的影响。改变反应体系中O2的含量对整个氧化酶反应的影响显著，提高O2含量可以极大促进反应的进行，降低 O2含量可以抑制整个反应的进行。
图5N-carbon可以显著杀伤肿瘤细胞HepG2，而Carbon纳米颗粒不能。 (A图)荧光标记的N-carbon进入肿瘤细胞HepG2后的亚细胞定位。(B图) 对N-carbon、Carbon及PBS处理后的肿瘤细胞内羟基自由基检测；(C图) 不同纳米材料对HepG2细胞存活率的影响。
图6N-carbon对体内肿瘤具有显著性的抑瘤效果。(A图)荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；(B图)给药后，荷瘤小鼠的体重变化；(C图)给药后，荷瘤小鼠的生存期。箭头所示位置为给药的时间点。生存期统计方法为Log-rank (Mantel-Cox)test。
图7N-carbon、HFn-N-carbon及PBS处理对肿瘤的抑制生长效果。
图8Fe掺杂后，Fe-N-carbon具有更强的氧化酶活性。A图和B图为对 Fe-N-carbon的光电子能谱分析。结果表明，在纳米碳球中，成功掺入了Fe。 C图为对Carbon、N-carbon及Fe-N-carbon的氧化酶活性表征。结果表明， Fe掺杂，会进一步增强纳米碳球的氧化酶活性。
图9不同金属掺杂后，对N-carbon颗粒氧化酶活性的影响。其中，将碳球与传统的磁颗粒Fe3O4，以及未掺杂N的碳球N0、N-carbon(N3)以及掺杂N比例高的碳球N-HCNs进行了定量的对比。
图10Fe-N-carbon纳米颗粒用于伤口染菌的治疗。与缓冲液组相比， Fe-N-carbon纳米颗粒治疗组很快愈合。
图11N-carbon的氧化酶活性，可有效降解污水中的苯类化合物，实现污水的净化处理。A，气相色谱-质谱联用(GC-MS)对含苯废水及经过N-carbon 处理后的废水表征。B，污水经N-carbon颗粒处理后的效果图。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“纳米碳球”是指尺度是纳米尺度，形貌是球形的碳颗粒，其组成为C、N、O，粒径在20-200nm之间，如20nm、30nm、40nm、 50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、 150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm，如20-180nm、30-160nm、 40-150nm、50-150nm、60-150nm、70-150nm、80-140nm、90-140nm、 100-130nm、110-130nm、115-125nm、20-140nm、30-130nm、40-120nm、 50-110nm、60-100nm、70-90nm，其它形状的一些颗粒，比如纳米棒，纳米片，纳米花等含氮碳材料亦有模拟氧化酶活性。本发明的纳米碳球的边界粒径上限为300nm。本发明的纳米碳球的粒度分布相对均一，但粒度分布是否均一并不实质性影响本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性。本发明所用的纳米碳球可以利用本领域已知的任何方法制备。
如本文所用，术语“氮掺杂的纳米碳球”是指在碳骨架中掺杂有氮(N) 原子的纳米碳球，具体讲就是在石墨化结构中掺入了N原子。本领域知晓如何将N原子掺入纳米碳球的方法，例如，一种常规的方法就是在前驱体中加入含氮物质，如加入三聚氰胺，前驱体中含氮物质的量直接影响着最终氮掺杂纳米碳球的氮含量，也有用后处理的方法，例如NH3气处理等。一般需要高温碳化过程，或者高温处理。碳化过程对最终产物的氮含量也有较大影响，随着碳化温度的升高，碳化时间的延长，都会造成氮含量的降低。本发明所用的氮掺杂的纳米碳球的氮掺杂比例为0.5-15at％，如0.5-13at％、 0.5-12％、1-11at％、1-9at％、1.5-8at％、2-7at％、2-6at％、2.5-5at％、 2.5-4.5at％，如0.6at％、0.8at％、1at％、1.2at％、1.4at％、1.6at％、 1.8at％、2.0at％、2.2at％、2.4at％、2.6at％、2.8at％、3.0at％、3.5at％、 4.0at％、4.5at％、5.0at％、5.5at％、6.0at％、6.5at％、7.0at％、7.5at％、 8.0at％、8.5at％、9.0at％、9.5at％、10.0at％、11.0at％、12.0at％、13.0at％、14.0at％。
