CN114561296B - 一种棘孢曲霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种棘孢曲霉菌及其应用，属于微生物技术领域。该棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL‑0044，已于2021年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23267。本发明菌株及其培养物与提取物对4株植物病原真菌——甘蔗黑斑病、苹果轮纹病菌、玉米大斑病菌、橘红褐斑病病原菌，具有显著的抑制效果，应用前景广泛，易于推广应用。

Description

一种棘孢曲霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌及其应用。
背景技术
曲霉属 (Aspergillus)有180多个种，蕴藏着丰富的生物碱、萜类、类固醇、多聚乙酰和氧杂蒽酮等化合物，这些化合物有着抗微生物、防污损、拒食活性和植物毒素等有趣的活性。棘孢曲霉是一种丝状真菌，是曲霉属下的一种黑曲霉（Aspergillus Niger）。
甘蔗黑斑病是一种由黑粉菌（Ustilago scitaminea Syd.）引起的世界性病害，也是危害我国甘蔗生产的最主要真菌性病害。黑斑病在我国各植蔗省区普遍发生，尤其在旱地甘蔗和宿根蔗上更为严重，有些蔗田的发病率高达80%-90%，严重影响了甘蔗产业的可持续发展。
苹果轮纹病是由苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）引起的我国苹果生产中的主要病害之一，该病害在我国各大苹果主产区发生普遍，且在果实储藏期仍可持续发病，严重影响了苹果产业的健康发展。
玉米大斑病是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米叶部病害，受病菌侵染后植株叶片先出现水渍状斑点，之后沿叶脉向两端扩展形成典型梭状病斑，严重影响叶片光合作用。在高湿度及中等温度条件下发生，感病品种严重感染时可致作物减产达50%以上，甚至绝收。
柑橘褐斑病是一种由真菌Alternaria alternate引起的落叶性病害，病菌主要危害嫩叶、新梢和幼果（对高感病品种，果实整个生育期均可受害），引起落叶、落果和枯梢，未脱落果实也因果面病斑无法上市鲜销。感病植株的果实从刚坐果一直到采果前都可能被感染并导致严重落果。
近年来，化学农药对环境的污染日益受到重视，人类对健康的关注逐步提升，开发与环境和谐的、低毒的甚至无公害的新型农药成为一种趋势。目前，以植物和微生物为来源的杀虫、抑菌剂已经成为现代农药开发的热点。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种棘孢曲霉，该菌株具有易于培养、产量高、培养性状稳定等的特点，其培养物对上述4株植物病原真菌具有较高的抑菌活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044，已于2021年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23267。
本发明同时提供所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044在制备抑菌剂中的应用。
进一步，优选的是，所述的抑菌剂抑制的真菌包括甘蔗黑斑病、苹果轮纹病菌、玉米大斑病菌、橘红褐斑病病原菌。
进一步，优选的是，所述的抑菌剂中的活性成分包括所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物。
进一步，优选的是，所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物为液体培养物；
其培养方法为：将棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；
配制PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入PDB液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；
所述PDA斜面培养基含有：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2；
所述PDB液体培养基含有：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
本发明还提供所述的所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物。
本发明另外提供所述的所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物在制备抑菌剂中的应用，其特征在于，所述的抑菌剂中的活性成分包括棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物的提取物；所述的提取物以棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物为原料经有机溶剂萃取获得。
进一步，优选的是所述有机溶剂为乙酸乙酯。
本发明并且提供所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物的提取物。
本发明所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物还可以以棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044为原料，以本领域常规的PDA培养基、PDB培养基等进行培养获得。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明提供了一种棘孢曲霉菌及其应用，本发明棘孢曲霉菌XL-0044的液体培养物对于甘蔗黑斑病(NB-01，Ustilago scitaminea Syd.)、苹果轮纹病菌(NB-03，Botryosphaera dothidea)、玉米大斑病菌(NB-06，Setosphaeria turcica)、橘红褐斑病病原菌(YB-05，Alternaria alternata)这4株真菌具有显著的抑制作用，其液体培养物的粗提物的最小抑菌浓度（MIC）可达到12.5ug/ml，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为棘孢曲霉菌XL-0044的单菌落形态图(PDA平板)；其中，图1-A为平板正面图；图1-B为平板背面图；
棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044，已于2021年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23267，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1 棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044的来源及鉴定
①棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044的来源
2016年10月13日从重庆大学校园采摘的金边六月血中分离到一株真菌，命名为XL-0044。
②XL-0044的鉴定
XL-0044的ITS测序序列见序列表（SEQ ID NO.1），与Sequence ID: MW392046.1的序列相似性最高，相似性为99.45％。
根据以上鉴定结果，XL-0044属于棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)。
实施例2棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044的主要形态特征
将棘孢曲霉菌XL-0044接于PDA培养基上，28℃培养3天，菌落直径达6cm，菌落质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层。
所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
该菌株在PDA平板单菌落形态图见图1，图1-A为图1-A为平板正面图；图1-B为平板背面图。
实施例3棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044的活性筛选
采用滤纸片法测定待筛真菌（XL-0044）对供试真菌(4株病原真菌)的抑菌活性，具体方法如下：
①菌液的培养：将保藏的待筛真菌与供试真菌(4株病原真菌)分别划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养72h后，将生长好的斜面直接接入备用PDB液体培养基中，置于28℃，180rpm摇床中培养48h，取出备用，即得供试菌液。
②在无菌条件下，用供试真菌作为指示菌，分别取适量的菌液与PDA平板中，涂布均匀，用无菌镊子夹入三个无菌滤纸片，每个纸片上分别滴加适量一种待筛菌种的菌液。在28℃恒温培养箱里面培养72h，观察有无抑菌效果。
所述PDA斜面培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
由实验结果知，XL-0044对4株植物病原真菌——甘蔗黑斑病菌、苹果轮纹病菌玉米大斑病菌、橘红褐斑病菌，具有显著的抑制效果。
实施例4棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044的液体培养
（1）菌株的活化：将保藏的棘孢曲霉菌XL-0044划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3天；
菌株的液体培养：配制200ml/瓶的PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入液体摇瓶，置于28℃、180rpm摇床中培养15天，取出，即得液体培养物(即发酵液)。
