CN109182184A

CN109182184A - 一株犬源乳酸片球菌及其应用

Info

Publication number: CN109182184A
Application number: CN201811081904.6A
Authority: CN
Inventors: 王春凤; 王建忠; 杨桂连; 石春卫; 李宁; 单宝龙; 谷魏; 王红
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2018-09-17
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-09-17
Also published as: CN109182184B

Abstract

本公开涉及一株犬源乳酸片球菌及其应用，该菌株的分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，编号为JLAPCC‑P76，已于2018年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC M 2018500。本公开以幼犬新鲜粪便为样品，从中筛选出特性优良的乳酸菌菌株，通过给断奶幼犬连续饲喂8周后，对其肠道形态结构、菌群和血液指标进行测定，评价其对幼犬消化吸收、肠道菌群和抗氧化性等方面的影响，同时，为评价所筛选乳酸菌对宠物幼犬应激症状的治疗效果，本公开给予长途运输后出现食欲不振、腹泻的应激幼犬灌服乳酸菌，观察其腹泻恢复和饮食恢复情况，以缓解宠物***易过程中常见的运输应激症状。

Description

一株犬源乳酸片球菌及其应用

技术领域

本公开属于微生物技术领域，具体涉及一株犬源乳酸片球菌及其应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

益生菌是当机体摄入适当的数量时，可以对宿主健康产生益生效果的一类活性微生物，菌株主要为乳杆菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属和片球菌属，常被制作成微生态制剂产品，用于解决动物饲养中遇到的部分难题。目前我国在册犬饲养数量已达7000万，对犬健康养殖提出了更高的需求，研究表明当犬使用益生菌时，益生菌可以提高犬机体免疫力，减轻应激反应，阻止肠道病原体引起的感染，促进生长发育，控制过敏性疾病等，为犬绿色、健康、生态养殖提供了新的思路。

优良菌株是犬用微生态制剂研发的基础，来源于宿主自身的益生菌被证明更加安全有效，但是目前用于犬用微生态制剂研发的益生菌菌株种类少且多数来自于人源益生菌，因此亟需筛选出具有益生功能且安全的犬源益生菌。

乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)是链球菌科片球菌属的一种革兰氏阳性球菌，镜下形态学观察为双球菌或四球菌，但不成链状排列，乳酸片球菌可以产生抑菌活性物质—乳酸片球菌素，乳酸片球菌素是一种耐高温(121℃仍具有活性)的蛋白质，可以抑制部分食源性致病菌，特别是对单核细胞增多症李氏杆菌抑制效果明显，因此乳酸片球菌及其发酵产物已被作为微生物防腐剂用作肉品、饲料和发酵食品的保存。

近期有研究者利用肠道微生物高通量测序技术对22种犬与5种灵长类动物对比发现，犬肠道中乳酸片球菌所占肠道益生菌比例(约0.8％)远高于灵长类动物且差异极显著，由此推测乳酸片球菌可能是人与犬益生菌构成的差异菌株，为丰富犬用微生态制剂菌种提供了新选择。

发明内容

针对上述背景技术，本公开以幼犬新鲜粪便为样品，从中筛选出综合性能优良的乳酸菌菌株，通过小鼠急性毒性试验，评价其安全性，在此基础之上，通过给断奶幼犬连续饲喂8周后，对其肠道形态结构、菌群和血液指标进行测定，评价其对幼犬消化吸收、肠道菌群和抗氧化性等方面的影响，同时，为评价所筛选乳酸菌对宠物幼犬应激症状的治疗效果，本公开给予长途运输后出现食欲不振、腹泻的应激幼犬灌服乳酸菌，观察其腹泻恢复和饮食恢复情况，以缓解宠物***易过程中常见的运输应激症状。

本公开采用如下技术方案：

在本公开的第一个方面，提供一株犬源乳酸片球菌，该菌株的分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，编号为JLAPCC-P76，已于2018年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC M 2018500。

在本公开的第二个方面，提供一种微生物混合物，其特点是至少包含本公开的菌株，所述微生物混合物还包含其他对犬具有益生功能的并与本公开菌株共生的微生物。

在本公开的第三个方面，提供了一种包含本公开菌株或本公开微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂的形式，所述菌剂的活性成分为本公开菌株，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。

在本公开的一个或一些实施方式中，该菌剂包括活性成分和载体，所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳的一种或多种；液体载体可以为植物油、矿物油或水。