本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性与粒径大小相关，粒径越小，催化效能越高，其催化效率跟比表面积、氮含量等诸多条件也有关。含氮的、比表面积大的含氮碳球可以用本领域的任何方法制备，具有高低不同但相似的效果。本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性在低于7的酸性pH值环境下发挥，例如pH值为1-6.5、2-6、3-5.5、3.5-5、4.0-4.5，例如pH为2.5、3、3.5、4、 4.5、5.0、5.5或6.0。
如本文所用，术语“继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球”是指继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球，例如掺入Fe、Co、Ni、Cu、 Ce、Mn中的一种或多种，如2种、3种、4种或更多种，优选地，所述掺入的金属元素为Fe。
如本文所用，术语“氧化酶”是指一种能够催化氧化还原反应的酶，特别的，将氧气作为电子的受体，在反应过程中将氧气还原为过氧化氢或者水的一类蛋白酶。“类氧化酶活性”是指具有类似氧化酶活性的一类催化活性的总称。
如本文所用，氮掺杂纳米碳球用作氧化酶的用途是指，基于氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性，本领域已知的天然氧化酶可以实现的功能都可以利用氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性实现。
如本文所用，术语“肿瘤”包括实体瘤，在一些实施方案中，所述肿瘤选自脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤等人体实体瘤。
如本文所用，抑制肿瘤生长是指经过药物处理后，肿瘤的尺寸相对于对照组，受到明显的抑制，即药物对肿瘤有显著性的治疗效果。
在一些实施方案中，本发明的氮掺杂纳米碳球可以以粉末剂、悬浊液或者溶液的形式提供，其例如含药学上可接受的载体。本发明的氮掺杂纳米碳球可以通过适宜的方式施用给受试者，例如通过静脉注射或者实体肿瘤直接注射的方式施用给受试者。
所述受试者包括禽类、爬行动物、哺乳动物等。优选地，哺乳动物包括啮齿类动物、灵长类动物，优选地，灵长类动物包括人。
如本文所用，靶向性蛋白是指可以靶向受试者体内特定靶标的蛋白。例如，靶向性蛋白可以是具有靶向作用的抗体、配体、受体。在一个实施方案中，靶向性蛋白是全人H铁蛋白。
如本文所用，抗感染治疗是指针对伤口常见的感染细菌，比如链球菌、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)、铜绿假单胞杆菌等的感染具有治疗效果。用于抗感染治疗时，本发明的氮掺杂纳米碳球可以以组合物的形式提供，其包含药学上可接受的载体。例如所述氮掺杂的纳米碳球可以以溶液、洗剂、乳剂、粉剂、软膏、湿敷剂、汀剂、贴剂、糊剂、凝胶剂、硬膏剂、胶膜剂等形式提供。
如本文所用，药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
如本文所用，含有机物的废水是指由造纸、皮革及食品等行业排出的含有机物的废水，在一些实施方案中，所述有机物的含量在2000mg/L以上废水。这些废水中含有大量的碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素等有机物，如果直接排放，会造成严重污染。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。。本实施例中的化学试剂，除非特别指明，均购自于Sigma-Aldrich Inc.(USA)。
