发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷,为了解决设施蔬菜土传病害化学防治中的环境安全问题,提供一种分离的棘孢曲霉菌株及其在土传病害防治中的应用。
本发明的技术方案如下所述:
申请人于2017年7月,在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的地块,从设施蔬菜作物根际土壤中分离筛选得到一种拮抗真菌,申请人将该菌株命名为棘孢曲霉Aa19,Aspergillus aculeatus Aa19,于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏编号为CCTCC NO:M 2018648。
棘孢曲霉Aa19的菌学特征:
棘孢曲霉Aa19菌株在PDA培养基平板上生长迅速,28℃培养5d菌落直径达6cm,质地紧密,呈丝绒状,气生菌丝较多,中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状,背面中心呈黄色四周白色,菌落表面有黑色干粉,无渗出液,顶囊初生时呈球形或辐射状,后呈球形或椭圆形,直径50-65μm,孢梗茎无色或淡褐糙有刺突,直径约5μm,串生于小梗顶端,小梗单层,全部表面可育。
上述分离的棘孢曲霉Aa19菌株可在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用。
本发明还提供了棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用的具体步骤,所述的步骤包括:
A.以豇豆枯萎病菌JWS-1作为指示菌
用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)JWS-1,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2014314;
B、棘孢曲霉Aa19的拮抗活性稳定性的测定
在PDA培养基平板上对保藏编号为CCTCC NO:M 2018648的棘孢曲霉Aa19进行了连续10代的继代培养,以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌,采用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性;
C、棘孢曲霉菌株Aa19孢子悬浮液活性的测定
取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种,加入5mL无菌水,轻轻将琼脂表面的孢子刮下,将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内,充分振荡混匀后,用无菌纱布过滤,并用无菌水冲洗滤渣2-3次,最终使滤液达到10mL,即为10-1孢子悬液,血球计数法在显微镜下检查孢子数,并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5,分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上,在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1,以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照,每处理3次重复,28℃恒温培养5d,测量菌落直径,明确棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性;
D、棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性的测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝,接种于50mL的PD培养基,180rpm/min、28℃恒温振荡培养5d,用四层无菌纱布过滤后,分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上,在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1,以仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1为对照,每处理3次重复,28℃恒温培养5d,测量菌落直径,明确棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性;
E、活体盆栽
将种子用55℃温水浸泡30min,清水清洗干净后播种,当幼苗长齐2片真叶时拔出,抖落根部土壤,用清水冲洗干净根系,剪去根尖部分,浸入含孢子2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min,再移植到营养钵内,置于大棚内培养,在接种病原菌7d后做如下处理:用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株,以清水灌根8mL/株为对照,7d后进行第1次调查,14d后进行第2次调查(在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理);
每处理3次重复,每重复10株,按时统计幼苗发病情况,按病情分级(参照张衍荣等,2005年报道),计算病情指数和防治效果,计算公式如下;
PDA培养基及制备方法:去皮马铃薯200g,切成厚约2mm的片,加入1000mL蒸馏水煮沸30min,用4层纱布过滤,向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g,加热溶解后再补足蒸馏水至1000mL,自然pH,在121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min,之后在超净工作台上倒平板,得到PDA培养基;
PD培养基及制备方法:称取200g马铃薯,洗净去皮切片,加水1000mL煮沸15min,纱布过滤后加蒸馏水补足至1000mL,再加12g葡萄糖,煮沸至固体充分溶解后分装到三角瓶中,于121℃湿热蒸汽下高压灭菌20min,得到PD培养基。
本发明具有以下有益效果:
1、棘孢曲霉Aa19从设施蔬菜根际土壤分离获得,对蔬菜作物安全,且对豇豆枯萎病具有防治作用,可用于设施蔬菜土传病害的防治。
2、棘孢曲霉Aa19稳定性好,防效较高,连续10代继代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1抑菌效果稳定在68%以上,田间盆栽防效达到69.43%,适合设施蔬菜土传病害防治要求。
3、棘孢曲霉Aa19防治设施蔬菜土传病害,使用方法简单,只需将菌株进行发酵培养,然后取发酵滤液对作物灌根即可,使用方便。
具体实施方式
实施例1候选菌株的分离与鉴定
A、土样的采集
2017年7月在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖基地土传病害发生严重的地块,采用5点取样法,取地下15-20cm处土样,采集设施蔬菜作物根际土壤,自然风干后保存备用;
B、候选菌株的分离纯化
称取5g土样倒入三角瓶中,加无菌水至50mL,28℃振荡30min后静置,即为10-1土壤悬液;再从上述溶液中取出1mL,加入9mL无菌水充分振荡制成10-2的土壤稀释液,吸取100μL稀释液涂于马丁氏培养基(配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,K2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g,孟加拉红0.03g,琼脂20g,加蒸馏水定容至1L,自然pH,分装后121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min),使用时每mL培养基中加入30μg链霉素以抑制放线菌生长,置于28℃培养箱中培养,生长5天后挑取单菌落于培养基上,进行分离纯化,4℃保存备用;
C、候选菌株形态学观察
将候选菌株接种到PDA培养基平板上,置于28℃恒温培养,观察菌落形态和颜色,5d后制作玻片在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征。
