CN109182280A - 一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法 - Google Patents

一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物基因工程疫苗领域，尤其涉及一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法。该方法包括以下步骤：S1：以狂犬病病毒株rHEP‑Flury为骨架，分别将狂犬病毒G蛋白膜外抗原区基因片段及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因***rHEP‑Flury的G基因和L基因之间的假基因区；S2：拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP‑Get‑LTB。该狂犬病病毒重组毒株rHEP‑Get‑LTB具有良好的复制能力以及安全性，通过Get和LTB基因的***增强了疫苗株的免疫原性和黏膜免疫反应水平，口服免疫后可诱导较高水平的中和抗体，显著优于亲本株rHEP‑Flury，可以作为动物狂犬病口服疫苗的候选株。

Description

一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法
技术领域
本发明涉及动物基因工程疫苗领域，尤其涉及一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法。
背景技术
由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的狂犬病(Rabies)是以侵染中枢神经***为特点的烈性***共患传染病，一旦发病致死率几乎高达100％。亚非地区属于狂犬病的高发地，猫、狗等家养动物是携带RABV的主要宿主，约99％的患者是被这些动物咬伤或抓伤后而患病，狂犬病仍是严重威胁这些地区人们生命安全的重要传染病。我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度，高居世界第二位。随着家养宠物的增加，我国狂犬病的控制和防治依然任重道远。目前对于狂犬病，主要以有效的疫苗防治为主，人或者动物一旦发病，无特效药可治，所以，安全有效的疫苗是消除我国人间狂犬病的重要手段。
在我国，犬只成为狂犬病的主要带毒宿主和传播源，要想在我国消灭人狂犬病，就必须减少流浪狗的数量，普及家养犬只的免疫，使其免疫率达到70％以上，先在动物中消灭狂犬病。尽管目前针对狂犬病所研发使用的疫苗已经取得了很大的成功，但是很多科研工作者还是通过利用基因操作的优势进行更为优势疫苗的开发研究。针对世界范围内的野生动物及流浪猫狗的免疫仍是预防狂犬病的一大难题。街头流浪动物如猫、狗这些主要传染源很难进行集中的抓捕和免疫，因此，人们考虑了利用口服诱饵对其进行免疫的方法。那么研发出高效且成本低廉的口服疫苗则成为近年来狂犬病疫苗开发的热点。目前在世界范围内已经开发了很多狂犬病口服疫苗并且投入了使用，其主要针对野生动物。第一类口服狂犬病疫苗毒株是是一种金丝雀痘狂犬病糖蛋白重组疫苗，它也被发现对动物有效(TaylorJ,Meignier B,Tartaglia J,et al.Biological and immunogenic properties of acanarypox-rabies recombinant,ALVAC-RG(vCP65)in non-avian species[J].Vaccine,1995,13(6):539-549)。第二类是表达Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株的糖蛋白的牛痘—狂犬病病毒糖蛋白重组病毒。据报道，在美国，加拿大和其他一些国家，此疫苗的使用已经基本实现了对野生动物狂犬病的遏制或消除(Slate D,Rupprecht C E,Rooney J A,et al.Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the UnitedStates[J].Virus Research,2005,111(1):68-76)。第三类是通过利用抗糖蛋白单克隆抗体从SAD Bern株突变而成的SAG2，该毒株在实验动物中不产生临床疾病，并且所有接种过的狗和浣熊显示出免受RABV毒性攻击的保护(Cliquet F,Gurbuxani J P,Pradhan H K,etal.The safety and efficacy of the oral rabies vaccine SAG2in Indian straydogs[J].Vaccine,2007,25(17):3409-3418)。第四类是表达RABV糖蛋白的重组伪狂犬病毒，其在犬类中表现出良好的安全性和免疫原性(Yuan Z,Zhang S,Liu Y,et al.Arecombinant pseudorabies virus expressing rabies virus glycoprotein:safetyand immunogenicity in dogs[J].Vaccine,2008,26(10):1314-1321)。最后一类是E1和E3基因位点都缺失的重组腺病毒毒株。