CN109182399B - 一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法，属于食品加工领域。该发明采用重构的壁膜复合物（酵母细胞壁、发酵终点的醋酸菌细胞膜）覆盖玉米芯微颗粒作为醋酸菌载体，达到提高醋酸菌耐乙酸能力，最终达到提高产乙酸的目的。

Description

一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法
技术领域
本发明属于食品酿造领域，具体涉及一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法。
背景技术
乙酸的制备可以通过人工合成和生物发酵两种方法，发酵法生产醋酸或食醋是乙醇在醋酸菌的作用下氧化成醋酸的过程。生物发酵法仅占整个世界产量的10%。但是很多国家的食品安全法规规定食物中的醋必须是通过生物法制备，因此生物发酵法仍然是生产乙酸，尤其是醋的最重要的方法（醋酸为食醋主要成分）。
低至0.5%的乙酸可对大多数微生物生长产生抑制作用。微生物抑制作用使乙酸成为常用的防腐剂。醋酸菌是发酵法生产醋酸的重要微生物，相对于常见的微生物，醋酸菌具有优良的醋酸耐受能力。但是，在发酵生产中，醋酸仍然对醋酸菌形成毒害作用，而且是醋酸菌所面临的最大限制因素，导致醋酸菌具有生产醋酸能力受到限制。不同种类的醋酸菌耐酸性差异很大，已发现能耐受最高醋酸浓度环境的是Ga. europaeus，其能耐受环境中10%的醋酸，醋酸发酵中最常用的A. aceti 和A. pasteurianus 两种醋酸菌只能耐受不超过6%的醋酸。我国常用的酿醋微生物为A. pasteurianus AS1.41，在发酵过程中，其耐酸能力受到醋酸逐步诱导、得到暂时提高，可生产达9%的乙酸；但其耐受能力不能获得遗传保留，生产乙酸达9%的醋酸菌在无乙醇和醋酸的培养基中培养3代后，其初始耐乙酸能力仍低于6%。
醋酸的毒性机制：高浓度的醋酸很容易通过细胞膜渗透进入细胞质, 对菌体生长及代谢产生不利影响，其毒性机制包括H+和CH3COO-引起的胞内环境紊乱。目前, 醋酸菌耐酸机制还没彻底探明。已报道研究发现了 Acetobacter 和 Gluconoacetobacter 中的一些耐酸分子机制：(1) 乙醇氧化相关的机制，包括膜结合乙醇脱氢酶(Adh)、乙醛脱氢酶(Aldh)机制；(2) 醋酸同化机制；(3) 可能将醋酸泵出的转运机制；(4) 通用抗逆机制。
醋的发酵分为固态发酵和液态发酵。液态深层醋酸发酵采用纯种发酵，周期短，产酸高，生产能力强，因优势显著而逐渐被生产厂家所采用。
一种利用玉米芯固定化醋酸菌酿造香蕉全果醋的方法（CN201510492742.5）提供了一种利用玉米芯固定化醋酸菌方法；一种固定化醋酸菌制备烟用月桂提取物的方法（CN201610895642.1）将湿菌体加入到聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液中，并用含有1～3％CaCl2的硼酸饱和溶液和饱和Na2SO4溶液中交联得固定化醋酸菌小球，但以上方法均不涉及提高醋酸菌耐乙酸能力。
基于醋酸发酵工艺，设计更好的策略提高工业微生物的酸稳定性是必不可少的。本发明通过一种醋酸菌固定化发酵方法提高醋酸菌耐乙酸能力，最终达到提高产乙酸的目的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法，该发明采用重构的壁膜复合物（酵母细胞壁、发酵终点的醋酸菌细胞膜）覆盖玉米芯微颗粒作为醋酸菌载体，达到提高醋酸菌耐乙酸能力，最终达到提高产乙酸的目的。
为了实现本发明的目的，本发明人通过大量试验研究和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：
一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法，该方法包括如下步骤：
（1）玉米芯制备：玉米芯用pH5.0盐酸溶液浸泡10-12小时，再用清水洗净，于80℃过夜；
（2）发酵终点的醋酸菌细胞膜制备：A、取分批发酵的醋酸发酵液，3000-4000rpm离心收集菌体，其中醋酸发酵液的取样点为发酵终点，醋酸浓度6%；
B、将收集的菌体重悬于蒸馏水1小时，30℃，其中蒸馏水含0.8-1.0mg/mL 溶菌酶；
C、8000-10000rpm离心10-15分钟，沉淀用200-300mL PEG800（4-6%）重悬；
（3）载体制备：用水重悬酵母细胞壁，将其均匀喷雾到步骤（1）制备的玉米芯上，30-35℃无菌风旋转吹干10-15分钟，制得载体；
（4）将步骤（2）制备的醋酸菌细胞膜喷雾到步骤（3）的载体上，30-35℃无菌风旋转吹干10-15分钟；
（5）固定化醋酸菌制备：将对数中期的醋酸菌种子液浓缩后喷雾到步骤（4）制备的载体上，常温静置40-60分钟，32-35℃风箱中水平滚动40-60分钟；
（6）将步骤（5）制备的固定化醋酸固定于发酵罐搅拌桨上，用于液态醋酸发酵，发酵罐中用6%乙醇的酒醪浸没玉米芯载体，开始醋酸发酵；醋酸浓度达到35g/L时，开始流加纯酒精的酒醪，测得发酵液总酸不在上升，终止醋酸发酵。
与现有技术相比，本发明与现有食醋加工技术相比，具有如下优点：
（1）该发明采用重构的壁膜复合物（酵母细胞壁、发酵终点的醋酸菌细胞膜）覆盖玉米芯微颗粒作为醋酸菌载体，达到提高醋酸菌耐乙酸能力，极大的提高了醋酸的耐酸能力，显著的提高了醋酸的产量。
（2）本发明固定化醋酸菌可反复使用，降低了生产成本。
具体实施方式：
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
（1）玉米芯制备：3支玉米芯用pH5.0盐酸溶液浸泡12小时，再用清水洗净，于80℃过夜。
（2）发酵终点的醋酸菌细胞膜制备：A、取30L分批发酵的醋酸发酵液（取样点为发酵终点，醋酸浓度6%），4000rpm离心收集菌体。B、重悬于蒸馏水（含1.0mg/mL 溶菌酶）1小时，30℃。C、10000rpm离心10-15分钟，沉淀用200-300mL PEG800（6%）重悬。
（3）载体制备：用300mL水重悬30g商品化酵母细胞壁，均匀喷雾到步骤（1）制备的玉米芯上，30℃无菌风旋转吹干15分钟。
（4）将步骤（2）制备的醋酸菌细胞膜喷雾到步骤（3）的玉米芯上，30℃无菌风旋转吹干15分钟。
（5）固定化醋酸菌制备：取500mL对数中期的醋酸菌种子液浓缩至200mL喷雾到步骤（4）制备的载体上，常温静置60分钟，30℃无菌风旋转吹干15分钟，固定于60L发酵罐搅拌桨上，用于液态醋酸发酵。
（6）醋酸发酵：60L发酵罐中用6%乙醇的酒醪浸没玉米芯（装液量约为45L），开始醋酸发酵；醋酸浓度35g/L时，开始流加纯酒精（0.05L/h）的酒醪进行醋酸发酵，测得发酵液总酸不在上升，终止醋酸发酵。
对比实施例1（不使用本发明中的固定化技术）：
（1）60L发酵罐装填45L 6%乙醇的酒醪。
（2）加入500mL对数中期的醋酸菌种子液，开始醋酸发酵；醋酸浓度35g/L时，开始流加纯酒精（0.05L/h），测得发酵液总酸不在上升，终止醋酸发酵。
对比实施例2（不用醋酸菌细胞膜做固定化原料）：
具体操作删去除步骤（2）和（4），其它与实施例1相同。
对比实施例3（不添加酵母细胞壁为固定化原料）：
具体操作去除步骤（3），其它与实施例1相同。
对比实施例4（制备细胞膜时不使用PEG800）：
除步骤（2）的C为：10000rpm离心10-15分钟，沉淀用200-300mL 培养基重悬，其它与实施例1相同。
对比实施例5 （该对比实施例为检测本方法固定化细胞重复使用效率）
实施例1完成后，立刻进行实施例1（6）中的醋酸发酵。
对比实施例6（该对比实施例为检测本方法固定化细胞重复使用效率）
对比实施例5完成后，立刻进行实施例1（6）中的醋酸发酵。
对实施例及对比实施例1-6所制备样品进行了醋酸含量对比，试验结果为三次重复试验统计，具体结果见下表。
表1 各实施例中醋酸含量比较
Figure DEST_PATH_IMAGE001
a滴定法测定
由以上试验结果可知，实施例1制备样品中醋酸含量显著的高于对比实施例1-4，最高达到9.3±0.1%，由对比实施例5、6可知，本发明中的固定化醋酸菌可反复使用。

