CN109180785B

CN109180785B - 一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽及其应用

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Publication number: CN109180785B
Application number: CN201811325592.9A
Authority: CN
Inventors: 沈志伟; 张益�
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-11-08
Also published as: CN109180785A

Abstract

本发明涉及一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽，所述美白还原多肽是具有SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:5中任一项所述的氨基酸序列的多肽。本发明还提供一种上述美白还原多肽的应用，其中，该美白还原多肽应用于化妆品或口服液领域。本发明提供的美白还原多肽，同时具备酪氨酸酶抑制能力和抗氧化能力，而且具有稳定的生物相容性。

Description

一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽及其应用。

背景技术

黑色素一般对于保护人体免受紫外线的辐射起到重要作用，紫外线能够激活酪氨酸酶的活性，在氧化酪氨酸或者3，4-二羟苯丙氨酸后，经过一连串化学反应形成黑色素。黑色素生成后能够减少紫外线产生的自由基，减少自由基对正常细胞的毒害作用。黑色素过多的形成会使皮肤变黑，局部生成过多会导致黄褐斑和雀斑，他们都是皮肤病。此外黑色素的过多沉着也是果蔬腐败的重要表象。

酪氨酸酶是合成黑色素过程中的关键酶，阻断黑色素生成的一种有效途径就是抑制酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶又称酪氨酸羟化酶、酪氨酸3-单加氧酶、多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶，它是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物中，酪氨酸酶的活性中心由两个含铜离子位点构成，酪氨酸经过酪氨酸酶羟基化生成多巴，进一步经过氧化、脱羧基等反应变成吲哚醌，最后吲哚醌进一步合成黑色素。

皮肤黑色素的合成中，紫外线作为主要外界因素。紫外线(UV)可分为长波长(UVA，320～400nm)、中波长(UVB，280～320nm)、短波长(UVC，100～280nm)。适量的暴露在紫外线下能够帮助人体合成维生素D，在夏天，每周暴露5-15min，便能使人体产生足量的维生素D。但过多的暴露在紫外线下会产生一系列的危害。最主要的是皮肤损伤和晶状体损伤，所有的紫外线辐照都会损害胶原纤维，加速皮肤老化和松弛，并且同时还能破坏皮肤中的还原性物质，进一步加剧对皮肤的损伤。UVB辐照可以直接造成DNA损伤，是造成皮肤癌的主要元凶。UVA会迅速氧化皮肤细胞已有的黑色素，并导致黑色素细胞大量的分泌黑色素，UVB会激活体内的黑色素合成途径，在一两天内使得黑色素水平升高。紫外线辐照会使氧气分子与水反应产生羟基自由基，羟基自由基具有极强的得电子能力，即氧化能力，是仅次于氟的氧化剂。

市场常见的酪氨酸酶抑制剂包括曲酸、熊果苷、对苯二酚、光甘草定、谷胱甘肽和曲酸(提取自曲霉发酵产物)，曲酸及其衍生物因其具有较好的抗氧化，抑制黑色素生成的能力，在较长的时间广泛大量的使用，但根据近期的科学研究表明，曲酸有一定致癌性，日本官方已禁止将曲酸用作食用以及化妆品中。对苯二酚自1960年代起用作商购的医药品，而对苯二酚在以往的使用经验过程中发现的副作用，会导致黑色素细胞死亡。从2001年开始，在欧盟国家已禁止用于化妆美白制剂。熊果苷又名熊果素，呈白色针状结晶或粉末。萃取自熊果的叶子，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑。熊果苷在7％浓度以上时，会产生光敏性，会出现使用过程中”越用越黑”。此外熊果苷被皮肤吸收后会还原产生对苯二酚，因此类似的副作用也可能会出现。