这种表达狂犬病糖蛋白的重组腺病毒可诱导犬、臭鼬和浣熊产生中和抗体(Fehlner-Gardiner C,Rudd R,Donovan D,et al.Comparing ONRAB(R)AND RABORAL V-RG(R)oral rabies vaccine field performance in raccoons andstriped skunks,New Brunswick,Canada,and Maine,USA[J].Journal of wildlifediseases,2012,48(1):157-167)。虽然目前有多种的狂犬病口服疫苗被研究出来，但多数用于动物的口服狂犬病疫苗通常激起较低的中和抗体水平，并且有时在犬中能够达到保护性中和抗体水平的比例很低(Rupprecht,C.E.,Hanlon,C.A.,Blanton,J.,et al.Oralvaccination of dogs with recombinant rabies virus vaccines.Virus Research[J].2005,111:101-105)。所以如何提高狂犬病口服疫苗的免疫原性以及安全性仍然是当前狂犬病疫苗的主要研究方向。
大肠杆菌热敏肠毒素(Enterotoxin coli heat-labile enterotoxin，LT)由一个A亚基(LTA)和五个B亚基(LTB)组成，是产肠毒性大肠杆菌的毒力因子之一。它与来自霍乱弧菌的霍乱毒素(Cholera toxin，CT)已被证明是最有效的黏膜佐剂，其被应用在许多实验模型中，针对增强不同的抗原的B和T细胞应答，并已通过了不同的黏膜途径进行了有效的测试(Cox E,Verdonck F,Vanrompay D,et al.Adjuvants modulating mucosal immuneresponses or directing systemic responses towards the mucosa[J].VeterinaryResearch,2006,37(3):511-539)。LTA是LT的毒素活性中心，而LTB是免疫原性中心，具有免疫原性且没有毒性。相较于CTB，LTB的毒性较小，更具有作为增强黏膜免疫的佐剂的价值。LTB可有效刺激黏膜和***免疫反应，当与一系列抗原融合或共同施用时，该无毒亚单位可具有有效的免疫调节活性以及保护效力，同时它也被认为是一种有效的黏膜和肠胃外佐剂(Sun Z,Lawson S,Langenhorst R,et al.Construction and immunogenicityevaluation of an epitope-based antigen against swine influenza A virus usingEscherichia coli heat-labile toxin B subunit as a carrier-adjuvant[J].Veterinary Microbiology,2013,164(3-4):229-238)。LTB的免疫原性和安全性已通过多种途径，包括在人体中的直肠途径，一系列试验表明它可以成为一种有效的佐剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有狂犬病口服疫苗不能诱导动物产生高水平中和抗体及保护力不足的问题，利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株rHEP-Flury为骨架，将rHEP-Flury株的G蛋白膜外抗原区基因及黏膜免疫佐剂分子LTB基因***rHEP-Flury；通过拯救获得携带LTB基因的重组狂犬病毒株，能够通过口服免疫诱导产生更高的抗狂犬病病毒中和抗体水平，研制一种有效的动物用狂犬病口服疫苗。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
本发明一方面公开了一种狂犬病病毒重组毒株的制备方法，包括以下步骤：
S1：以狂犬病病毒株rHEP-Flury为骨架，分别将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的狂犬病毒G蛋白膜外抗原区基因片段及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示经密码子优化的大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因***rHEP-Flury的G基因和L基因之间的假基因区；
S2：拯救筛选获得狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。
其中，SEQ ID NO.1所示的Get基因是通过设计引物从含有rHEP-Flury株全长基因组的质粒pHEP-3.0中PCR扩增得到。SEQ ID NO.2所示的密码子优化后的LTB基因是通过设计引物从质粒pUC-LTB中PCR扩增得到。
所述重组质粒pHEP-Get-LTB中，Get基因及LTB基因被克隆至狂犬病病毒株rHEP-Flury假基因区，即G基因和L基因中间，构建策略如附图1所示。
本发明所涉及的rHEP-Flury假基因区有多个酶切位点，易于克隆和表达多个外源基因。本发明将Get基因及LTB基因克隆至狂犬病病毒假基因区进行融合表达。
优选的，所述S1包括以下步骤：