在本公开的一个或一些实施方式中，所述产品为溶液形式、粉末形式、悬浮剂形式、颗粒形式或片剂形式。

在本公开的第四个方面，提供一种本公开的菌株、本公开的微生物混合物或者本公开的包含本公开菌株或本公开微生物混合物的产品在制备对幼犬具有益生功能和/或治疗幼犬运输应激症状的微生态制剂中的应用。

在本公开的一个或一些实施方式中，所述益生功能是指降低幼犬料重比，提高消化率和/或增加十二指肠隐窝深度和绒毛长度，增加空肠隐窝深和/或提高十二指肠和空肠中乳酸菌含量，降低空肠中大肠杆菌含量和/或提高血清、十二指肠和空肠中淀粉酶含量和/或提升血清总抗氧化能力。

在本公开的一个或一些实施方式中，幼犬运输应激症状包括长途运输后出现食欲不振和/或腹泻。

在本公开的第五个方面，提供了一种对幼犬具有益生功能和/或治疗幼犬运输应激症状的微生态制剂，其特点是：该微生态制剂包括所述的乳酸片球菌或所述的微生物混合物或所述的产品。

在本公开的一个或一些实施方式中，所述微生态制剂为颗粒形式、粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式或片剂形式。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)本公开乳酸片球菌R76消化道环境和高温环境存活率高、细胞黏附力强和在幼犬肠道内定植性能好，小鼠毒性试验检测为安全无毒无副作用，可以作为犬用微生态制剂候选菌株。

本试验结果表明乳酸片球菌R76生长条件为兼性厌氧，有氧条件和无氧条件生长速度差别不大，降低生产成本，更加有利于益生菌产业化发展，既可以适应肠道微氧环境生长繁殖，又可以工业生产中有氧条件下发酵降低生产成本。

(2)本公开乳酸片球菌R76具备以下益生功能：

可以降低幼犬料重比，提高消化率；增加十二指肠隐窝深度和绒毛长度，增加空肠隐窝深度；提高十二指肠和空肠中乳酸菌含量，降低空肠中大肠杆菌含量；提高血清、十二指肠和空肠中淀粉酶含量；提升血清总抗氧化能力。

(3)通过宠物店临床应用观察，乳酸片球菌R76灌喂运输应激幼犬可以提前2天恢复正常采食量，提前24小时停止腹泻。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1：R76号菌株革兰氏染色(100×)。

图2：16s PCR扩增结果，M:DL2000 marker；1:16s rRNA

图3：R76号菌株生长曲线

图4：幼犬十二指肠和空肠石蜡切片HE染色40×。

图5：乳酸片球菌对运输应激幼犬采食量恢复影响。

图6：乳酸片球菌对运输应激幼犬腹泻的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1 乳酸片球菌R76的分离鉴定及安全性评价

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品来源与培养基的配制

(1)样品来源：采样于长春市南关区某健康未断奶边境牧羊犬幼犬粪便。

(2)MRS液体培养基的配制

将试剂与1L蒸馏水混合，pH值调至6.8，115℃高压灭菌15min。

(3)MRS固体培养基：每100mL MRS液体培养基中加入1.5g琼脂粉，115℃高压灭菌15min。

1.1.2 试验动物

SPF级BALB/c小鼠30只，18g-22g，购自于北京华阜康公司(合格证No.11401300071553)。

1.1.3 试验主要试剂

1.2 方法

1.2.1 粪便样品中乳酸菌的分离

采集长春市南关区某健康未断奶边境牧羊犬幼犬粪便，4℃条件下于1小时内送至实验室，称取1g新鲜健康幼犬粪便加入9mL灭菌生理盐水，振荡混匀，离心后后取上清液100μL加入900μL PBS缓冲液，对上清液10倍比稀释(梯度稀释为10¹-10⁸)，各稀释梯度取100μL用玻璃棒均匀涂于MRS固体琼脂培养基平皿，37℃温箱培养12小时，选择适宜稀释梯度挑取单菌落于MRS液体培养基中活化2代后甘油保菌备用。

1.2.2 菌株的筛选

1.2.2.1 耐人工胃液菌株的筛选

取234mL浓盐酸溶液稀释至1000mL得到配制所需要的稀盐酸，配制人工胃液所需试剂及体积(质量)如下：

稀盐酸 16.4mL

胃蛋白酶 10.0g

蒸馏水 973.6mL

将方法1.2.1中分离得到的菌株取1mL的新鲜菌液置于1.5mL离心管中，6000r/min离心10分钟，弃上清液，加入配置好的人工胃液1mL，放置于37℃，100r/min摇床培养，2h后取100μL稀释后涂布于MRS固体培养基平皿计数，设置三次重复，按以下公式存活率：