Claims (1)

1.一种提高醋酸菌产乙酸能力的固定化醋酸发酵方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）玉米芯制备：玉米芯用pH5.0盐酸溶液浸泡10-12小时，再用清水洗净，于80℃过夜；
（2）发酵终点的醋酸菌细胞膜制备：A、取分批发酵的醋酸发酵液，3000-4000rpm离心收集菌体，其中醋酸发酵液的取样点为发酵终点，醋酸浓度6%；
B、将收集的菌体重悬于蒸馏水1小时，30℃，其中蒸馏水含0.8-1.0mg/mL 溶菌酶；
C、8000-10000rpm离心10-15分钟，沉淀用200-300mL 4-6%的PEG800重悬；
（3）载体制备：用水重悬酵母细胞壁，将其均匀喷雾到步骤（1）制备的玉米芯上，30-35℃无菌风旋转吹干10-15分钟，制得载体；
（4）将步骤（2）制备的醋酸菌细胞膜喷雾到步骤（3）的载体上，30-35℃无菌风旋转吹干10-15分钟；
（5）固定化醋酸菌制备：将对数中期的醋酸菌种子液浓缩后喷雾到步骤（4）制备的载体上，常温静置40-60分钟，32-35℃风箱中水平滚动40-60分钟；
（6）将步骤（5）制备的固定化醋酸菌固定于发酵罐搅拌桨上，用于液态醋酸发酵，发酵罐中用6%乙醇的酒醪浸没玉米芯载体，开始醋酸发酵；醋酸浓度达到35g/L时，开始流加纯酒精的酒醪，测得发酵液总酸不再上升，终止醋酸发酵。
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