一些天然小分子或者化合物在生物相容性上的不稳定性，一定程度上限制了它们的使用，酪氨酸酶抑制剂在皮肤医学，食品保鲜等领域有着广泛需求，因此开发一种具有良好的生物相容性的酪氨酸酶抑制剂显得尤为重要。由天然氨基酸缩合而成的短肽类似于我们人体的多肽和蛋白，能够发挥生物学功效，且完全可被人体正常的吸收和代谢，现有的专利关于酪氨酸酶多肽抑制剂，一般是分子量较大的多肽，对于多肽合成来讲，多肽氨基酸越多成本花费越高，因此小分子肽在解决此类问题上提供了一个实际可行且前景广阔的解决方案。

WO 2012013136 A1中萧乃文公开了含有半胱氨酸和酪氨酸的大量二肽、三肽等短肽，并具有一定的酪氨酸酶抑制效果，公开了这些短肽在5min和30min的抑制效果，在其公开的一系列短肽中，并未说明其抗氧化清除自由基的特性。

US20090099091A1中Basil M.Hantash公开了一些寡肽具有较好的酪氨酸酶抑制效果，相比于本发明中的酪胺酸酶抑制肽ECGYF，这些寡肽并不具备抗氧化清除自由基的效果，需要在制成产品的时候加入其他具有还原抗氧化功效的成分，而且多肽在合成过程的成本会随着多肽长度的增长而陡增。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽及其应用，以解决现有肽序列不能同时具备酪氨酸酶抑制能力和抗氧化能力以及生物相容性不稳定的问题。

本发明提供一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽，其特征在于，所述美白还原多肽是具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5中任一项所述的氨基酸序列的多肽。

优选的，该美白还原多肽对酪氨酸酶的IC50小于等于1.18mM。

优选的，该美白还原多肽对酪氨酸酶的IC50介于0.46mM-0.83mM之间。

本发明还提供一种上述美白还原多肽的应用，其中，该美白还原多肽应用于化妆品或口服液领域。

优选的，该美白还原多肽的浓度是酪氨酸酶的浓度的6.25倍以上时，对酪氨酸酶的抑制率达到90％以上，抑制酪氨酸酶与L-酪氨酸生成黑色素，具有美白的作用。

优选的，该美白还原多肽的浓度介于酪氨酸酶的浓度的6.25倍-15.5倍之间。

优选的，该美白还原多肽对羟基自由基清除率与谷胱甘肽相当。

优选的，该美白还原多肽能够在停滞期内持续地100％抑制抑制酪氨酸酶活性。

优选的，所述美白还原多肽制成冻干粉制剂以便在使用时溶解进行面部涂施。

本发明涉及的美白还原多肽及其应用，保留了人体内天然抗氧化肽谷胱甘肽的抗氧化序列C，在此基础上拓展了对酪氨酸酶的抑制序列YF或FY，最终得到具有特定的空间位阻来和酶结合的具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5中任一项所述的氨基酸序列的美白还原多肽，其既具备高效酪氨酸酶抑制活性，又具备抗氧化衰老保护正常细胞的功能，同时短肽序列能控制在一个较低的生产成本和很好的生物相容性。总之，本发明提供的美白还原多肽，同时具备酪氨酸酶抑制能力和抗氧化能力，而且具有稳定的生物相容性。

附图说明

图1示出了实施例1中纯抑制肽组和不同浓度实验组的OD475nm值变化；

图2示出了实施例1中不同浓度美白还原多肽ECGYF对酪氨酸酶的抑制率变化曲线；

图3示出了实施例3中不同浓度的不同酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶酶活的抑制曲线；

图4示出了实施例4中不同浓度的不同酪氨酸酶抑制剂对羟基自由基清除率的影响；

图5示出了实施例5中不同浓度美白还原多肽ECGYF、ECAYF以及熊果苷对细胞存活率的影响；

图6示出了实施例5中不同浓度美白还原多肽ECGYF、ECAYF以及熊果苷对活细胞数的影响；

图7示出了实施例6中不同浓度美白还原多肽ECGYF在不同反应时间的OD475nm值变化曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施方式，对本发明的技术方案进行详细的说明，但如下实施例仅是用以理解本发明，而不能限制本发明，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