实施例1.氮掺杂纳米碳球(简称为N-Carbon)的制备及表征
1.798g三聚氰胺，2.1mL***水溶液(37.0wt％)和15mL蒸馏水在三颈烧瓶中混匀，并在80℃条件下搅拌均匀，获得无色透明溶液。然后，向上述溶液中加入0.6g苯酚，2.1mL***溶液(37.0wt％)和15 mL NaOH(0.1mol·L-1)溶液，在66℃条件下搅拌0.5小时(h)以获得低分子量的酚醛树脂(分子量小于10000道尔顿)。然后向反应体系中加入15mL嵌段共聚物Pluronic F127(0.7g)，以350rpm的速度，在66℃条件下搅拌2 h之后，向反应液中加入50mL蒸馏水，继续反应。在反应过程中，反应液由无色变成粉色，最终变为深红色。反应24h后，反应终止，有沉淀出现。静止一段时间，沉淀会复溶，然后将17.7mL获得的反应液转入高压釜(反应釜容积30ml)中加热至130℃反应24h。最终，通过离心(转速8000转 /分，5分钟)收集产物，水洗几次后，室温干燥。获得的干燥粉末在N2条件下800℃碳化来去除Pluronic F127模板,最终获得氮掺杂纳米碳球纳米颗粒 (N-carbon nanoparticles，简称为N-Carbon)。作为对照，不掺杂氮的纳米碳球颗粒(Carbon nanoparticles，简称为Carbon)同时合成，区别为在上述体系中不加入三聚氰胺。
Carbon、N-carbon纳米颗粒的形貌利用透射电子显微镜(Tecnai 12,Philip, 荷兰)表征。结果如图1的A图、B图所示，获得的Carbon及N-carbon纳米颗粒的尺寸均为100nm。不掺杂氮的纳米碳球颗粒跟掺杂氮的颗粒无差别。光电子能谱分析(XPS)表面在掺杂氮的纳米碳球N-carbon中有明显的 N、O存在(图1的C图)，而无氮掺杂的没有。这表明纳米碳球中N掺杂成功。
N-carbon纳米颗粒的形貌进一步通过高分辨率投射电子显微镜 (HRTEM)成像表征。如图2的A图所示，可见均一的100nm左右的颗粒。 N-carbon不同纳米颗粒的均一性和同质性通过扫描投射电子显微镜(STEM) 来表征。如图2的B-D图所示，通过对不同的N-carbon纳米颗粒的STEM 表征，不同的单个N-carbon纳米颗粒具有同样的元素分布，其中图2的C图为C的k-edge分布，图2的D图为N的k-edge分布。可见，N-carbon纳米颗粒是一种组成分布均一的纳米颗粒。N的掺入量的定量数据通过元素分析仪、XPS、能谱等方法进行测定。本实验中给定条件下的氮掺入量对N-3为3.37at％，N-5为2.85at％。其中at％是指原子数百分含量。
实施例2.N-carbon具有氧化酶活性
N-carbon的氧化酶活性是在醋酸钠缓冲液中，直接氧化显色底物TMB，通过检测氧化TMB底物在652nm特异性的吸收峰来进行测定的。反应体系如下：含有不同浓度N-carbon纳米颗粒的反应液1.0mL(0.1M醋酸钠缓冲液,pH 4.25)中加入10μL TMB(终浓度为0.416mM)。室温反应10分钟 (min)后，用酶标仪(Bio-Rad)测定反应体系在652nm处的吸收峰，来测定其酶活性及强弱。实验中用Fe3O4纳米酶及不掺杂氮的纳米碳球Carbon来作为阴性对照。实验已经证实，Fe3O4纳米酶不具有氧化酶活性。
结果如图3所示，N-carbon显示出典型的氧化酶活性，在酸性条件下，可以直接将底物TMB氧化，而Fe3O4纳米酶及不掺杂氮的Carbon纳米颗粒不具有这种活性。
实施例3.O2对N-carbon氧化酶活性的影响
氧化酶反应体系同实施例2。在反应前，氮气(N2)处理组，提前用氮气鼓泡处理反应体系40min，然后在N2气环境下进行氧化酶反应和测定；空气处理组同实施例2；氧气(O2)处理组，是用氧气提前鼓泡处理反应体系40min，使反应溶液氧气饱和，然后再进行氧化酶反应和测定。紫外全波长吸收利用 Nanodrop2000(Thermo Fisher)测定。