S11：利用引物Get-F/Get-R扩增狂犬病病毒株rHEP-Flury的G蛋白膜外抗原区基因片段，并引入核酸限制性内切酶的酶切位点，所述引物Get-F/Get-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
S12：利用核酸限制性内切酶对G蛋白膜外抗原区基因片段和质粒进行双酶切处理；将两者的酶切产物进行连接，获得重组质粒pHEP-Get；
S13：利用引物LTB-F/LTB-R扩增大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因，并引入核酸限制性内切酶的酶切位点，所述引物LTB-F/LTB-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示；
S14：利用核酸限制性内切酶分别对大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因片段和所述S12中得到的重组质粒rHEP-Get进行酶切处理，将两者的酶切产物连接，获得重组质粒pHEP-Get-LTB。
更优选的，在S11中，所述核酸限制性内切酶的酶切位点分别为Pst I和Nhe I酶切位点。
最佳的，步骤S11所述扩增的PCR体系为：模板(含Get基因的pHEP-3.0质粒)2μL、2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、ddH2O 19μL；
所述扩增的PCR反应条件为：95℃30s；95℃15s；55℃15s；72℃80s，运行35个循环；最后于72℃延伸5min。
更优选的，在S13中，所述核酸限制性内切酶的酶切位点分别为Nhe I和Age I酶切位点。
最佳的，步骤S13所述酶切处理的酶切体系为：Get/pHEP-3.01μg、10×Buffer(2.1)5μL、PstⅠ1μL、NheⅠ1μL、ddH2O 40μL。
优选地，步骤S12所述连接的反应体系为：Get基因酶切产物5.6μL、pHEP-3.0酶切产物4.7μL、10×T4DNA连接酶Buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL、ddH2O 7.7μL。
优选地，步骤S13所述扩增的PCR体系为：模板(含LTB基因的pUC-LTB质粒)2μL、2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、ddH2O 19μL；
步骤S13所述扩增的PCR反应条件为：95℃30s；95℃15s；55℃15s；72℃30s，运行35个循环；最后于72℃延伸5min。
优选地，步骤S14所述酶切处理的酶切体系为：LTB/pHEP-Get1μg、10×Buffer(2.1)5μL、PstⅠ1μL、NheⅠ1μL、ddH2O 40μL。
优选地，步骤S14所述连接的反应体系为：LTB基因酶切产物1.6μL、pHEP-Get酶切产物6.5μL、10×T4DNA连接酶Buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL、ddH2O 9.4μL。
优选的，所述S2具体包括以下步骤：
S21：在细胞培养板中培养BHK-21细胞；
S22：配置溶解液；
S23：将S22中得到的溶解液转染BHK-21细胞后，将BHK-21细胞继续培养；
S24：将BHK-21细胞避光反复冻融后离心，取上清液和新鲜的BHK-21细胞混合培养；
S25：弃去细胞培养液，细胞固定后，每孔加入抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体，进行孵育，自然干燥后荧光显微镜下观察，显微镜下的绿色荧光斑点为阳性，即为拯救成功，拯救筛选获得狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。
更优选的，在S22中，将重组质粒pHEP-Get-LTB和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀，添加Opti-MEM培养基和转染试剂，轻轻吹打混匀，室温静置后，加入含血清的DMEM培养基，混匀后即得到溶解液。
最佳的，按照1：0.25：0.125：0.05：0.075的质量比，将重组质粒pHEP-Get-LTB和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀。
上述含血清的培养基为：添加含10％胎牛血清与100IU/mL双抗的DMEM培养基。
上述Opti-MEM培养基与重组质粒pHEP-Get-LTB的体积质量比为50μL/μg，Opti-MEM培养基与转染试剂的体积比为30:1。
上述含血清的培养基和重组质粒pHEP-Get-LTB的体积质量比为1000μL/μg。
最佳的，步骤S2所述步骤如下：
S21：在细胞培养板中培养至细胞密度为1×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养12～16h，至细胞60％～80％汇合；
S22：按照1：0.25：0.125：0.05：0.075的质量比，将重组质粒pHEP-Get-LTB，和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀，添加Opti-MEM培养基和转染试剂，轻轻吹打混匀，室温静置后，添加含10％胎牛血清与100IU/mL双抗的DMEM，混匀得溶解液；