表1本发明所引用氨基酸名称定义对照表

丙氨酸	A(Ala)
		半胱氨酸	C(Cys)
谷氨酸	E(Glu)
		甘氨酸	G(Gly)
苯丙氨酸	F(Phe)
		酪氨酸	Y(Tyr)
缬氨酸	V(Val)

实验材料：美白还原多肽ECGYF、ECAYF、ECVYF、ECYF和FYGCE通过固相法合成得到，纯度99.8％。

其中ECAYF结构式：

上述氨基酸序列中氨基酸为天然L氨基酸，或者是氨基酸残基修饰物，光学异构体(如D-型氨基酸)、或者化学分子或基团修饰(比如：磷酸化与脱磷酸化、乙酰化与脱乙酰化、甲基化与脱甲基化、腺苷化与脱腺苷化、-SH与-S-S-互变，脂质基团连接。)

L-酪氨酸，酪氨酸酶均购买自sigma aldrich；谷胱甘肽购买自sigma aldrich；

α-熊果苷购买自TCI(Tokyo Chemical Industry)；

邻二氮菲(1,10-Phenanthroline monohydrate)购买自sigma aldrich；

硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)购买自sigma aldrich。

实施例1

不同浓度的美白还原多肽ECGYF对酪氨酸酶的抑制效果

实验步骤：

将L-酪氨酸饱和溶解在PBS缓冲液中，L-酪氨酸含量约为0.4mg/ml，分别加入浓度为0mM、0.6mM、1.2mM、3.1mM、6.2mM的美白还原多肽ECGYF，在37℃孵育十分钟后，各加入37℃预热的2KU单位的酪氨酸酶，反应24小时后，分别测量475nm处的光吸收值，该OD475nm代表黑色素的含量。

其中，浓度为0mM的美白还原多肽ECGYF实验作为对照组，测得对照组OD 475nm。其中，浓度为0.6mM、1.2mM、3.1mM、6.2mM的美白还原多肽ECGYF实验作为实验组，测得实验组OD 475nm。

含6.2mM的美白还原多肽ECGYF和酪氨酸酶，不含L-酪氨酸；采取与实验组相同的孵育方式、反应方式和测量方式，作为纯抑制肽组，测得纯抑制肽组OD475nm；

酪氨酸酶的抑制率％＝(对照组OD 475nm-实验组OD 475nm)/对照组OD 475nm*100％。

实验结果：

图1示出纯抑制肽组和不同浓度美白还原多肽ECGYF在可见光475nm处的吸收值。纯抑制肽组OD475nm几乎为零，说明美白还原多肽ECGYF不和酪氨酸酶反应生成黑色素；另外，黑色素生成量随美白还原多肽ECGYF浓度的增加而减少。

图2示出了不同浓度美白还原多肽ECGYF对酪氨酸酶的抑制率变化曲线，说明随浓度的增加，美白还原多肽ECGYF对酪氨酸酶抑制效果增强明显，美白还原多肽ECGYF浓度达到2.5mM以上时，对酪氨酸酶的抑制率达到90％以上。

实施例2

美白还原多肽ECGYF、ECAYF、ECVYF、ECYF和FYGCE对酪氨酸酶抑制效果

将L-酪氨酸饱和溶解在PBS缓冲液中，L-酪氨酸含量约为0.4mg/ml，分别加入浓度为10mM的美白还原多肽ECGYF、ECAYF、ECVYF、ECYF和FYGCE，在37℃孵育十分钟后，各加入37℃预热的2KU单位的酪氨酸酶，反应前及24小时后，分别测量475nm处的光吸收值。

空白组：除了不加入美白还原多肽ECGYF、ECAYF、ECVYF、ECYF和FYGCE外，其余采用与上述同样的孵育方式、反应方式和测量方式。

实验结果：如表2所示，表明当美白还原多肽ECGYF中，G被替换成A、V或者缺失，或者ECGYF序列颠倒为FYGCE，对酪氨酸酶均有类似美白还原多肽ECGYF的抑制效果。