菌学特征:
候选菌株在PDA培养基平板上,生长迅速,28℃培养5d菌落直径达6cm,质地紧密,呈丝绒状,气生菌丝较多,中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状,背面中心呈黄色四周白色,菌落表面有黑色干粉,无渗出液,顶囊初生时呈球形或辐射状,后呈球形或椭圆形,直径50-65μm,孢梗茎无色或淡褐糙有刺突,直径约5μm,串生于小梗顶端,小梗单层,全部表面可育。
D、菌丝收集
用接种针挑取少量候选菌株的菌丝,在无菌条件下接种至装有100mL PD培养基的三角瓶内,于28℃,180rpm/min下振荡培养4d,取10mL上述菌液至无菌离心管内,于13000rpm/min离心10min,弃上清收集菌丝备用。
E、基因组DNA的提取
采用OMEGA HP Fugal DNA Kit试剂盒提取候选菌株基因组DNA,利用通用引物ITS1/ITS4对候选菌株的18s rDNA的ITS片段进行扩增(PCR为常规方法),引物序列为ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(PCR方法为常用方法)。
F、测序
采用1.0%琼脂糖凝胶法对扩增产物进行检测,并用紫外凝胶成像***进行拍照保存,将PCR扩增得到的产物直接送武汉擎科创新生物技术有限公司进行测序。
G、分子鉴定
将测序所得的序列在NCBI BlAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库中进行比对,确定待鉴定菌株(即候选菌株)的遗传来源,利用MEGA6.0.6软件与已知菌种ITS序列作序列同源性比较,并对检索获得的同源性较近的菌株采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建***发育树(Boot-strap=1000,见图2),分析亲缘关系和***发育,结合微生物形态分类鉴定,将分离株(即候选株)命名为棘孢曲霉Aa19,Aspergillus aculeatus Aa19,于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏编号为CCTCC NO:M2018648。
实施例2棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用
实施步骤如下所述:
A、棘孢曲霉Aa19菌株的稳定性测定
在PDA培养基平板上对筛选得到的棘孢曲霉Aa19进行连续10代的继代培养,并每一代以豇豆枯萎病菌JWS-1(JWS-1于2014年7月3日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC NO:M 2014314,该菌株已获中国发明专利授权,专利号为ZL 2014103340109,授权公告日为2016.02.17)为指示菌,利用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性;
结果表明,棘孢曲霉Aa19连续10代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率稳定在68%以上,结果见表1。
表1棘孢曲霉Aa19的拮抗活性稳定性
B、棘孢曲霉Aa19菌株孢子悬浮液活性测定
取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种,加入5mL无菌水,轻轻将琼脂表面的孢子刮下,将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内,充分振荡混匀后,用无菌纱布过滤,并用无菌水冲洗滤渣2-3次,最终使滤液达到10mL,即为10-1孢子悬液,血球计数法在显微镜下检查孢子数,并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5,分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上,中央接豇豆枯萎病菌JWS-1,以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照,每处理3次重复,28℃恒温培养5d,测量菌落直径;
结果表明,棘孢曲霉Aa19孢子悬液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制作用随稀释倍数的增加而降低,由84.32%降至64.33%,在最低浓度时其抑制率均超过60%,具体数据见表2。
表2棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性
C、棘孢曲霉Aa19菌株发酵滤液活性的测定
用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝,接种于50mL的PD培养基中,在180rpm/min,28℃恒温下振荡培养5d。用四层无菌纱布过滤后,分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上,在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1,以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照,每处理3次重复,28℃恒温培养5d,测量菌落直径。
结果表明,棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率为70.75%,结果见表3。
表3棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌的抑制作用
D、棘孢曲霉Aa19活体盆栽试验
将市购豇豆种子用55℃温水浸泡30min,清水清洗干净后播种,当幼苗长齐2片真叶时拔出,抖落根部土壤,用清水冲洗,得到干净根系,剪去根尖部分,浸入含孢子数为2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min,再移植到营养钵内,置于大棚内培养,在接种豇豆枯萎病菌JWS-1菌液7d后做如下处理:用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株,以清水灌根8mL/株做为对照,7d后进行第1次调查,14d后进行第2次调查,在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理。
每处理3次重复,每重复10株。按时统计幼苗发病情况,按病情分级(参照张衍荣等,2005年报道),计算病情指数和防治效果,公式如下;
豇豆枯萎病病情分级标准:(张衍荣等,2005年报道)
0级:无症状;
1级:胚轴或子叶出现轻微病症,但生长正常;
3级:胚轴或子叶出现明显坏死,或1片子叶黄化,影响生长;
5级:2片子叶黄化,或1片子叶枯死;
7级:2片子叶生长僵化,植株部分萎蔫或停止生长;
9级:整株萎蔫、倒伏或枯死;
采用浸根接种法测定棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)对豇豆枯萎病防效,结果表明,7d时对豇豆枯萎病的防治效果为100%,14d时为69.43%,具体数据见表4。
表4棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防效
本实施例验证表明,本发明得到的棘孢曲霉Aa19具有较强的稳定性,较高的孢子悬浮液活性和发酵滤液的活性,防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病具有积极效果。
序列表
<110> 武汉友芹种苗技术有限公司
<120> 一种棘孢曲霉菌株及其应用
<141> 2018-09-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(630)
<400> 1
gagagccggg tcgggggggg gaccctgcgg agggatcatt acggagaact tccgttaggg 60
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