S23：溶解液加入细胞37℃培养4～6h，靠板壁轻轻吸去DMEM，用1×PBS洗涤细胞一次，重新添加含10％胎牛血清与双抗的DMEM；在37℃5％CO2培养箱中培养48h，细胞95％长满后转入34℃培养96h；
S24：用锡箔纸包住上述细胞板，-70℃反复冻融细胞3次，冷冻时间1h，室温溶解；取上清液和新鲜的BHK-21细胞混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h；
S25：倾去细胞培养液，每孔加满80％预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，锡箔纸包住培养板，置-20℃30min；弃去丙酮，空干，每孔添加30μL抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体，37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×PBS洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次，自然干燥；
荧光显微镜下观察，见到绿色荧光斑点的为阳性，即拯救成功。拯救获得的病毒命名为rHEP-Get-LTB。
其中，上清液和新鲜的BHK-21细胞的体积比为2:5；所述新鲜的BHK-21细胞的细胞密度为4×105个/mL。
本发明第二个方面公开了上述方法制备得到的狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。
本发明第三个方面公开了上述的狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB在制备狂犬病疫苗领域的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点或者有益效果：
本发明公开了一种狂犬病病毒重组毒株及其制备方法，它是以rHEP-Flury为亲本毒株，在其基因组的G基因和L基因之间***了G蛋白的膜外区基因(Get)和大肠杆菌热敏肠毒素B亚基(LTB)基因。该狂犬病病毒重组毒株口服疫苗株具有良好的复制能力以及安全性，通过Get和LTB基因的***增强了疫苗株的免疫原性和黏膜免疫反应水平，口服免疫后可诱导较高水平的中和抗体，显著优于亲本株rHEP-Flury，可以作为动物狂犬病口服疫苗的候选株。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为构建狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB的基因重组策略；
图2为Get基因的PCR产物电泳图；1：DNA Maker DL2000；2、3、4：Get基因；
图3为LTB基因的PCR产物电泳图；1：DNA Maker DL2000；2、3、4：LTB基因；
图4为pHEP-3.0质粒酶切电泳图；1：DNA Maker DL15000；2、3：pHEP-3.0；
图5为pHEP-Get-LTB重组质粒PCR鉴定电泳图；1：DNA Maker DL2000；2：pHEP-3.0；3：pHEP-Get-LTB；4：阴性对照；
图6为拯救的rHEP-Get-LTB重组病毒RT-PCR鉴定电泳图；1：DNA Maker DL2000；2：rHEP-Flury；3：rHEP-Get-LTB；4：阴性对照；
图7为拯救的rHEP-Get-LTB重组病毒直接免疫荧光鉴定；
图8为rHEP-Get-LTB重组病毒感染细胞后G蛋白及LTB融合蛋白表达的WesternBlot鉴定；1：未感染细胞；2：rHEP-Flury表达的G蛋白；3：rHEP-Get-LTB表达的G蛋白；4：rHEP-Flury表达的Get-LTB蛋白；5：rHEP-Get-LTB表达的Get-LTB蛋白；
图9为rHEP-Get-LTB重组病毒及亲本株rHEP-Flury在NA细胞上的生长曲线；
图10为rHEP-Get-LTB重组病毒颅内注射对昆明小鼠体重影响，同时设立亲本株rHEP-Flury及MOCK对照组；
图11为重组病毒rHEP-Get-LTB经口服免疫在昆明小鼠体内的狂犬病中和抗体水平，同时设立亲本株rHEP-Flury及MOCK对照组(*P<0.05；**P<0.01)；
图12为重组病毒rHEP-Get-LTB作为弱毒疫苗经口服免疫小鼠21天后狂犬病毒攻毒保护率。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明中的亲本株rHEP-Flury由华南农业大学兽医学院兽医微生物学教研室提供。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1将Get基因克隆至pHEP-3.0
本实施例公开了将Get基因克隆至pHEP-3.0中，具体步骤如下：
以含有狂犬病毒rHEP-Flury全基因组的pHEP-3.0质粒(由华南农业大学郭霄峰教授馈赠)为DNA模板，设计合适的引物，扩增出狂犬病毒株HEP-Flury的G膜外抗原区基因并进行胶回收纯化。