表2采用美白还原多肽ECGYF、ECAYF、ECVYF、ECYF和FYGCE抑制后的OD475nm值

实施例3

酪氨酸酶抑制剂(谷胱甘肽、熊果苷和美白还原多肽ECGYF)对酪氨酸酶的IC50值对比

实验方法：配置不同的浓度的谷胱甘肽、熊果苷和美白还原多肽ECGYF，在96孔板内动态测量各黑色素生成曲线，获得不同浓度下谷胱甘肽、熊果苷和美白还原多肽ECGYF存在下酪氨酸酶的最大反应速率，从而计算出酪氨酸酶酶活为50％时，分别所需谷胱甘肽、熊果苷和美白还原多肽ECGYF的最低浓度IC50。

实验结果：如图3所示，曲线(b)为谷胱甘肽的酪氨酸酶酶活抑制曲线，谷胱甘肽的IC50＝1.18mM；曲线(c)为熊果苷的酪氨酸酶酶活抑制曲线，熊果苷的IC50＝5.73mM；曲线(a)为美白还原多肽ECGYF的酪氨酸酶酶活抑制曲线，美白还原多肽ECGYF的IC50＝0.46mM；此外还测量了美白还原多肽ECAYF的酪氨酸酶酶活抑制曲线，美白还原多肽ECAYF的IC50＝0.83mM。对比已知的酪氨酸酶抑制剂，本发明提供的美白还原多肽ECGYF的IC50最小，因此其对酪氨酸酶抑制效果更优。

实施例4

对比酪氨酸酶抑制剂(谷胱甘肽和美白还原多肽ECGYF)的自由基清除率

实验方法：将邻二氮菲分别与不同浓度酪氨酸酶抑制剂(谷胱甘肽和美白还原多肽ECGYF)混合后，加入硫酸亚铁溶液混匀，再加入H₂O₂，于37℃恒温反应60min得到混合溶液，在537nm下分别测量各组混合溶液的吸光值OD537nm，得混合溶液OD537nm，每个浓度设有三个平行组。

以磷酸缓冲液代替美白还原多肽ECGYF做空白对照组，测得空白对照组OD537nm；

以去离子水代替双氧水做损伤组，测得损伤组OD537nm。

羟基自由基清除率(％)＝[(混合溶液OD537nm-损伤组OD537nm)/(空白对照组OD537nm-损伤组OD537nm)]*100。

实验结果：如图4示出了不同浓度酪氨酸酶抑制剂对羟基自由基清除率的曲线，酪氨酸酶抑制剂对羟基自由基清除率随酪氨酸酶抑制剂浓度增高而增高。当美白还原多肽ECGYF的浓度大于1.0mg/ml，羟基自由基清除率大于50％。美白还原多肽ECGYF相对于谷胱甘肽GSH(ECG)，虽然添加了对酪氨酸酶的抑制序列YF，但是并不会导致其自由基清除活性下降。具体地，美白还原多肽ECGYF和谷胱甘肽(GSH)在四种不同浓度下对羟基自由基清除率相似，这是由于ECGYF含有与谷胱甘肽类似的氨基酸序列，保留了谷胱甘肽抗氧化还原能力，具有较好的自由基清除效果。说明美白还原多肽ECGYF可用来清除紫外线等辐射产生的自由基，避免皮肤氧化衰老。已知黑色素在正常人体中发挥清除紫外线辐射带来的自由基，本发明中美白还原多肽ECGYF具有较好的清除自由基作用，可以抵消由于黑色素损失导致的自由基增多，减弱了外线对皮肤细胞的损伤作用。

本实施例中的美白还原多肽ECGYF具有较强的氧化损伤因子自由基的清除能力，可用作药妆中雀斑，美白有效成分，可用于晒后皮肤修复；该美白还原多肽ECGYF还具有抗衰老、抑制黑色素合成的有效成分，含有类似谷胱甘肽结构，能够与重金属和有毒基团相结合，能清除皮肤中重金属残留物，以及毒素基团，修复皮肤损伤。利用该美白还原多肽ECGYF，制成冻干粉制剂，在使用时用生理盐水或保湿水溶解，用于面部涂施，或用于口服液等制剂。

