CN109182134A - 一株黑曲霉菌株及其制备的具有降血脂功效普洱茶 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体涉及一株黑曲霉菌株及其制备的具有降血脂功效普洱茶。本发明所述的黑曲霉，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15884。本发明所述的黑曲霉菌株应用于普洱茶加工工艺中，在含有丰富木香的基础上，增添了清香气味，且能够在茶叶中代谢洛伐他汀类物质，由其制备得到普洱茶具有降血脂功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物和食品生物技术领域，涉及一株黑曲霉0066-AN及 其在普洱茶加工工艺中的应用，以及茶叶的降血脂功能。
背景技术
普洱茶以云南大叶种晒青茶为原料制成，被认为是变化最丰富、最有 故事的中国茶。普洱熟茶属于后发酵茶，是以晒青毛茶为原料经过一个月 以上的渥堆发酵制得。普洱茶中的发酵微生物众多，包括黑曲霉、米曲霉、 酵母等。黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，在发 酵工业中主要用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖 氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。
随着社会经济份发展，人民生活水平不断提高，饮食结构有了明显的 改变，社会劳动强度普遍降低，促使肥胖病、脂肪肝、高脂血症等慢性疾 病的发病率呈现明显上升趋势，且这一趋势在我国越来越突出。洛伐他汀 是临床上应用较多，较为重要的降血脂药物。普洱茶中茶多酚等成分对具 有合成洛伐他汀能力的真菌具有促进或抑制的作用，对于伏马曲霉能够抑 制其代谢洛伐他汀的能力，而对于塔宾曲霉则能够促进其代谢洛伐他汀。
发明内容
为此，本发明主要解决的技术问题是提供了一株能够高效合成洛伐他 汀的黑曲霉，并提供了一种制备具有降血脂功能普洱茶的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一株黑曲霉0066-AN，已保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15884。
上述的微生物菌株，由昆明中茶普洱茶存储仓或陈年普洱茶中分离纯 化得到，遗传稳定，符合普洱茶高温汽蒸等生产要求的菌株，包括如下步 骤：
1、选取五年普洱产品、十年普洱产品进行取样并粉碎稀释，同时在昆 明中茶普洱茶储存仓分别选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样 法进行取样；
2、取样后于PDA固体培养基进行培养，于28-30℃条件下培养10天 进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相 互区别的菌落进行下一步纯化；
4、挑取菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养5-10 天，直至得到各个菌株的单菌落；
5、将获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃ 生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株。
利用本专利的黑曲霉菌株制备普洱茶工艺，其特征在于，所述的普洱 发酵工艺是在渥堆发酵工序前接入含有所述保藏编号为CGMCC No.15884 菌株经培养后得到的液体种子，所述液体种子通过如下方法制备：
1、取活化后的黑曲霉(CGMCC No.15884)菌株接种至液体培养基。 所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液 体培养基。
2、将于28-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体 种子的密度为(5-9)*106cfu/mL以上。
本发明菌株应用于普洱茶生产加工中，不仅对普洱茶的品质有很大的 积极作用，在含有丰富木香的基础上，增添了清香气味，而且能够在茶叶 中代谢洛伐他汀类物质，由其制备得到普洱茶具有降血脂功能。所述标准 化普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥， 按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，使用小型喷雾器将菌液均匀 喷洒到茶叶上，接种量为30％-38％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
3、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为(2-3)*(2-3)米的茶堆， 进行渥堆发酵，堆芯温度在35-50度左右，堆表面温度为30-35度，水分含 量在40％-50％左右；
4、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯 温度以及水分含量；
5、发酵20-27天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述的PDA培养基按照现有技术中常规方法制 备。
本发明中黑曲霉(CGMCC No.15884)的选育方法，包括如下步骤：
1、选取五年普洱产品、十年普洱产品进行取样并粉碎稀释，同时在昆 明中茶普洱茶储存仓分别选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样 法进行取样；
2、将取样后的PDA培养基，于28-30℃条件下培养10天，进行倒置 培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相 互区别的菌落进行下一步纯化；
4、挑取菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养 5-10天，直至得到各个菌株的单菌落；
5、将获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃ 生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株。
将由上述步骤中分离得到的菌株0066-AN，在PDA培养基上，菌落 黑色，表面粗糙，菌丝发达，分支较多。通过菌体微观形态、菌落宏观形 态，结合分子测序的ITS基因序列、钙调蛋白基因序列和β微管蛋白基因 序列，确认该菌株为黑曲霉。该菌株遗传稳定，有良好的耐热性，符合生 产要求，送样编号为0066-AN，菌株于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15884，Aspergillus niger。保藏 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年6月19日， 目前状态为存活。
将该菌株用于普洱茶发酵生产，在常规工艺中增加制备液体种子和接 种步骤，所述的液体种子是利用黑曲霉(CGMCC No.15884)按照如下方 法制备：
1、取活化后的黑曲霉(CGMCC No.15884)菌株接种至液体培养基。 所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液 体培养基。
2、将于28-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体 种子的密度为(5-9)*106cfu/mL以上。
所述标准化普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻 堆、开沟干燥，按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，使用小型喷雾器将菌液均匀 喷洒到茶叶上，接种量为30％-38％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
3、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为(2-3)*(2-3)米的茶堆， 进行渥堆发酵，堆芯温度在35-50度左右，堆表面温度为30-35度，水分含 量在40％-50％左右；
4、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯 温度以及水分含量；
5、发酵20-27天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。
实施例1降血脂普洱茶
按照本发明的方法进行单菌株发酵，制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将2种不同产区的云南大叶种晒青毛茶原料按要求进行拼配、混匀 后，要求混料后茶叶无花杂；