结果如图4所示，经过氮气处理后，在氧气含量低的情况下，与空气条件相比，整个反应受到极大的限制；在鼓氧气处理后，反应体系氧气含量增加，与空气反应相比，促进了整个反应的进行。本实施例进一步验证了N-carbon 具有氧化酶的活性。
实施例4.N-carbon杀伤肿瘤细胞
4.1N-carbon纳米颗粒的荧光标记
取1mg的N-carbon，12000rpm，4℃离心20min，弃掉上清，用水洗两遍。5mg EDC溶于500μl水，5mg NHS溶于500μl水，两者1：1混合后，重悬N-carbon,室温混合30min，活化N-carbon表面的羧基。水洗两遍，最后用1mL的pH＝6的醋酸钠缓冲液(50mM)重悬。用10μl的DMSO 溶解0.5mg的Alexa Flour@488cadaverine(Thermo Fisher Scientific)，再将溶解好的荧光染料加入到重悬好的N-carbon中，4℃、避光偶联过夜。第二天,弃掉上清，加入50mM pH＝7的Tris-HCl缓冲液，室温孵育30min，中和掉未反应的活化羧基位点。然后水洗三次，洗掉未结合的荧光染料，最后用1ml的PBS重悬N-carbon,并避光保存。
4.2N-carbon在肿瘤细胞HepG2中的亚定位
在玻底培养皿(15mm直径，NEST耐思)中接种4×104个HepG2细胞(购自ATCC)。培养条件为1640完全培养基(Gibco Life Technologies Inc.,UK)，加入10％(v/v)的胎牛血清(Sigma-Aldrich)及抗生素青霉素(100U/mL, Sigma-Aldrich)及链霉素(100g/mL,Sigma-Aldrich)，37℃，5％CO2条件下培养。12h以后弃掉细胞培养上清，分别加入1.5ml的0.2mg/ml N-carbon， 37℃、5％CO2孵育24h以后弃掉培养上清，用PBS洗两遍，用4％PFA室温固定15min，之后用0.1％的Triton通透3min；结束之后用PBS洗两遍，用5％羊血清37℃封闭45min；用5％羊血清按1：50配置LAMP-1(Santa Cruz Biotechnology，H4A3)，并在玻底培养皿4℃孵育LAMP-抗体过夜；用 PBS小心洗3次，用5％羊血清按1：200配制羊抗鼠的555二抗(life，A21202) 37℃孵育45min；用PBS洗3次，用超纯水按1：1000配制DAPI染10min，最后用PBS洗三次，用激光共聚焦显微镜在488、555nm激发波长下观察 N-carbon的定位
结果如图5的A图所示，荧光标记的N-carbon纳米颗粒经过与细胞孵育后，会很快被内化，并最终定位到溶酶体中。N-carbon定位到溶酶体中为其氧化酶活性的发挥奠定了基础。氧化酶活性的发挥需要在酸性环境中，而 N-carbon经肿瘤细胞吸收后，富集在溶酶体中，可在氧气存在的前提下，产生自由基，对肿瘤细胞进行有效的杀伤。
4.3N-carbon的氧化酶活性使肿瘤细胞中ROS水平上升。
在玻底培养皿(15mm直径，NEST耐思)中接种8×104个HepG2细胞，12h以后弃掉细胞培养上清，分别加入1.5mL的0.2mg/mL的Carbon、 N-carbon。对照组加入1.5ml的新鲜培养基，37℃、5％CO2孵育36h以后弃掉培养上请，用PBS洗两遍，然后1.5ml，20μM的PBS溶解的H2DCFDA (Sigma，D6883)孵育HepG2。30min以后弃掉细胞培养上清，用PBS洗两遍，最后用1.5mL的完全培养基重悬，然后用488nm的激发光观察细胞
结果如图5的B图所示，经过N-carbon处理的肿瘤细胞中，其ROS水平有着显著性的上升，经过荧光染色，可以看到明显的ROS信号。而Carbon 纳米颗粒跟PBS处理的肿瘤细胞，基本上无明显的信号产生。这些结果表明， N-carbon经肿瘤细胞摄取后，富集在溶酶体中，通过其氧化酶活性，产生了大量的自由基，因而有希望对肿瘤细胞进行杀伤。
