CN109142593A - Hplc-dad法测定人血清中喹硫平药物浓度 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及精神病类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及HPLC‑DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度。本发明提供了测定服用喹硫平药物后血清中喹硫平浓度的方法，所述方法包括人血清样本预处理步骤和高效液相色谱(HPLC‑DAD)分析步骤。本发明建立了专属性强、灵敏度高和重现性好的HPLC‑DAD方法。本发明首次建立的测定喹硫平血药浓度的方法在准确度、精密度、专属性、稳定性等方面的验证结果均符合2015年版中华人民共和国药典相关指导原则(9012)对生物样品的分析要求。
Description
技术领域
本发明涉及精神病类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度。
背景技术
喹硫平是一种新的非典型抗精神病药，为脑中多种神经递质受体拮抗剂，主要作用于5-HT2、D1、D2及D4受体，对精神***症疗效肯定，安全性好，不良反应少。受基因多态性影响，体内代谢过程存在较大的个体差异，血药浓度与临床疗效和不良反应密切相关，根据血药浓度来调整给药剂量可以保证药物疗效和减少不良反应，以实现个体化用药。所以监测患者血药浓度在临床用药中具有重大意义。
目前国内外检测人血液中喹硫平的方法主要有高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-二极管阵列检测法、高效液相色谱-电喷雾串联质谱法等。其中高效液相色谱质谱联用法成本较高，故目前检测人血清中喹硫平浓度的方法首选高效液相色谱法。但以往方法存在前处理复杂、灵敏度低、定量分析范围窄、外标法定量易导致结果不够准确等问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度。
具体技术方案如下：
HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，它包括以下步骤：
(一)标准工作液的配制
(1)标准工作液的配制：
精确称取富马酸喹硫平标准品5.57mg于15mL离心管中，用甲醇溶解，配成喹硫平浓度为1.0mg/mL的储备液S1，将标准储备液 S1用甲醇进行稀释，分别在含有1.0-60μg/mL喹硫平的范围内配制系列标准工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(2)内标工作液的配制
精密称取染料木素标准品2.31mg于5mL离心管中，用甲醇溶解，配成浓度为1.0mg/mL的储备液ISS1，将标准储备液ISS1用甲醇进行稀释，得到浓度为10μg/mL的内标工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(二)血清样本的制备
(3)取空白血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得空白血清，将步骤(1)中所述的系列标准工作液10μL 分别和上述步骤中的空白血清190μL混合制成的喹硫平药物浓度为 50-3000ng/mL的标准工作血清；
(4)取待测血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得待测血清，上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)血清样品处理
(5)用移液枪移取10μL步骤(2)中所述内标工作液于1.5mL 离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清，在2000rpm 的转速下涡旋混合3min；
(6)用移液枪移取800μL含有0％-30％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂加入步骤(5)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3 min，以达到充分萃取的目的，然后在14000rpm的转速下高速离心 5min，得到上清液；
(7)取步骤(6)中所述的上清液750μL置于另一只1.5mL 离心管中，常温下用氮气缓慢吹干；
(8)用移液枪移取100μL含有45％乙腈的水复溶液加入步骤(7) 中所述的吹干的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样本；
(四)标准曲线方程
将步骤(3)中所述的血清按照步骤(三)预处理后使用液相色谱仪和DAD检测器对待测样本进行检测，得出上述待测样本的喹硫平和内标色谱图，在上述喹硫平和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，将步骤(3)中标准工作血清中待测目标物药物浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝ax+b，并得出权重系数a和b；
(五)未知样本的检测
将步骤(4)中所述的待测血清按照步骤(三)预处理后使用液相色谱仪和DAD检测器对待测样本进行检测，得出上述待测样本的喹硫平和内标色谱图，在上述喹硫平和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y 代入上述步骤(四)中的标准曲线方程中，通过计算得到待测样本中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待测血清中的喹硫平药物浓度。
在步骤(1)和步骤(2)分别用甲醇进行溶解得到标准储备液S1和标准储备液ISS1，用甲醇分别进行稀释，配制出各标准工作液和内标工作液，步骤(6)中所述萃取剂是由1:4的正己烷和甲基叔丁基醚组成的萃取剂，步骤(8)中所述复溶液是由9:11的乙腈和水组成的复溶液。
所述上述标准工作血清中待测目标物药物浓度指标准工作血清中所含有喹硫平的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有染料木素的浓度。
在步骤(四)中使用七种不同浓度的标准工作血清。
所述七种不同浓度的标准工作血清分别为含有50、100、150、 300、500、1000、3000ng/mL浓度的喹硫平血清。
所述高效液相色谱仪所使用的SPE固相萃取小柱为资生堂MF ph-12cm，色谱柱为Waters SunFire C18。