1.2.2.2 耐人工胆盐溶液菌株的筛选

电子天平称取猪胆盐3.0g，量筒量取PBS缓冲液997mL，倒入烧杯后搅拌混匀，0.22μm滤膜过滤后得到无菌人工胆盐溶液，参照方法1.1.2.2，菌液经离心弃上清液后加入人工胆盐溶液1mL，2h后计算存活率。

1.2.2.3 耐人工小肠液菌株的筛选

电子天平分别称取磷酸二氢钾6.8g和胰蛋白酶10.0g，置于烧杯加蒸馏水定容至1000mL后使用磁力搅拌器混匀，0.22μm滤膜过滤后得到无菌人工小肠液，参照方法1.1.2.2，菌液经离心弃上清液后加入人工小肠液1mL，2h计算存活率。

1.2.2.4 耐高温菌株的筛选

将1mL新鲜菌液(10⁹CFU/mL)在60℃水浴锅中加热30min后，取100μL稀释后涂布于MRS固体培养基平皿计数，参照方法1.1.2.2中公式计算存活率。

1.2.2.4 肠道上皮细胞黏附能力的筛选

将Caco-2细胞置于含10％灭活胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基中，37℃条件下5％CO₂培养箱中培养，隔天换液，传代后将细胞移至6孔板中，当细胞长至2.5×10⁶个每孔时，加入无抗DMEM清洗3次，然后加入1mL分离菌株菌悬液(2.5×10⁷CFU/mL)和1mLDMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中粘附2h后，用无抗DMEM清洗3次，去除未粘附的细菌，加入胰酶消化细胞后取100μL稀释后涂布于MRS固体培养基平皿计数，计数结果即为菌株粘附数量。

1.2.3 候选菌株鉴定

1.2.3.1 候选菌株形态观察

选取方法1.1.2.2筛选出的菌株菌革兰氏颜色，步骤依次为涂片、火焰固定、结晶紫溶液染色(1min)、水洗、碘液媒染(1min)、水洗、95v/v％乙醇脱色(30s)、水洗、番红染色液复染(3min)、水洗，显微镜下观察颜色和形态。

1.2.3.2 候选菌株生化鉴定

选取方法1.2.2中筛选出的菌株，用接种针沾取菌液后穿刺细菌微量生化反应系列鉴定管(***糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖、海藻糖、乳糖、山梨醇、硝酸盐还原、葡萄糖和甘露醇)，37℃温箱24h，观察生化反应结果，观察结果依据《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定菌株。

1.2.3.3 候选菌株16s rRNA鉴定

选取方法1.2.2中筛选出的菌株，取5mL新鲜菌液，低速离心获得菌体，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤，提取候选菌株总DNA。

合成细菌16S rRNA保守性通用引物(27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，1429R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’)，引物由苏州金维智公司合成。

50μL PCR体系：

PCR反应条件(30次循环)：

PCR扩增产物回收后送长春库美公司测序，测序结果在NCBI网站Blast分析比对。

1.2.4 候选菌株(R76)生长性能及其pH值变化

选取方法1.2.2中筛选出的菌株新鲜菌液1mL，接种于100mL MRS液体培养基中，37℃温箱培养，设置有氧条件和无氧条件2个试验组，从0h至24h每2h无菌条件下取出菌液，测量不同时间点pH值变化和波长600nm时的吸光值(OD₆₀₀)。

1.2.5 候选菌株(R76)毒性试验检测

(1)菌液制备

选取方法1.2.2中筛选出的菌株新鲜菌液，经6000r/min离心10min后，弃上清液，用无菌PBS缓冲液冲洗沉淀三遍，用PBS缓冲液将其浓度调整为10¹⁰CFU/mL菌液，备用。

(2)动物试验

取30只BALB/c小鼠，随机分为六组，每组5只，小鼠笼和饮水瓶高压蒸汽消毒，定时更换垫料，自由饮水、采食。

接种后，连续7天观察食欲和精神状态，剖检观察各脏器是否正常，按以下公式计算脏器系数：

1.2.6 数据分析

试验所得数据使用Office Excel整理并计算，整理后的数据由SPSS 19.0统计分析(P＜0.05时为差异显著)，所得数据以平均值±标准差(mean±s)表示。