4.4N-carbon纳米颗粒可有效地杀伤肿瘤细胞
在96孔板(Corning)中每个孔接种4×103个HepG2细胞，12h以后弃掉细胞培养上清，分别加入用细胞培养基稀释好的0，0.05，0.1，0.2mg/mL 的Carbon、N-carbon，加入细胞之前超声30s。对照样品用等体积PBS孵育， 37℃、5％CO2细胞培养箱孵育48h以后用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒 (东仁化学科技(上海)有限公司CK04-3000T)检测细胞毒性。
结果如图5的C图所示，N-carbon可对肿瘤细胞HepG2进行有效的杀伤，而Carbon纳米颗粒本身不具有这个特性。综合实施例4.2和4.3，本发明公开的N-carbon纳米颗粒具有独特的氧化酶活性，可富集到肿瘤细胞的溶酶体中，发挥氧化酶活性，产生大量自由基，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
实施例5.N-carbon抑制肿瘤生长
本发明人首先利用HepG2细胞在Balb/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)上构建了皮下移植瘤模型。每只裸鼠的背部右下侧，接种5× 105HepG2细胞，待肿瘤长到200mm3时，对移植瘤小鼠进行N-carbon治疗研究。对于治疗窗口期的选择，因为氧化酶活性的发挥需要氧气的参与，因此，待移植瘤长到200mm3时，肿瘤新生血管大量生成，有充足的血液供应。此时治疗，氧化酶的活性可以充分发挥。本实施例中，在小鼠肿瘤达到指定尺寸后的6天内，瘤内注射PBS、Carbon纳米颗粒及N-carbon纳米颗粒(2.5 mg/mL,150L/只)，观察40天，统计生存期、肿瘤生长曲线及体重变化。
结果如图6的A-C图所示，具有氧化酶活性的N-carbon纳米颗粒，可以显著地抑制肿瘤的生长，并极大地提高了荷瘤小鼠的生存期(p<0.0001, Log-rank(Mantel-Cox)test)。PBS跟Carbon处理组荷瘤小鼠的平均生存期为 20、22天，而N-carbon纳米颗粒处理的荷瘤小鼠，平均生存期可延长至30 天。而体重无明显变化。本实施例证明，N-carbon纳米颗粒，可以借助其氧化酶活性，对体内的肿瘤进行有效的杀伤。
实施例6靶向性蛋白修饰N-carbon可以增强其抑制肿瘤的效果。
本发明人在前期工作中证实，人H铁蛋白对肿瘤具有特异的靶向性，并可以有效进入肿瘤细胞的溶酶体中(ZL201110122433.0；ZL201410230829.0)。本实施例中，探求HFn修饰N-carbon(制备方法参见实施例1)对其抑制肿瘤生长的效果。同实施例5，本发明人首先利用HepG2细胞在Balb/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)上构建了皮下移植瘤模型，待移植瘤长到200mm3时，瘤内注射N-carbon纳米颗粒及人H铁蛋白修饰的N-carbon纳米颗粒(HFn-N-carbon)(2.5mg/mL,150L/只)，观察32天，统计肿瘤生长曲线。
结果如图7所示，具有氧化酶活性的N-carbon纳米颗粒，可以显著地抑制肿瘤的生长。而经过靶向肿瘤的HFn修饰后(HFn-N-carbon)，其抗肿瘤效果更好。这表明经过靶向性配体，以及靶向性抗体、蛋白、多肽的修饰后，进一步增强了N-carbon纳米颗粒的抗肿瘤活性。
实施例7.在氮掺杂的基础上，继续掺杂其他金属元素，可增强carbon颗粒的类氧化酶活性。