所述引物Get-F/Get-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；Get基因的PCR产物如图2所示。
Get基因扩增引物设计，设计引物Get-F/Get-R(含PstⅠ和NheⅠ限制性内切酶位点和保护碱基)。
表1
以pHEP-3.0质粒为DNA模板，利用引物Get-F/Get-R进行PCR扩增，体系如表2所示。
表2
参照Magen公司的凝胶回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Micro Kit)使用说明书对PCR产物进行切胶回收、纯化。
将Get片段纯化回收产物及pHEP-3.0质粒(携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒)用PstⅠ和NheⅠ限制性内切酶进行处理，酶切体系如表3所示。
表3
上述体系混匀后，先37℃孵育5-15min，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取含酶切后目的基因片段的凝胶，按照Magen公司的DNA凝胶回收试剂盒(HiPure Gel PureDNA Mini Kit)说明书进行回收纯化，并按照NEB(北京)有限公司的连接试剂盒说明书将回收产物进行连接，体系如表4所示。
表4
上述体系添加混匀后，置于金属恒温仪中，16℃连接过夜，连接产物转化XL10-Gold感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提重组质粒pHEP-Get。
实施例2将LTB基因克隆至pHEP-Get。
本实施例中将LTB基因克隆至pHEP-Get，委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成根据哺乳动物密码子优化的LTB基因的质粒pUC-LTB，以其为DNA模板，设计引物LTB-F和LTB-R，扩增出LTB目的片段基因并进行胶回收纯化。
所述引物LTB-F/LTB-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；LIB基因的PCR产物电泳如图3所示。pHEP-3.0质粒如图4所示。
LTB基因扩增引物设计，设计引物LTB-F/LTB-R(含NheⅠ和AgeⅠ限制性内切酶位点和保护碱基)。
表6
以pUC-LTB质粒为DNA模板，利用引物LTB-F/LTB-R进行PCR扩增，体系如表7所示。
表7
参照Magen公司的凝胶回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Micro Kit)使用说明书对PCR产物进行切胶回收、纯化。
将LTB片段纯化回收产物及pHEP-Get重组质粒用NheⅠ和AgeⅠ限制性内切酶进行处理，酶切体系如表8所示。
表8
上述体系混匀后，先37℃孵育5-15min，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取含酶切后目的基因片段的凝胶，按照Magen公司的DNA凝胶回收试剂盒(HiPure Gel PureDNA Mini Kit)说明书进行回收纯化，并按照NEB(北京)有限公司的连接试剂盒说明书将回收产物进行连接，体系如表9所示。
表9
上述体系添加混匀后，置于金属恒温仪中，16℃连接过夜，连接产物转化XL10-Gold感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提重组质粒。
将PCR鉴定正确的质粒送天一辉远有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为pHEP-Get-LTB。将测序正确的克隆参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提pHEP-Get-LTB重组质粒，4℃保存待拯救用。
pHEP-Get-LTB重组质粒PCR鉴定电泳图如图5所示。
实施例3利用重组质粒pHEP-Get-LTB进行重组病毒rHEP-Get-LTB的拯救及筛选
本实施例公开了利用重组质粒pHEP-Get-LTB进行重组病毒rHEP-Get-LTB的拯救及筛选步骤，具体如下：
1、转染和病毒筛选方法参照Inoue(2003)和郭霄峰等(2006)的方法进行。
(1)培养BHK-21细胞：12孔细胞培养板接种BHK-21细胞(由华南农业大学兽医学院兽医微生物学教研室提供)，细胞密度为1×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养12～16h，至细胞60％-80％汇合。转染时用800μL 1×PBS洗涤细胞一次。
(2)根据Thermo Fisher Scientific公司的转染试剂Lipofectamine@3000Reagent Protocol的说明书配制转染体系并进行转染。每个体系在12孔板中做11个平行，一个孔作为空白对照，具体全长cDNA质粒及辅助质粒的用量及配比如表10所示：
表10
(3)配制Opti-MEM培养基和Lipofectamine 3000Reagent稀释液，每块板一管，每管1130μL，充分混匀。
(4)按体系配制DNA稀释液，将P3000试剂稀释至Opti-MEM培养基中，再按体系加入DNA，充分混匀。
