CN109142340B - 一种固态酶型时间-温度指示剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于智能包装领域，公开了一种固态酶型时间‑温度指示剂是由含酪氨酸的聚乙烯醇水凝胶薄膜Ⅰ和含固定化酪氨酸酶的聚乙烯醇水凝胶薄膜Ⅱ叠放在密闭容器中形成的。本发明得到的固态酶型时间‑温度指示器指示时间长且易于贮存。本发明还公开了其制备方法：包括以下步骤：（1）将聚乙烯醇水溶液和酪氨酸水溶液混合，经冷冻‑解冻法，得到水凝胶薄膜Ⅰ；（2）将聚乙烯醇水溶液和固定化酪氨酸酶分散液混合，经冷冻‑解冻法，得到水凝胶薄膜Ⅱ；（3）将水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ叠合成两层，然后封装于密闭容器中，得到固态酶型时间‑温度指示剂。本发明制备方法工艺简单，易于操作且整个过程为固态，避免液体不易贮存的缺点。
Description
技术领域
本发明属于智能包装领域，具体涉及一种固态酶型时间-温度指示剂及其制备方法。
背景技术
食品，尤其是生鲜类食品，在贮存、运输或销售期间，温度波动对其品质影响极大，为了避免由于温度波动引起食品的变质，需要对食品的整个生命历程进行监控；时间-温度指示器（TTI）通过时间与温度的积累效应反映出被指示产品的全部或部分温度变化历史来指示食品的温度变化历程和剩余货架期寿命，从而为消费者提供有效的食品质量变化信息，消费者可以从视觉信息判断食物是否变质，这有助于确保食品的质量和安全。
TTI按照工作原理分为：酶型、微生物型、聚合物型、电子型和扩散型等。在众多类型的TTI中，酶型TTI原理简单，易于控制。
国外率先开启对酶型时间-温度指示器的研究，目前一些酶型指示器已经实现了商业化。美国专利号2,553,369利用淀粉消化酶水解淀粉，从而使得其特有颜色消失；在美国专利号2,671,028的TTI装置中，随着温度增加，酶作用于底物，引发指示剂中的颜色改变。上述两种发明均会出现明显的颜色变化，易于观察，但是均在水溶液中反应，容易发生泄漏。Livesley在WO 92/05415阐述了一种直接可以应用于包装标签中，以递增浓度放入的酶催化的底物可直接产生不同的显色反应产物，这种技术虽然避免了液体指示剂带来的不便，可直接粘贴在包装材料表面，但是指示时间较短。
国内的吴秋明在其学位论文（应用脲酶开发货架寿命指示体系的研究[D]. 浙江大学, 2005）中应用脲酶开发了一种货架寿命指示体系，但其指示时间仅为80 h；宁鹏在其学位论文（碱性脂肪酶型时间-温度指示卡的研制[D]. 南京农业大学, 2008）中制备了碱性脂肪酶型TTI，其在4°C条件下的监测时间则只有60 h；任星辰在《食品工业科技》（2016,37(10): 251-254）发表的题目为“低温碱性脂肪酶型时间-温度指示剂的研究”中探究了碱性脂肪酶型TTI，通过反应体系的pH值变化原理制成时间温度指示器，反应体系的pH值与时间相关性好，颜色变化为蓝色-深紫-浅紫-无色，变化显著，辨识度高，反应体系无色时即为反应终点，但是，此类指示剂反应物一旦接触，即刻启用。
酶的主要缺点是昂贵、且相对不稳定，即使在水性介质中使用也无法避免。因此，葛雷致力于固态酶型时间温度指示剂的研究，在题目为“Development and Applicationof a Tyrosinase-Based Time-Temperature Indicator (TTI) for Determining theQuality of Turbot Sashimi”（《中国海洋大学学报(英文版)》,2017,16(5):847-854）的论文中对以酪氨酸酶为基础的时间-温度指示剂***进行了初步研究，以酪氨酸酶和酪氨酸的反应为原理，实现对食品的监控，既减少了颜色指示剂的加入，也避免了液态TTI易于泄露和不易控制的缺点，并且可以直接粘附于食品或者包装材料表面，但指示剂时间仅有60h，而大部分生鲜、果蔬类食品在4°C的贮存时间为5～6 d，并不适用于大多数食品的指示。基于此，本发明开发一种固态酶型时间-温度指示剂（TTI）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种指示时间长且易于贮存的固态酶型时间-温度指示剂，提供相应的制备方法是本发明的另一个目的。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：一种固态酶型时间-温度指示剂，包括含有酪氨酸的聚乙烯醇水凝胶薄膜Ⅰ和含固定化酪氨酸酶的聚乙烯醇水凝胶薄膜Ⅱ，水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ叠合成两层，水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ相叠接的面上保留有未被水凝胶薄膜Ⅱ覆盖的区域A；所述固态酶型时间-温度指示剂还包括封装水凝胶薄膜Ⅰ和Ⅱ的密闭容器，所述密闭容器上设有能够使区域A透出的透明观察窗。