2 结果

2.1 粪便样品中乳酸菌的分离结果

粪便稀释后各梯度涂布于MRS固体培养基平皿，在37℃温箱培养12h后，观察到10⁶稀释倍数菌落密度和大小适中，共挑取160株单菌落，将菌株编号(R1-R160)，活化2代，甘油冷冻保菌(-80℃)。

2.2 菌株的筛选结果

试验筛选到编号为R76，R80，R112，R114的四株菌在人工胃液和胆盐溶液的条件下存活率均大于60％，其中R76人工胃液和胆盐溶液环境下存活率分别为80.95％和74.37％，高于其它三株且差异显著(P<0.05)；R76耐高温存活率为85.83％，与R112差异不显著(P>0.05)，但高于R80和R114且差异显著(P<0.05)；小肠溶液对菌株的影响率不大，R76耐人工小肠液存活率为98.55％，与R80和R114差异不显著(P>0.05)，但高于R112且差异显著(P<0.05)；R76肠道上皮细胞粘附计数为103.67×10⁶CFU，高于分离得到的其它菌株且差异显著(P<0.05)。综合分析消化道环境和高温环境下所得数据选择R76作为后续试验的候选菌，结果见表1-1。

表1-1 菌株的筛选结果

注：在同一行标注不同字母表示组间显著差异(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下表标注相同。

2.3 鉴定结果

2.3.1 形态学观察结果

对筛选得到的R76号菌株革兰氏染色后显微镜下观察颜色为紫色，判断为革兰氏阳性菌；形状为双球对称相联或四球对称相联，结果见图1。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》初步断定为片球菌属。

2.3.2 生化鉴定结果

对筛选到的R76号菌株使用细菌微量生化反应系列鉴定管观察生化反应结果，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》断定为乳酸片球菌，结果见表1-2。

表1-2 R76号菌株生化鉴定结果

注：表中“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性

2.3.3 16s rRNA鉴定结果

PCR扩增产物经凝胶电泳鉴定，在1500bp处有条带(见图2)，符合16s rRNA长度(1467bp)，产物经过胶回收，送基因公司测序。测序结果在NCBI Blast比对后，与GenBank数据库中乳酸片球菌(菌株编号LC274607.1)同源性为99％，综合三种鉴定方法鉴定R76号菌株为乳酸片球菌。

2.4 候选菌株(R76)生长性能及其pH值变化

将R76菌株接种于培养基后，每2h记录有氧条件下和无氧条件下OD₆₀₀值，以发酵时间为横轴，以OD₆₀₀值为纵轴，绘制生长曲线图。试验结果表明R76号菌株在有氧条件和无氧条件下均可生长，菌株接种培养基后延迟期约为1h，在培养2h后进入对数生长期；培养6h后，生长速度降低，但仍缓慢生长；有氧条件下9小时到达稳定生长期，无氧条件下10小时到达稳定生长期，有氧条件更适宜菌株生长，结果见图3。

以发酵时间为横轴，以pH值为纵轴，绘制pH值生长变化图，试验结果表明菌液pH变化趋势与生长曲线基本相符，即2h至6h菌液pH下降速度较快，6h至8h菌液pH下降速度缓慢，8h后菌液pH值基本保持4.55不变，结果见图4。

2.5 候选菌株(R76)毒性试验检测结果

将菌液用三种不同方式接种小鼠后，在试验的7天时间内每日观察小鼠，试验组小鼠精神状态表现良好，饮食和饮水均正常；第7日剖检小鼠，发现小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、(左右)肾脏没有发生病变，称重后计算脏器系数，试验组和空白组各脏器系数对比分析，差异均不显著(p>0.05)，结果见表1-3。

表1-3 小鼠脏器系数比较

3 讨论

优良菌株是犬用微生态制剂的研发基础，宿主自身来源的益生菌已被证明对宿主更加安全有效，但目前我国犬用微生态制剂的益生菌菌株多数来自于人源益生菌，因此亟需筛选出具有益生功能且安全的犬源益生菌。本试验选取未断奶幼犬粪便作为筛选样品，未断奶幼犬肠道菌群出现于胚胎，断奶前肠道菌群主要受母乳影响，可以排除幼犬食用含益生菌的商品化犬粮对筛选造成的干扰，达到筛选犬源乳酸菌的目的。