(5)将步骤(3)和(4)中的稀释液1:1混合，室温静置5min。在这期间，用PBS轻柔洗涤细胞3遍。
(6)在12孔细胞板中，每孔加入1mL DMEM培养基，按每孔100μL的量加入转染步骤(5)混合液。
(7)将转染板置于37℃、5％CO2条件下培养6～8h。
(8)6～8h后，弃去培养基，用PBS轻柔洗涤细胞2～3次，再加入5％新鲜培养基，37℃、5％培养。
2、病毒筛选
(1)用锡箔纸包住上述细胞板，-70℃反复冻融细胞3次，冷冻时间1h，室温溶解。取40μL上清液和100μL新鲜的BHK-21细胞(细胞密度为4×105个/mL)混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h。
(2)倾去细胞培养液，每孔加满80％预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，锡箔纸包住培养板，置-20℃孵育30min。弃去丙酮，轻微烘干，每孔添加30μL抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体，37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×PBS洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次。
(3)自然干燥，荧光显微镜下观察，可以见到大量绿色荧光斑点，即为拯救成功。拯救获得的病毒命名为rHEP-Get-LTB。
实施例4重组病毒rHEP-Get-LTB的传代和鉴定
该实施例的具体步骤如下：
1、将重组病毒rHEP-Get-LTB在NA细胞(由华南农业大学兽医学院兽医微生物学教研室提供)上进行传代和培养。将培养的
rHEP-Get-LTB进行RT-PCR鉴定、免疫荧光鉴定和Get及LTB融合蛋白表达检测。RT-PCR利用引物Get-F及LTB-R进行检测。免疫荧光在NA细胞进行，利用FITC标记的抗狂犬病毒N蛋白抗体鉴定。Get及LTB融合蛋白表达检测在NA细胞进行，通过参照Luo等(2016)的方法，利用G蛋白和LTB的单克隆抗体进行Western blot检测。
2、进行RT-PCR试验，检测结果正确，如图6所示；表明本发明的重组病毒rHEP-Get-LTB成功***Get及LTB基因。免疫荧光检测结果阳性，如图7所示，表明培养病毒为重组狂犬病病毒。Western blot检测结果正确，如图8所示，表明重组病毒表达Get及LTB融合蛋白。
实施例5重组病毒rHEP-Get-LTB在NA细胞上的体外生长曲线研究
本实施例公开了重组病毒rHEP-Get-LTB在NA细胞上的体外生长曲线研究，具体包括以下步骤：
1、将传代培养的重组病毒HEP-Get-LTB利用NA细胞进行体外生长曲线研究。用细胞营养液调整NA细胞密度为2×105/mL，将重组狂犬病毒HEP-Get-LTB和亲本株rHEP-Flury病毒感染浓度调整为MOI(multiplicity of infection)为3，37℃感染1h后，弃去上清液，加入新鲜的完全培养液(10％血清)于5％CO2 37℃培养箱中培养，当细胞完全汇合时转移至34℃，共培养120h；每隔24h收集100μL上清培养液并进行直接免疫荧光抗体检测，测定不同时间的病毒滴度，绘制成生长曲线。
2、结果显示，重组病毒rHEP-Get-LTB与rHEP-Flury有着相似的生长特性，当MOI＝3时，两者均在72h达到高峰(见图9)。
实施例6重组病毒rHEP-Get-LTB对乳鼠的半数致死量研究
将病毒rHEP-Flury和rHEP-Get-LTB的滴度调整为1.0×106FFU/mL，作倍比稀释后(10-2～10-7)接种乳鼠。每个稀释度颅内接种3日龄以内的SPF级昆明系乳鼠(购买自南方医科大学实验动物中心)，用高压灭菌并置于烘箱烘干后的50μL微量进样器注射30μL病毒液，连续15d观察乳鼠的发病及死亡情况，以Karber法计算乳鼠半数致死量LD50。两株狂犬病病毒的乳鼠颅内半数致死量如下表所示。rHEP-Get-LTB的致病力略低于rHEP-Flury。
表11
实施例7重组病毒rHEP-Get-LTB对小鼠体重影响的研究
将6周龄SPF级昆明雌鼠(购买自南方医科大学实验动物中心)进行分组，分别分为3组，每组8只。将狂犬病病毒rHEP-Flury和rHEP-Get-LTB的滴度调整为1.0×107FFU/mL，颅内注射接种小鼠30μL。感染后，观察各组小鼠的发病情况及出现死亡的情况，并每天对小鼠进行称重，将所有小鼠的体重比上各自注射前的体重，研究体重比例变化情况。结果显示rHEP-Get-LTB毒株对小鼠的致病力较rHEP-Flury稍弱，如图10所示。
实施例8重组病毒rHEP-Get-LTB在昆明小鼠体内的口服免疫原性及攻毒保护研究
1、重组狂犬病病毒rHEP-Get-LTB口服免疫原性研究
将6周龄SPF级昆明雌鼠进行分组，分别分为6组，每组8只。将狂犬病病毒rHEP-Flury和rHEP-Get-LTB的滴度调整为1.0×107FFU/mL，通过口服灌胃的方式给小鼠进行免疫。口服灌胃200μL。同时口服1640培养基作为空白对照(即MOCK对照组)。于攻毒后的第7、14、21天进行眼眶采血制备血清，将血清置于56℃水浴锅30min灭活补体。并采用Cliquet等(1998)的方法进行中和抗体检测。