所述高效液相色谱仪设置的柱温为40℃。
所述高效液相色谱仪所使用的流动相为含30mmol乙酸铵的水和乙腈，并且采用梯度洗脱，进样量为10μL。
所述含量为体积比的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：
本发明所建立的高效液相色谱-DAD检测法在准确度、精密度、专属性、稳定性等方面均符合2015年版中华人民共和国药典相关指导原则(9012)对生物样品的分析要求。特别指出的是，本测定方法利用的血清样本体积为200μL，相应的萃取剂体积为800μL，低于文献报道的体积量，较小的样本量需求以及相对较少的有机试剂的消耗量使得本发明适用于检测患者服用喹硫平药物后血清中血药浓度，并且减少试剂污染。
本发明首次建立的方法可用于临床治疗中对患者体内的喹硫平血药浓度进行监测，为个体化给药、减少毒副作用提供理论依据。
附图说明
图1为实施例3中空白血清预处理后色谱分析典型色谱图；
图2为实施例3中空白血清预处理后色谱分析典型色谱图局部放大色谱图；
图3为实施例3中标准工作血清预处理后色谱分析典型色谱图；其中；
图4为实施例3中标准工作血清预处理后色谱分析典型色谱图局部放大色谱图；
图中，1-染料木素；2-喹硫平。
具体实施方式
为了更加清楚的对本发明进行说明，以下通过具体实施实例对本发明的具体实施方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。
实施例1
(一)标准工作液的配制
(1)标准工作液的配制：
精确称取富马酸喹硫平标准品5.57mg(相当于喹硫平质量为 4.83mg)于15mL离心管中，用甲醇溶解，配成喹硫平浓度为1.0mg/mL 的储备液S1，将标准储备液S1用甲醇进行稀释，分别制成含有1.0、 2.0、3.0、6.0、10、20、60μg/mL浓度的喹硫平系列标准工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(2)内标工作液的配制
精密称取染料木素标准品2.31mg(相当于染料木素质量为2.30 mg)于5mL离心管中，用甲醇溶解，配成浓度为1.0mg/mL的储备液ISS1，将标准储备液ISS1用甲醇进行稀释，得到浓度为10μg/mL 的内标工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(二)血清样本的制备
(3)取空白血液5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得空白血清，将步骤(1)中所述的系列标准工作液10μL 分别和上述步骤中的空白血清190μL混合制成的喹硫平血药浓度为 50、100、150、300、500、1000、3000ng/mL的标准工作血清；
(4)取待测血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得待测血清，上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)血清样品处理
(5)用移液枪移取10μL步骤(2)中所述内标工作液于1.5mL 离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清，在2000rpm的转速下涡旋混合3min；
(6)用移液枪移取800μL甲基叔丁基醚萃取剂加入步骤(5) 的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，以达到充分萃取的目的，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；
(7)取步骤(6)中所述的上清液750μL置于另一只1.5mL 离心管中，常温下用氮气缓慢吹干；
(8)用移液枪移取100μL含有45％乙腈的水复溶液加入步骤(7) 中所述的吹干的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样本；
实施例2
(一)标准工作液的配制
(1)标准工作液的配制：
精确称取富马酸喹硫平标准品5.57mg(相当于喹硫平质量为 4.83mg)于15mL离心管中，用甲醇溶解，配成喹硫平浓度为1.0mg/mL 的储备液S1，将标准储备液S1用甲醇进行稀释，分别制成含有1.0、 2.0、3.0、6.0、10、20、60μg/mL浓度的喹硫平系列标准工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(2)内标工作液的配制
精密称取染料木素标准品2.31mg(相当于染料木素质量为2.30 mg)于5mL离心管中，用甲醇溶解，配成浓度为1.0mg/mL的储备液ISS1，将标准储备液ISS1用甲醇进行稀释，得到浓度为10μg/mL 的内标工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(二)血清样本的制备
(3)取空白血液5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得空白血清，将步骤(1)中所述的系列标准工作液10μL 分别和上述步骤中的空白血清190μL混合制成的喹硫平血药浓度为 50、100、150、300、500、1000、3000ng/mL的标准工作血清；
(4)取待测血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得待测血清，上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)血清样品处理
(5)用移液枪移取10μL步骤(2)中所述内标工作液于1.5mL 离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清，在2000rpm的转速下涡旋混合3min；
(6)用移液枪移取800μL含有10％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂加入步骤(5)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，以达到充分萃取的目的，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；
(7)取步骤(6)中所述的上清液750μL置于另一只1.5mL 离心管中，常温下用氮气缓慢吹干；