常见的犬用益生菌菌属为乳酸菌、芽孢杆菌和双歧杆菌，本实验选择益生菌中的乳酸菌作为筛选对象，利用MRS培养基分离菌株。口服益生菌后，充足数量的活菌到达肠道是发挥益生功能的基础，益生菌是否粘附于肠道粘膜则是其发挥益生功能的前提。Perelmuter等人对来源于犬的乳酸菌研究表明，消化道中的酸和胆盐都会对菌株的存活率产生巨大的影响，而Biourge等对犬用微生态制剂研究也表明，益生菌在某些生产工艺流程会不可避免的产生短暂高温导致其数量和活性下降，在运输和销售中严格控制温度也会增加额外成本，因此本试验模拟消化道环境(胃液、胆盐、小肠液和肠上皮细胞)和高温环境筛选菌株，确保菌株能够以有效浓度直达和定植于肠道并具有工业生产、运输和销售的潜力。

在分离得到菌株中，筛选出R76号菌株特性最优经鉴定为乳酸片球菌，利用传统鉴定技术(革兰氏染色镜检和生理生化鉴定)与基因鉴定技术(16S rRNA)交叉印证，结果准确率更高。现有研究表明犬肠道中乳酸片球菌所占肠道益生菌比例(约0.8％)远高于灵长类动物且差异极显著，由此推测乳酸片球菌可能是人与犬益生菌构成的差异菌株。

肠道环境通常为无氧或微氧条件，能在无氧或微氧条件下生长繁殖是菌株发挥益生功能的基础，但无氧或微氧条件会增加生产成本，不利于益生菌产业化发展。本试验结果表明乳酸片球菌生长条件为兼性厌氧，有氧条件和无氧条件生长速度差别不大(约1小时)，既可以适应肠道微氧环境生长繁殖，又可以工业生产中有氧条件下发酵降低生产成本。

益生菌菌株安全、无副作用是其商业化开发的前提，依据《新饲料和新饲料添加剂管理办法》，农业部以国内外大量研究成果为基础，对常用益生菌临床安全性评价后，公布了《饲料添加剂品种目录》，目录中含有乳酸片球菌且方式为直接添加，本实验通过高浓度菌液灌喂、皮下注射和腹腔注射观察7天，均未发现小鼠异常，脏器系数差异不显著，毒性试验结果初步表明安全。

4 小结

本试验从未断奶幼犬粪便中分离出160株乳酸菌，经体外模拟消化道、高温环境和肠上皮细胞粘附试验，对菌株存活率和黏附率统计分析，筛选出一株消化道环境和高温环境存活率高、细胞黏附力强的优良乳酸菌，经形态学观察、生化鉴定和16s rRNA三种方法鉴定为乳酸片球菌，小鼠毒性试验检测为安全无毒无副作用，可以作为犬用微生态制剂候选菌株，并将R76进行保藏，保藏信息为：该菌株的分类命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，编号为JLAPCC-P76，已于2018年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC M 2018500。

实施例2 乳酸片球菌对幼犬肠道形态结构、菌群和血液指标的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本公开中保藏的乳酸片球菌R76。

1.1.2 试验动物和管理

20只断奶健康幼犬(60日龄)，每日喂食2次幼犬犬粮(营养成分见表2-1)，饮水自由，每日清洁犬舍。

表2-1 幼犬犬粮营养成分表

1.1.3 实验主要试剂

1.2 方法

1.2.1 乳酸片球菌对幼犬生长性能的影响

20只断奶健康幼犬随机分组，设置灌服乳酸片球菌制剂试验组和灌服PBS缓冲液对照组(分组及口服剂量见表2-2)，每日灌服一次，连续灌服56天，观察每日精神状态，每日准确记录每只幼犬的采食量；幼犬每7天空腹记录体重，所得数据计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。对计算结果统计分析。

表2-2 幼犬分组及口服剂量表

1.2.2 乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠形态结构的影响

为了探究乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠形态结构的影响，在幼犬饲养56天时，剪取十二指肠和空肠肠段各2.0cm，用生理盐水漂洗，4％多聚甲醛常温固定3天，制作石蜡组织切片(见表2-3中步骤1-18)，组织切片H E染色后Leica显微镜观察(见表2-3中步骤19-40)。使用Leica LAS X软件测量切片中绒毛长度，隐窝深度。对测量结果统计分析。

表2-3 石蜡组织切片制作和染色方法

1.2.3 乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠菌群的影响

为了探究乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠菌群的影响，在幼犬饲养56天时，取十二指肠和空肠肠段内容物各1.0g，在超净工作台中使用无菌生理盐水，倍比稀释后取适当梯度稀释液，分别均匀涂于麦康凯固体培养基平皿、MRS固体培养基平皿、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)固体培养基平皿和BBL培养基平皿，分别用于统计大肠杆菌、乳酸菌、沙门氏菌和双歧杆菌数量。对试验结果统计分析。