本实施例中，本发明人在N掺杂的基础上继续掺杂铁，来证实金属元素的掺杂是否可进一步增强Carbon材料的类氧化酶活性。具体步骤如下：在 250ml圆底烧瓶中加入90ml乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀，再往上述溶液中加入2.0ml氨水，搅拌约10min后，加入4.0ml TEOS搅拌8h，停止反应，高速离心得到白色固体，去离子水、乙醇各洗涤3次，置于60℃烘箱干燥12h，得到SiO2固体，研碎备用。将所得100mg SiO2小球分散在Tris-HCl (pH＝8.5)缓冲溶液中，加入100mg的多巴胺，反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到PDA@SiO2，备用。将上述所得的PDA@SiO2分散在 20ml的乙醇溶液中，加入100mg FeCl3·6H2O,反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到Fe3+-PDA@SiO2，备用。将上述所得Fe3+-PDA@SiO2小球800℃下煅烧2h后，碱洗8h后，离心洗涤，烘干，即得Fe-N-carbon纳米颗粒。
Fe-N掺杂的纳米碳球的酶活性通过测定其氧化酶活性来进行验证，反应体系同实施例2，反应体系中加入Carbon、N-carbon及Fe-N-carbon，浓度均为7.5μg/mL。结果如图8的A-C图所示，Carbon单独不具有氧化酶活性，N-carbon具有明显的氧化酶活性。而继续掺杂Fe的Fe-N-carbon，在同等条件、同等浓度下，具有比N-carbon更强的氧化酶活性。基于此实施例，本发明人继续向N掺杂的carbon中掺杂其他金属离子(Ni/Ce/Mn/Cu)，发现金属掺杂后，均会进一步增强其酶活性(图9)。这些结果表明，金属掺杂，会进一步增强N-carbon的氧化酶活性。
实施例8.基于氮掺杂碳球的氧化酶活性，用于体内伤口杀菌
本实施例中，用到的氮掺杂碳球为Fe-N-carbon颗粒。基于其氧化酶活性，发明人将其应用于体内伤口感染细菌后的治疗，具体步骤如下：
小鼠(Balb/c正常小鼠，购自维通利华)背部剃毛，麻醉后，用手术刀划直径为5mm的伤口。然后，将铜绿假单胞杆菌菌液(107cfu/mL)滴到伤口上，保证菌液在伤口部位停留一段时间(10min)。感染12h后开始开展实验。缓冲液组，向伤口滴加10μl缓冲液(pH5.0NaAc)，然后用绷带将伤口包起； Fe-N-carbon组，首先将Fe-N-carbon颗粒用上述缓冲液稀释到0.2mg/mL，向伤口滴加10μl Fe-N-carbon颗粒，然后用绷带将伤口包起。给药后，24h 换一次绷带，在第1、3、5天对伤口进行拍照。
结果如图10所示，在伤口感染铜绿假单胞杆菌化脓后，经Fe-N-carbon 治疗的小鼠伤口很快恢复，与之相比，给予缓冲液的恢复缓慢，伤口一直没有彻底愈合。
实施例9.基于氮掺杂碳球的氧化酶活性，用于含有机物工业废水的净化处理
目前，含有机物废水的净化处理是水处理领域的难题。特别是苯类化合物是工业废水中常见的有机污染物，其毒性大且不易被环境中的微生物降解。在本实施例中，本发明人利用了N-carbon碳球的氧化酶活性，进行了降解工业废水中苯类有机物的可行性探讨。
具体步骤如下：
含苯类有机物工业废水先用醋酸钠缓冲液调整pH为酸性。然后向1mL 工业废水样品中，加入20μg N-carbon纳米颗粒。然后进行充分的搅拌，使反应体系空气充足。向另一组废水样品中，加入20μg N-carbon纳米颗粒和 10μL 30％H2O2,同样充分搅拌。反应6h后，取反应产物进行气相色谱-质谱联用分析(GC-MS)，同时对反应前后的工业废水样品进行拍照。
结果如图11的A-B图所示，单独加入N-carbon纳米颗粒的废水组，在 N-carbon的氧化酶作用下，有效降解了废水中的有机苯，而缓冲液本身没有 影响。在上述基础上，继续加入H2O2后，在氧化酶的作用下，废水中的有机 苯基本上被降解完毕(图11的A图)，同时，废水的颜色也由深色，变为基 本上无色。因此N-carbon的氧化酶活性可用于含有机污染物的工业废水处 理。
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Claims (5)

1.N-carbon纳米颗粒在制备用于***的药物中的用途，其中所述N-carbon纳米颗粒利用下述方法制得：