(8)用移液枪移取100μL含有45％乙腈的水复溶液加入步骤(7) 中所述的吹干的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样本；
实施例3
(一)标准工作液的配制
(1)标准工作液的配制：
精确称取富马酸喹硫平标准品5.57mg(相当于喹硫平质量为 4.83mg)于15mL离心管中，用甲醇溶解，配成喹硫平浓度为1.0mg/mL 的储备液S1，将标准储备液S1用甲醇进行稀释，分别制成含有1.0、 2.0、3.0、6.0、10、20、60μg/mL浓度的喹硫平系列标准工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(2)内标工作液的配制
精密称取染料木素标准品2.31mg(相当于染料木素质量为2.30 mg)于5mL离心管中，用甲醇溶解，配成浓度为1.0mg/mL的储备液ISS1，将标准储备液ISS1用甲醇进行稀释，得到浓度为10μg/mL 的内标工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(二)血清样本的制备
(3)取空白血液5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得空白血清，将步骤(1)中所述的系列标准工作液10μL 分别和上述步骤中的空白血清190μL混合制成的喹硫平血药浓度为 50、100、150、300、500、1000、3000ng/mL的标准工作血清；
(4)取待测血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得待测血清，上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)血清样品处理
(5)用移液枪移取10μL步骤(2)中所述内标工作液于1.5mL 离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清，在2000rpm的转速下涡旋混合3min；
(6)用移液枪移取800μL含有20％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂加入步骤(5)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，以达到充分萃取的目的，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；
(7)取步骤(6)中所述的上清液750μL置于另一只1.5mL 离心管中，常温下用氮气缓慢吹干；
(8)用移液枪移取100μL含有45％乙腈的水复溶液加入步骤(7) 中所述的吹干的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样本；
(四)标准曲线方程
将步骤(3)中所述的血清按照步骤(三)预处理后使用液相色谱仪和DAD检测器对待测样本进行检测，得出上述待测样本的喹硫平和内标色谱图，在上述喹硫平和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，将步骤(3)中标准工作血清中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，数据见表1，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝0.0435*x-0.1509；
表1线性关系相关数据
| 进样名称 | 待测物峰面积 | 内标峰面积 | y值 | 待测物血药浓度 | 内标浓度 | x值 |
| sd1_01 | 0.0218 | 1.032 | 0.0211 | 50 | 10 | 5 |
| sd2_01 | 0.0456 | 1.009 | 0.0452 | 100 | 10 | 10 |
| sd3_01 | 0.0699 | 1.096 | 0.0638 | 150 | 10 | 15 |
| sd4_01 | 0.137 | 0.968 | 0.142 | 300 | 10 | 30 |
| sd5_01 | 0.232 | 1.100 | 0.211 | 500 | 10 | 50 |
| sd6_01 | 0.461 | 1.025 | 0.450 | 1000 | 10 | 100 |
| sd7_01 | 1.51 | 1.068 | 1.419 | 3000 | 10 | 300 |
(五)未知样本的检测
将步骤(4)中所述的待测血清按照步骤(三)预处理后使用液相色谱仪和DAD检测器对待测样本进行检测，得出上述待测样本的喹硫平和内标色谱图，在上述喹硫平和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y 代入上述步骤(四)中的标准曲线方程中，通过计算得到待测样本中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待测血清中的喹硫平药物浓度。
(六)液相色谱检测条件
高效液相色谱仪所使用的SPE固相萃取小柱为资生堂MF ph-12cm，色谱柱为Waters SunFire C18，柱温为40℃，流动相为含30mmol 乙酸铵的水和乙腈，并且采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2和表3，进样量为10μL。
如果没有特殊说明，本申请中的含量为体积比的含量。
表2液相色谱左泵(清洗泵)梯度洗脱程序
| Time(min) | 乙腈(％) | 水(30mM乙酸铵)(％) | 流速(mL/min) |
| 0 | 35 | 65 | 1.0 |
| 11.5 | 35 | 65 | 1.0 |
表3液相色谱右泵(分析泵)梯度洗脱程序
| Time(min) | 乙腈(％) | 水(30mM乙酸铵)(％) | 流速(mL/min) |
| 0 | 60 | 40 | 1.0 |
| 4.2 | 60 | 40 | 1.0 |
| 4.21 | 98 | 2 | 1.0 |
| 10.5 | 98 | 2 | 1.0 |
| 10.51 | 60 | 40 | 1.0 |
| 11.5 | 60 | 40 | 1.0 |
方法验证如下：
一、专属性
将空白血清和样本血清按上述实施例3预处理条件制备样本，然后按实施例测定条件分析，典型色谱图见图1-4，结果表明，空白血清对待测物及内标无干扰，该方法专属性较强。
二、线性和定量限