1.2.4 乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠中消化酶的影响

为了探究乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠中消化酶的影响，在幼犬饲养56天时，取十二指肠和空肠肠段肠道内容物，利用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中淀粉酶(AMY)的水平。详细步骤见表2-4。对检测数据统计分析。

表2-4 ELISA测定淀粉酶含量详细步骤

蛋白酶(T-Pro)、胰蛋白酶(LPS)和脂肪酶(TRY)含量测定方法同淀粉酶。

1.2.5 乳酸片球菌对幼犬血液生化指标的影响

血清中含有多种离子、酶类、脂类等物质，是动物健康水平的评价标准之一。本试验使用SMT 100全自动生化分析仪对血液样品进行检测，分析乳酸片球菌对幼犬血液生化指标的影响。

1.2.6 乳酸片球菌对幼犬血清抗氧化能力的影响

为了评价乳酸菌对幼犬机体清除自由基的能力，本试验利用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对饲喂后幼犬血清抗氧化能力进行了检测，分别测定血清样品中总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物歧化酶(SOD)的水平。测定方法参照2.1.2.4。对检测数据统计分析。

1.2.7 数据分析

数据分析参照方法实施例1中1.2.6。

2 实验结果

2.1 幼犬生长性能的影响

乳酸片球菌饲喂幼犬试验组与对照组相比，料重比降低了30.93％且差异显著(P<0.05)，实验结果表明乳酸片球菌可以提高幼犬对犬粮的消化能力，从而提升幼犬生长性能，结果见表2-5。

表2-5 幼犬生长性能的影响

2.2 幼犬十二指肠和空肠形态结构的影响

对犬十二指肠和空肠石蜡切片HE染色后，显微镜(40×)观察发现小肠形态结构完整(见图4)，但通过Leica LAS X软件测量切片中绒毛长度和隐窝深度，发现十二指肠绒毛长度增加了33.7％，隐窝深度增加了42.76％；试验组幼犬空肠隐窝深度增加了17.79％，但绒毛长度差异不显著(P>0.05)，实验结果表明乳酸片球菌可以增加肠道与食物的接触面积，具有提升犬消化率的功能，结果见表2-6。

表2-6 幼犬十二指肠和空肠绒毛长度和隐窝深度的影响

2.3 幼犬十二指肠和空肠菌群的影响

试验组与对照组相比，十二指肠中乳酸菌含量提高了1.50％；空肠中大肠杆菌含量降低了1.58％，乳酸菌含量升高了1.26％，实验结果表明乳酸片球菌具有调节肠道菌群的益生功能，结果见表2-7。

表2-7 幼犬十二指肠和空肠菌群的影响

2.4 乳酸片球菌对幼犬十二指肠和空肠中消化酶的影响

试验组与对照组相比，十二指肠和空肠中淀粉酶含量分别增多了3.07％和1.82％；十二指肠和空肠中总蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶含量差异不显著(P>0.05)，实验结果表明乳酸片球菌可以提升肠道水解淀粉的能力，具有提升淀粉消化率的功能，结果见表2-8。

表2-8 幼犬十二指肠和空肠淀粉酶的影响

2.5 幼犬血液生化指标的影响

试验组与对照组相比，血清中淀粉酶含量增多了30.26％；血清中白蛋白、球蛋白、白球比、天门冬氨酸氨基转移酶等生化指标含量差异不显著(P>0.05)，实验结果表明乳酸片球菌可以提升血液水解淀粉的能力，具有提升淀粉消化率的功能，结果见表2-9。

表2-9 幼犬血液生化指标的影响

2.6 幼犬血清抗氧化能力的影响

试验组与对照组相比，血清中总抗氧化能力提高了3.63％；血清中超氧化为歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛含量差异不显著(P>0.05)，实验结果表明乳酸片球菌可以提升血清总抗氧化能力，从而减少机体活性氧的产生，结果见表2-10。

表2-10 幼犬血清抗氧化能力的影响

3 讨论

20世纪40年代起，许多益生菌(以乳酸杆菌研究和使用居多)被应用于动物饲养，并被证明具有提升生长性能的效果。乳酸片球菌也是益生菌的一种，目前应用于犬的研究还很少，本试验尝试对幼犬每日口服10⁹CFU/mL乳酸片球菌菌液，试验结果表明试验组料重比显著降低，幼犬消化吸收犬粮能力增强，目前尚无乳酸片球菌饲喂幼犬提高消化率的相关研究，本公开筛选得到的乳酸片球菌R79具有提高幼犬的消化能力的益生功能。