（2）菌株的活化：将保藏的棘孢曲霉菌XL-0044划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养5天；
菌株的液体培养：配制200ml/瓶的PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入液体摇瓶，置于28℃、180rpm摇床中培养20天，取出，即得液体培养物(即发酵液)。
（3）菌株的活化：将保藏的棘孢曲霉菌XL-0044划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养4天；
菌株的液体培养：配制200ml/瓶的PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入液体摇瓶，置于28℃、180rpm摇床中培养18天，取出，即得液体培养物(即发酵液)。
所述PDA斜面培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
所述PDB液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH值自然。
实施例5棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044乙酸乙酯粗提物的制备
取实施例4的发酵液用等体积乙酸乙酯进行萃取，方法为：振荡30min，使发酵液与乙酸乙酯充分混合后，静置24h分液后，取出乙酸乙酯相即上层相，42℃减压旋蒸（真空度一般为﹣0.08Mpa～﹣0.01MPa），利用旋转蒸发仪将溶剂完全蒸干，得到菌液乙酸乙酯粗提物，置4℃冰箱保藏备用。
实施例6棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044乙酸乙酯粗提物的MIC值的测定
取实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物采用96孔板法进一步测定其最小抑菌浓度（MIC），具体方法如下：
①供试菌液的培养：将保藏的供试真菌(4株病原真菌)划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养72h后，将生长好的斜面直接接入备用PDB液体培养基中，置于28℃，180rpm摇床中培养48h，取出备用，即得供试菌液。
②样品溶液的配置：取1mg实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物，加入100uL DMSO使其充分溶解，再用DMSO定容，得到100ug/mL的样品溶液。
③96孔板法测定MIC和MBC：取无菌96孔板，1-7孔中分别加入100μL的PDB液体培养基，取样品溶液100μL加到1号孔中，混匀（浓度为50ug/mL），从1号中取出100μL加到2号孔中，混匀，依次稀释到7号孔，7号孔中取出100μL弃去。1-7号孔中样品浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.7815ug/mL，再分别加入100μL的供试菌液。同一块96孔板上，以加100μL DMSO的小孔作为空白对照，以不加样品溶液只加100μL供试菌液的小孔作为阳性对照，以不加供试菌液只加100μL PDB液体培养基的小孔作为阴性对照。观察孔中培养液澄清的最低浓度为MIC。
所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
所述PDB液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH值自然。
棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044对不同病原真菌的最小抑菌浓度（MIC）见表1。
表1棘孢曲霉菌XL-0044对不同病原真菌的最小抑菌浓度（MIC）
由表1可见，XL-0044对4株植物病原真菌——甘蔗黑斑病菌、苹果轮纹病菌、玉米大斑病菌、橘红褐斑病病原菌，具有显著的抑制效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
tgctgtcggg tgctgggtct tcggggccca acctcccacc cgtgcttacc gtaccctgtt 60
gcttcggcgg gcccgccttc gggcggcccg gggcctgccc ccgggaccgc gcccgccgga 120
gaccccaatg gaacactgtc tgaaagcgtg cagtctgagt cgattgatac caatcagtca 180
aaactttcaa caatggatct cttggttccg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240
aactaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc 300
ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag cgtcatttct cccctccagc cccgctggtt 360
gttgggccgc gcccccccgg gggcgggcct cgagagaaac ggcggcaccg tccggtcctc 420
gagcgtatgg ggctctgtca cccgctctat gggcccggcc ggggcttgcc tcgaccccca 480
atcttctcag attgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaaaa 540
accgggaaga aaaa 554
序列表
<110> 杨凌未来中科环保科技有限公司
<120> 一种棘孢曲霉菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 554
<212> DNA
<213> 1(人工序列)
<400> 1
tgctgtcggg tgctgggtct tcggggccca acctcccacc cgtgcttacc gtaccctgtt 60
gcttcggcgg gcccgccttc gggcggcccg gggcctgccc ccgggaccgc gcccgccgga 120
gaccccaatg gaacactgtc tgaaagcgtg cagtctgagt cgattgatac caatcagtca 180
aaactttcaa caatggatct cttggttccg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240
aactaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc 300
ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag cgtcatttct cccctccagc cccgctggtt 360
gttgggccgc gcccccccgg gggcgggcct cgagagaaac ggcggcaccg tccggtcctc 420
gagcgtatgg ggctctgtca cccgctctat gggcccggcc ggggcttgcc tcgaccccca 480
atcttctcag attgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaaaa 540
accgggaaga aaaa 554

Claims (3)

1.一种棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044，已于2021年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23267。
2.权利要求1所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044在制备抑菌剂中的应用，其特征在于，所述的抑菌剂抑制的真菌包括甘蔗鞭黑粉菌(Ustilago scitamineaSyd.)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、交链格孢菌(Alternaria alternata)；
所述的抑菌剂中的活性成分包括棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物的提取物；所述的提取物以棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物为原料经有机溶剂萃取获得；所述有机溶剂为乙酸乙酯。
3.根据权利要求2所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044在制备抑菌剂中的应用，其特征在于，所述的棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044培养物为液体培养物；
其培养方法为：将棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)XL-0044划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；
配制PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入PDB液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；
所述PDA斜面培养基含有：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2；
所述PDB液体培养基含有：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
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