将上述配制的各个浓度的标准工作血清按实施例3预处理条件制备样本，然后按实施例测定条件，浓度由高到低测定，以色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明喹硫平的定量限为50ng/mL，喹硫平在50ng/mL到3000ng/mL范围内，线性关系良好，相关系数R>0.99。
三、精密度与准确度
取喹硫平储备液配制成高(QC3)、中(QC2)、低(QC1)3种浓度及定量下限(LLOQ)进行精密度和准确度试验，按本实施例方法重复分析测定3批次，其精密度和准确度结果分别如下表4。
表4喹硫平血药浓度测定方法的精密度和准确度结果
综合上述验证试验，本实施例的专属性、精密度和准确度等技术指标均符合要求，方法检测血清中喹硫平药物浓度，专属性强，重现性良好，提高了检测结果的准确度，且本实施例方法前处理步骤简便，有机试剂消耗量较低。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准工作液的配制
(1)标准工作液的配制：
精确称取富马酸喹硫平标准品5.57mg于15mL离心管中，用甲醇溶解，配成喹硫平浓度为1.0mg/mL的储备液S1，将标准储备液S1用甲醇进行稀释，分别在含有1.0-60μg/mL喹硫平的范围内配制系列标准工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(2)内标工作液的配制
精密称取染料木素标准品2.31mg于5mL离心管中，用甲醇溶解，配成浓度为1.0mg/mL的储备液ISS1，将标准储备液ISS1用甲醇进行稀释，得到浓度为10μg/mL的内标工作液，于-80℃冰箱冷冻保存；
(二)血清样本的制备
(3)取空白血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得空白血清，将步骤(1)中所述的系列标准工作液10μL分别和上述步骤中的空白血清190μL混合制成的喹硫平药物浓度为50-3000ng/mL的标准工作血清；
(4)取待测血液至少5mL，在离心速度3500rpm下离心10min，取上清液得待测血清，上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)血清样品处理
(5)用移液枪移取10μL步骤(2)中所述内标工作液于1.5mL离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清，在2000rpm的转速下涡旋混合3min；
(6)用移液枪移取800μL含有0％-30％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂加入步骤(5)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，以达到充分萃取的目的，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；
(7)取步骤(6)中所述的上清液750μL置于另一只1.5mL离心管中，常温下用氮气缓慢吹干；
(8)用移液枪移取100μL含有45％乙腈的水复溶液加入步骤(7)中所述的吹干的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，然后在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样本；
(四)标准曲线方程
将步骤(3)中所述的血清按照步骤(三)预处理后使用液相色谱仪和DAD检测器对待测样本进行检测，得出上述待测样本的喹硫平和内标色谱图，在上述喹硫平和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，将步骤(3)中标准工作血清中待测目标物药物浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝ax+b，并得出权重系数a和b；
(五)未知样本的检测
将步骤(4)中所述的待测血清按照步骤(三)预处理后使用液相色谱仪和DAD检测器对待测样本进行检测，得出上述待测样本的喹硫平和内标色谱图，在上述喹硫平和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(四)中的标准曲线方程中，通过计算得到待测样本中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待测血清中的喹硫平药物浓度。
2.如权利要求1所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：在步骤(1)和步骤(2)分别用甲醇进行溶解得到标准储备液S1和标准储备液ISS1，用甲醇分别进行稀释，配制出各标准工作液和内标工作液，步骤(6)中所述萃取剂是由1:4的正己烷和甲基叔丁基醚组成的萃取剂，步骤(8)中所述复溶液是由9:11的乙腈和水组成的复溶液。
3.如权利要求2所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：所述上述标准工作血清中待测目标物药物浓度指标准工作血清中所含有喹硫平的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有染料木素的浓度。
4.如权利要求3所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：在步骤(四)中使用七种不同浓度的标准工作血清。
5.如权利要求4所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：所述七种不同浓度的标准工作血清分别为含有50、100、150、300、500、1000、3000ng/mL浓度的喹硫平血清。
6.如权利要求5所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的SPE固相萃取小柱为资生堂MF ph-12cm，色谱柱为Waters SunFireC18。
7.如权利要求5所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：所述高效液相色谱仪设置的柱温为40℃。
8.如权利要求5所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的流动相为含30mmol乙酸铵的水和乙腈，并且采用梯度洗脱，进样量为10μL。
9.如权利要求1所述的HPLC-DAD法测定人血清中喹硫平药物浓度，其特征在于：所述含量为体积比的含量。
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