目前尚无乳酸片球菌改变幼犬绒毛长度和隐窝深度形态结构的相关研究，本试验结果表明乳酸片球菌可以显著加深幼犬十二指肠和空肠隐窝深度，显著增长十二指肠绒毛长度。

淀粉酶是一类水解淀粉和糖原酶类物质的总称，犬驯化于土狼，肠道形态结构相似度更趋于肉食动物，先天分泌淀粉酶的能力较低，断奶幼犬更是由于消化腺发育不成熟，淀粉酶分泌量更加有限，当摄取碳水化合物为主的犬粮时，出现消化率降低，本试验幼犬血清、十二指肠和空肠中淀粉酶含量显著升高，有助于幼犬消化吸收。目前关于乳酸片球菌提升机体消化酶含量的相关研究极少。

动物肠道中乳酸菌含量被认为是指示肠道健康的主要菌群，动物肠道中机会致病菌增多(如大肠杆菌和沙门氏菌)则是动物腹泻病的重要指征，本试验显示试验组十二指肠和空肠中乳酸菌显著增加，空肠中大肠杆菌数量显著降低。

动物机体中的需氧细胞在新陈代谢过程中，会产生不稳定且高活性的活性氧物质(如-O₂ ^-、NO、-OH等)，这些活性氧物质将会损坏机体的蛋白质、脂类物质和脱氧核糖核酸，也可以间接阻碍细胞信号传导、加快细胞凋亡、滞碍基因表达，从而损害机体健康。本试验结果表明试验组血清抗氧化能力显著提升，筛选得到的乳酸片球菌饲喂幼犬具有提升抗氧化能力的益生效果。

幼犬正处于生长发育的关键期，此阶段幼犬由于消化***发育不成熟、肠道菌群尚不稳定、机体抗氧化能力不强，造成对营养物质吸收能力有限，肠道菌群失调和活性氧物质集聚过多等症状，对幼犬健康饲养带来极大挑战。本研究筛选得到的乳酸片球菌经动物试验证明具有提高消化能力、调节肠道菌群和提升总抗氧化能力等益生功能，可以解决幼犬饲养中面临的部分问题，具备开发为犬用微生态制剂的基础。

4 小结

本试验通过幼犬口服乳酸片球菌(R76)菌液试验结果表明具备以下益生功能：

(1)可以降低幼犬料重比，提高消化率；

(2)增加十二指肠隐窝深度和绒毛长度，增加空肠隐窝深度；

(3)提高十二指肠和空肠中乳酸菌含量，降低空肠中大肠杆菌含量；

(4)提高血清、十二指肠和空肠中淀粉酶含量；

(5)提升血清总抗氧化能力。

实施例3 犬源乳酸片球菌对缓解幼犬运输应激效果的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本公开中保藏的乳酸片球菌R76。

1.1.2 试验动物和管理

长春某宠物店收购一批断奶幼犬，经汽车长途运输后有20只出现应激反应，主要表现为采食量减少和严重腹泻，随机分组，设置灌服乳酸片球菌菌液试验组和灌服PBS缓冲液对照组(分组及口服剂量见表3-1)，每日灌服一次，运输应激幼犬喂食相同幼犬犬粮，每日清洁犬舍，饮水自由。

表3-1 幼犬分组及口服剂量表

1.2 方法

1.2.1 乳酸片球菌对运输应激幼犬采食量恢复的影响

试验组幼犬每日清晨灌服相同剂量的乳酸片球菌菌液(1×109CFU/mL，1mL/只)，对照组相同时间灌服PBS缓冲液(1mL/只)，连续灌服10天，观察精神状态，准确记录试验组和对照组幼犬的的日采食量，统计分析后绘制采食量变化图。

1.2.2 乳酸片球菌对运输应激幼犬腹泻的影响

动物腹泻相关研究通常将动物粪便形态外观作为最直观的评价标准，本试验参考Hu等人研究成果设置幼犬粪便评分标准(见表3-2)，每12小时对幼犬粪便根据5分法评分，连续观察96小时，所得数据绘制粪便评分变化图。