如图11所示，在口服免疫方式下，第21天，rHEP-Get-LTB组的小鼠产生的中和抗体水平明显高于亲本株rHEP-Flury组。
2、为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对强毒攻击的保护，在免疫后第28d对小鼠颅内接种50LD50的CVS-24 30μL，连续16d观察小鼠的发病及死亡情况。
如图12所示，口服免疫rHEP-Get-LTB对于小鼠的保护率达到了75％，显著高于rHEP-Flury的37.5％。
上述结果表明，相对于亲本株rHEP-Flury，含有LTB基因的基因工程重组病毒rHEP-Get-LTB在口服的免疫方式下具有更好的免疫原性和保护效果。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种狂犬病病毒重组毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以狂犬病病毒株rHEP-Flury为骨架，分别将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的狂犬病毒G蛋白膜外抗原区基因片段及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示经密码子优化的大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因***rHEP-Flury的G基因和L基因之间的假基因区；
S2：拯救筛选获得狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：
S11：利用引物Get-F/Get-R扩增狂犬病病毒株rHEP-Flury的G蛋白膜外抗原区基因片段，并引入核酸限制性内切酶的酶切位点，所述引物Get-F/Get-R的核苷酸序列分别如SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
S12：利用核酸限制性内切酶对G蛋白膜外抗原区基因片段和质粒进行双酶切处理；将两者的酶切产物进行连接，获得重组质粒pHEP-Get；
S13：利用引物LTB-F/LTB-R扩增大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因，并引入核酸限制性内切酶的酶切位点，所述引物LTB-F/LTB-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
S14：利用核酸限制性内切酶分别对大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位基因片段和所述S12中得到的重组质粒rHEP-Get进行酶切处理，将两者的酶切产物连接，获得重组质粒pHEP-Get-LTB。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S11中，所述核酸限制性内切酶的酶切位点分别为Pst I和Nhe I酶切位点。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S13中，所述核酸限制性内切酶的酶切位点分别为Nhe I和Age I酶切位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：
S21：在细胞培养板中培养BHK-21细胞；
S22：配置溶解液；
S23：将S22中得到的溶解液转染BHK-21细胞后，将BHK-21细胞继续培养；
S24：将BHK-21细胞避光反复冻融后离心，取上清液和新鲜的BHK-21细胞混合培养；
S25：弃去细胞培养液，细胞固定后，每孔加入抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体，进行孵育，自然干燥后荧光显微镜下观察，显微镜下的绿色荧光斑点为阳性，即为拯救成功，拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP-Get-LTB。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S22中，将重组质粒pHEP-Get-LTB和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀，添加Opti-MEM培养基和转染试剂，轻轻吹打混匀，室温静置后，加入含血清的DMEM培养基，混匀后即得到溶解液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按照1：0.25：0.125：0.05：0.075的质量比，将重组质粒pHEP-Get-LTB和辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S25中，采用预冷的丙酮对细胞进行固定处理。
9.根据权利要求1-8中任意一项方法制备得到的狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB。
10.根据权利要求9所述的狂犬病病毒重组毒株rHEP-Get-LTB在制备狂犬病疫苗领域的应用。
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