2、取活化后的黑曲霉(CGMCC No.15884)菌株接种至PDB液体培 养基。
3、将液体培养基于28℃，在无菌条件下置于摇床中培养。所述液体 种子的密度为8*106cfu/mL。
4、将拼配后的茶叶原料置于洁净的生产线上，将制备的液体种子接种 到茶叶中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，同时不停 搅拌、翻动，液体种子的接种量为38％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
5、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为2*2米的茶堆，于空气相对 湿度为60％条件下，进行渥堆发酵，要求发酵过程中堆芯温度在40度， 堆表面温度为35度，水分含量在40％左右；
6、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，减少结块， 并保持堆芯温度在40度，水分含量40％；
7、发酵27天后，在茶堆上进行开沟，通风干燥5天，至水分达到12％ 时结束生产。
本实施例制备的普洱熟茶，品质稳定，其滋味醇爽，能够提供丰富木 香以及清香气味，并富含洛伐他汀类物质，具有显著的降血脂效果。
对比例1普洱茶常规制备
按照《地理标志产品-普洱茶》(GB/T 22111)中记载，将茶叶原料制备 为普洱熟茶。
对比例2米曲霉菌株制备的普洱茶
按照本发明的方法进行单菌株发酵，制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将2种不同产区的云南大叶种晒青毛茶原料按要求进行拼配、混匀 后，要求混料后茶叶无花杂；
2、取活化后的米曲霉菌株接种至PDB液体培养基。
3、将液体培养基于28℃，在无菌条件下置于摇床中培养。所述液体 种子的密度为8*106cfu/mL。
4、将拼配后的茶叶原料置于洁净的生产线上，将制备的液体种子接种 到茶叶中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，同时不停 搅拌、翻动，液体种子的接种量为38％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
5、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为2*2米的茶堆，于空气相对 湿度为60％条件下，进行渥堆发酵，要求发酵过程中堆芯温度在40度， 堆表面温度为35度，水分含量在40％左右；
6、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，减少结块， 并保持堆芯温度在40度，水分含量40％；
7、发酵27天后，在茶堆上进行开沟，通风干燥5天，至水分达到12％ 时结束生产。
对比例2其他黑曲霉菌株制备的普洱茶
按照本发明的方法进行单菌株发酵，制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将2种不同产区的云南大叶种晒青毛茶原料按要求进行拼配、混匀 后，要求混料后茶叶无花杂；
2、取活化后的黑曲霉菌株接种至PDB液体培养基。
3、将液体培养基于28℃，在无菌条件下置于摇床中培养。所述液体 种子的密度为8*106cfu/mL。
4、将拼配后的茶叶原料置于洁净的生产线上，将制备的液体种子接种 到茶叶中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，同时不停 搅拌、翻动，液体种子的接种量为38％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
5、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为2*2米的茶堆，于空气相对 湿度为60％条件下，进行渥堆发酵，要求发酵过程中堆芯温度在40度， 堆表面温度为35度，水分含量在40％左右；
6、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，减少结块， 并保持堆芯温度在40度，水分含量40％；
7、发酵27天后，在茶堆上进行开沟，通风干燥5天，至水分达到12％ 时结束生产。
对上述实施例的普洱熟茶成分和品质进行检测和评审。茶多酚在一定 范围内向其他物质的转变速度代表了茶叶转化的速度，实验中以茶多酚和 茶褐素(茶多酚转化产物)含量表示茶叶转化速度。普洱茶降血脂功能通 过体外实验检测茶叶对甘油三酯和总胆固醇的作用，以及检测洛伐他汀含 量来评价。每个实施例制备五个批次，检测结果分别记录于下表1。
表1普洱熟茶品质的检测结果
由表1的普洱熟茶数据可知，实施例1的茶褐素含量略高于对比例1 和2；实施例1的洛伐他汀含量远远高于对比例且降血脂效果更好。总体 而言，利用黑曲霉(CGMCCNo.15884)制备的实施例1能够更快速的转 化茶多酚，生成茶褐素，并生成大量洛伐他汀，提供很好的而降血脂效果， 茶叶品质和健康功效优于对比例。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
Claims (4)
1.一种黑曲霉0066-AN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15884。
2.根据权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，由昆明中茶普洱茶存储仓或陈年普洱产品中分离纯化得到，遗传稳定，符合普洱茶生产要求的菌株，包括如下步骤：
S11、选取五年普洱产品、十年普洱产品进行取样并粉碎稀释，同时在昆明中茶普洱茶储存仓分别选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；
S12、取样后于PDA固体培养基进行培养，于28-30℃条件下培养10天进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
S13、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；
S14、挑取S13筛选菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养5-10天，直至得到各个菌株的单菌落；
S15、将S14获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株，保藏编号为CGMCC No.15884。
3.利用权利要求1或2所述的黑曲霉菌株制备普洱茶工艺，其特征在于，所述的普洱发酵工艺是在渥堆发酵工序前接入含有所述保藏编号为CGMCC No.15884菌株经培养后得到的液体种子，所述液体种子通过如下方法制备：
S21、取活化后的黑曲霉(CGMCC No.15884)菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基；
S22、将于28-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体种子的密度为(5-9)*106cfu/mL以上。
4.利用权利要求1或2所述的黑曲霉(CGMCC No.15884)菌株的普洱茶产品，其特征在于，利用黑曲霉(CGMCC No.15884)菌株接种制备普洱茶产品，所述标准化普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥，按如下方法进行：
S31、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
S32、将权利要求3制备的液体种子接种到茶叶原料中，使用小型喷雾器将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为30％-38％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
S33、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为(2-3)*(2-3)米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在35-50度左右，堆表面温度为30-35度，水分含量在40％-50％左右；
S34、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；
S35、发酵20-27天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190111 |
|
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