表3-2 幼犬粪便评分标准

2 实验结果

2.1 乳酸片球菌对运输应激幼犬采食量恢复的影响

幼犬由于运输和换粮产生应激反应采食量变少，第一天试验组与对照组只有恢复后平均日采食量的36.21％和36.57％，试验组与对照组在第二天起采食量开始提高但差异不显著(P>0.05)，第三天到第五天试验组采食量与对照组相比差异显著提高(P<0.05),试验组于第四天基本恢复正常，比对照组提前2天恢复采食，数据见图5。

2.2 乳酸片球菌对运输应激幼犬腹泻的影响

灌服乳酸片球菌制剂12h时，试验组与对照组粪便平均评分均为4分左右且差别不显著(P>0.05)，判定为中度腹泻；在36h时试验组粪便平均评分为2.1分而对照组粪便平均评分为3.1分，判定试验组***基本恢复正常而对照组为轻度腹泻；对照组粪便平均评分在60h时降低到2分，判定试验组***基本恢复正常，试验组比对照组提前24小时停止腹泻，试验结果表明乳酸片球菌可以加快应激幼犬的腹泻恢复，数据见图6。

3 讨论

随着交通的日益便利和宠物经济的快速发展，宠物犬跨地区运输售卖已成常态，目前宠物经济的运输方式主要为汽车，为了吸引顾客犬龄通常为1月龄(断奶前后)，宠物店在汽车长途运输幼犬时，往往受到多种外界因素影响，如缺水、拥挤、高温、颠簸和陌生环境等因素，这些应激源单独或重叠作用于幼犬所造成的影响，通常称为运输应激。运输应激幼犬，主要临床表现为精神萎靡，采食量减少和腹泻，但通常一星期左右可自行恢复。本试验选取的幼犬为经长途运输出现运输应激症状的幼犬，幼犬表现为厌食和腹泻，增加了宠物从收购到售卖的周期。

运输应激是宠物店收购幼犬的常见问题，经过长途运输，当应激强度超过幼犬自身调节能力时，幼犬往往出现腹泻症状。运输前后饮食的差异也是产生运输应激的重要因素之一，本试验中的宠物店在收购幼犬后饲喂犬粮无法保证与收购前相一致，幼犬对新配方的犬粮的不耐受加重了运输应激的症状。本试验应用结果显示使用犬源乳酸片球菌可以加速运输应激幼犬日采食量的恢复。

本试验将筛选得到的乳酸片球菌应用于运输应激幼犬后，观察到对采食和腹泻恢复效果显著，有助于缩短宠物店收购销售周期，减少运输应激造成的经济损失，但本试验仅在临床应用中观察到具有缓解运输应激的效果，开发为治疗运输应激的犬用微生态制剂前，仍需深入探究其作用机制。

4 小结

通过宠物店临床应用观察，乳酸片球菌灌喂运输应激幼犬可以提前2天恢复正常采食量，提前24小时停止腹泻。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一株犬源乳酸片球菌，其特征是：该菌株的分类命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，编号为JLAPCC-P76，已于2018年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC M 2018500。

2.一种微生物混合物，其特征是：至少包含权利要求1所述的乳酸片球菌。

3.包含权利要求1所述的乳酸片球菌或权利要求2所述的微生物混合物的产品。

4.如权利要求3所述的产品，其特征是：所述产品为溶液形式、粉末形式、悬浮剂形式、颗粒形式或片剂形式。

5.如权利要求3所述的产品，其特征是：产品为菌剂的形式，该菌剂包括活性成分和载体，所述载体为固体载体或液体载体；所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳的一种或多种；液体载体为植物油、矿物油或水。

6.权利要求1所述的乳酸片球菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的产品在制备对幼犬具有益生功能和/或治疗幼犬运输应激症状的微生态制剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是：所述益生功能是指降低幼犬料重比，提高消化率和/或增加十二指肠隐窝深度和绒毛长度，增加空肠隐窝深和/或提高十二指肠和空肠中乳酸菌含量，降低空肠中大肠杆菌含量和/或提高血清、十二指肠和空肠中淀粉酶含量和/或提升血清总抗氧化能力。

8.如权利要求6所述的应用，其特征是：幼犬运输应激症状包括长途运输后出现食欲不振和/或腹泻。

9.一种对幼犬具有益生功能和/或治疗幼犬运输应激症状的微生态制剂，其特征是：该微生态制剂包括权利要求1所述的乳酸片球菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的产品。

10.如权利要求9所述的微生态制剂，其特征是：所述微生态制剂为颗粒形式、粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式或片剂形式。