1.798 g 三聚氰胺，2.1 mL 的37.0 wt %***水溶液和15 mL 蒸馏水在三颈烧瓶中混匀，并在80°C条件下搅拌均匀，获得无色透明溶液；然后，向上述溶液中加入0.6 g苯酚，2.1 mL的37.0 wt %***溶液和15 mL 0.1 mol×L-1 的NaOH溶液，在66°C条件下搅拌0.5 h以获得分子量小于10000 道尔顿的酚醛树脂；然后向反应体系中加入含 0.7 g的嵌段共聚物Pluronic F127 15 mL，以350 rpm 的速度，在66 °C条件下搅拌 2 h 之后，向反应液中加入50 mL 蒸馏水，继续反应；在反应过程中，反应液由无色变成粉色，最终变为深红色；反应24h后，反应终止，有沉淀出现；静止一段时间，沉淀会复溶，然后将17.7 mL获得的反应液转入30 ml高压釜中加热至130 °C反应24 h；最终， 8000转/分 离心5分钟收集产物，水洗几次后，室温干燥；获得的干燥粉末在N2条件下800°C 碳化来去除PluronicF127模板, 最终获得N-carbon纳米颗粒；其中所述肿瘤选自选自肝细胞癌或肝母细胞瘤。
2.Fe-N-carbon纳米颗粒在制备抗感染药物中的用途，其中所述Fe-N-carbon纳米颗粒利用下述方法制得：
在250ml圆底烧瓶中加入90ml乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀，再往上述溶液中加入2.0ml氨水，搅拌约10min后，加入4.0ml TEOS搅拌8h，停止反应，高速离心得到白色固体，去离子水、乙醇各洗涤3次，置于60℃烘箱干燥12h，得到SiO2固体，研碎备用；将所得100mgSiO2小球分散在pH=8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入100mg的多巴胺，反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到PDA@SiO2，备用；将所得的PDA@SiO2分散在20ml的乙醇溶液中，加入100mg FeCl3•6H2O, 反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到Fe3+- PDA@SiO2，备用；将所得Fe3+- PDA@SiO2小球800℃下煅烧2h后，碱洗8h后，离心洗涤，烘干，即得Fe-N-carbon纳米颗粒；
其中所述感染选自铜绿假单胞菌感染。
3.N-carbon纳米颗粒用于处理含有机物污水的用途，
其中所述N-carbon纳米颗粒利用下述方法制得：
1.798 g 三聚氰胺，2.1 mL的37.0 wt %***水溶液和15 mL 蒸馏水在三颈烧瓶中混匀，并在80°C条件下搅拌均匀，获得无色透明溶液；然后，向上述溶液中加入0.6 g苯酚，2.1 mL的37.0 wt %***溶液和15 mL 0.1 mol×L-1 的NaOH溶液，在66°C条件下搅拌0.5 h以获得分子量小于10000 道尔顿的酚醛树脂；然后向反应体系中加入含 0.7 g的嵌段共聚物Pluronic F127 15 mL，以350 rpm 的速度，在66 °C条件下搅拌 2 h 之后，向反应液中加入50 mL 蒸馏水，继续反应；在反应过程中，反应液由无色变成粉色，最终变为深红色；反应24h后，反应终止，有沉淀出现；静止一段时间，沉淀会复溶，然后将17.7 mL获得的反应液转入30 ml高压釜中加热至130 °C反应24 h；最终， 8000转/分 离心5分钟收集产物，水洗几次后，室温干燥；获得的干燥粉末在N2条件下800°C 碳化来去除PluronicF127模板, 最终获得N-carbon纳米颗粒；其中所述有机物选自苯。
4.如权利要求1或3所述的用途，其中所述N-carbon纳米颗粒的粒径范围为70-140nm。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰，所述靶向性蛋白是全人H铁蛋白。
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