实施例5

美白还原多肽ECGYF安全性测试：利用不同荧光染料对活细胞和死细胞标记，对活细胞和死细胞进行计数分析，评估美白还原多肽ECGYF、ECAYF以及熊果苷对细胞增殖和细胞存活率的影响。

实验方法：

细胞选用Hela上皮细胞。

将2.5mM的美白还原多肽ECGYF、美白还原多肽ECAYF和熊果苷溶解在培养基中过滤，将上述各培养基及空白对照培养基各加入1ml进24孔板，各加入约2万个活细胞，于37℃，5％CO₂通气培养培养24小时，收集上层培养液，用胰蛋白酶消化底部细胞后用上层培养液重悬，加入细胞活死染荧光染液后，取充分混匀后的细胞液使用活细胞计数仪对细胞计数。

实验结果：

如图5所示，在熊果苷的培养基中，细胞的存活率为76.8％；美白还原多肽ECGYF和美白还原多肽ECAYF的培养基中细胞的存活率分别为98.2％和88.6％；空白对照组细胞存活率为96.4％。说明美白还原多肽ECGYF在达到IC50值的五倍情况下对细胞增殖没有影响；熊果苷组细胞存活率明显较低，熊果苷对细胞影响最大美白还原多肽ECAYF和美白还原多肽ECGYF对细胞存活无明显影响，说明美白还原多肽ECAYF和美白还原多肽ECGYF具有良好的生物相容性。

如图6所示，活细胞总数反应相同的情况，熊果苷对细胞增殖相比于美白还原多肽ECAYF和美白还原多肽ECGYF而言，毒性最大，美白还原多肽ECAYF对细胞增殖具有微弱的影响，而美白还原多肽ECGYF对细胞增殖有一定的促进作用。说明美白还原多肽ECGYF对细胞无毒性，不会影响细胞增殖和降低细胞活性。

实施例6

WO 2012013136 A1公开了5min和30min时多种酪氨酸酶抑制短肽能100％抑制酪氨酸酶活性。本实施例中，使用了与WO 2012013136 A1中相同的方法，采用的酪氨酸酶的酶活单位约为100U/ml。

实验结果：美白还原多肽ECGYF抑制存在一个较长的滞留期，滞留期代表酶反应速率为0，过了滞留期后酶才与底物反应，在抑制剂存在下酶促反应速率随抑制剂浓度升高而减小，仍然有抑制效果。如图7所示，不同浓度美白还原多肽ECGYF抑制的滞留期随美白还原多肽ECGYF浓度增高而延长。在美白还原多肽ECGYF为0.4mM时，其滞留期为80min左右，说明美白还原多肽ECGYF在抑制酪氨酸酶前80min反应速率均为0，也就是黑色素生成量均为零。当浓度高于0.4mM时，美白还原多肽ECGYF能在抑制酪氨酸酶时有更长的滞留期。本发明的滞留期80min比WO 2012013136中0到30min效果更好，因为WO 2012013136中，许多短肽在30min时已经开始生成黑色素了。本发明的美白还原多肽ECGYF对酪氨酸酶抑制效果好于WO2012013136 A1中报道的短肽。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

序列表

<110> 上海应用物理研究所

<120> 一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原五肽及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 多肽

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Glu Cys Gly Tyr Phe

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 多肽

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Glu Cys Ala Tyr Phe

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 多肽

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Glu Cys Val Tyr Phe

1 5

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 多肽

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Glu Cys Tyr Phe

1

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 多肽

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Phe Tyr Gly Cys Glu

1 5

Claims

1.一种具有抑制黑色素生成和抗紫外线损伤作用的美白还原多肽在制备用于清除羟基自由基的化妆品或口服液上的应用，其特征在于，所述美白还原多肽的氨基酸序列为Glu-Cys-Gly-Tyr-Phe。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述美白还原多肽对酪氨酸酶的IC50小于等于1.18 mM。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述美白还原多肽对酪氨酸酶的IC50介于0.46 mM -0.83 mM之间。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述美白还原多肽制成冻干粉制剂以便在使用时溶解进行面部涂施。