进一步地，所述水凝胶薄膜Ⅰ由酪氨酸水溶液与聚乙烯醇水溶液的混合物经冷冻-解冻法制备而成，其中，聚乙烯醇水溶液的浓度为10～35wt%，每10g聚乙烯醇水溶液添加1mL浓度为10～60 mg/mL的酪氨酸水溶液；所述水凝胶薄膜Ⅱ由固定化酪氨酸酶分散液分散到聚乙烯醇水溶液后经冷冻-解冻法制备而成，其中，聚乙烯醇水溶液的浓度为10～35wt%，每3g聚乙烯醇水溶液添加0.1～0.6g的固定化酪氨酸酶分散液。
进一步地，所述水凝胶薄膜Ⅰ为直径6cm的圆形薄膜，由10g聚乙烯醇水溶液与1mL酪氨酸水溶液的混合物注入直径为6cm的模具中经冷冻-解冻法制备成水凝胶薄膜；所述水凝胶薄膜Ⅱ为直径1cm的圆形薄膜，由3g聚乙烯醇水溶液与0.1～0.6g固定化酪氨酸酶分散液的混合物注入直径为1cm的模具中经冷冻-解冻法制备成水凝胶薄膜；水凝胶薄膜Ⅰ与Ⅱ同心叠放。
进一步地，所述固定化酪氨酸酶分散液通过以下步骤制备而成：将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠与酪氨酸酶的混合溶液滴加到氯化钙溶液中形成酪氨酸酶小球，对小球进行洗涤、过滤、定容，得到固定化酪氨酸酶分散液。
进一步地，所述固定化酪氨酸酶分散液由浓度为1~4 wt%的海藻酸钠溶液、浓度为0.1~0.4 wt%的羧甲基纤维素钠溶液与酪氨酸酶溶液混合后滴加到浓度为1~2.5 wt%的氯化钙溶液中形成酪氨酸酶小球，然后对小球进行洗涤、过滤，加水定容至10mL，得到固定化酪氨酸酶分散液；其中，所述酪氨酸酶溶液由1830U酪氨酸酶溶于1mL缓冲溶液中制得，海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液、酪氨酸酶溶液和氯化钙溶液的体积比为5:2:1:（50~100）。
上述固态酶型时间-温度指示剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇水溶液和酪氨酸水溶液混合，经冷冻-解冻法，得到水凝胶薄膜Ⅰ；
（2）将聚乙烯醇水溶液和固定化酪氨酸酶分散液混合，经冷冻-解冻法，得到水凝胶薄膜Ⅱ；
（3）将水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ叠合成两层，然后封装于密闭容器中，得到固态酶型时间-温度指示剂。
进一步地，步骤（1）中，将浓度为10～35wt%聚乙烯醇水溶液和浓度为10～60 mg/mL的酪氨酸水溶液混合均匀，注入到直径为6cm的模具内，经冷冻-解冻法，得到直径为6cm的水凝胶薄膜Ⅰ。
进一步地，步骤（2）中，将浓度为10～35wt%聚乙烯醇水溶液和0.1～0.6g固定化酪氨酸酶分散液的混合，注入到直径为1cm的模具内，经冷冻-解冻法，得到直径为1cm的水凝胶薄膜Ⅱ。
进一步地，所述固定化酪氨酸酶分散液的制备包括以下步骤：
（a）将2 mg的酶活为915 U/mg的酪氨酸酶溶解于1 mL、pH= 6.8的缓冲溶液中制备酪氨酸酶溶液；
（b）配制浓度为1~4 wt%的海藻酸钠溶液；
（c）配制浓度为0.1~0.4 wt%的羧甲基纤维素钠溶液；
（d）取1mL酪氨酸酶溶液、5mL海藻酸钠溶液、2 mL羧甲基纤维素钠溶液混合，加水稀释至10mL；
（e）取50～100mL浓度为1~2.5 wt%的氯化钙溶液，将步骤（d）制得的混合溶液滴入其中，得到固定化酪氨酸酶小球；
（f）将固定化酪氨酸酶小球洗涤、过滤、加水定容到10mL，得到固定化酪氨酸酶分散液。
本发明具有以下技术效果：
（1）本发明提供的固态酶型时间-温度指示剂（TTI）包括固定化酶和酶底物，通过将固定化酪氨酸酶与酪氨酸分别固定于聚乙烯醇（PVA）中，制备出的时间-温度指示剂无需添加颜色指示剂，也避免了液态TTI不易控制的缺点。
（2）凝胶膜由可生物降解的PVA制成，且凝胶本身具有很好的粘性，可直接粘附于食品或者包装材料表面后塑封，随用随启，使用方便，且对人体无毒，应用安全性高，对环境友好。
（3）本发明以海藻酸钠为固定基底，以羧甲基纤维素钠为分散稳定剂，以氯化钙为固定剂制备固定化酪氨酸酶，制备出的固定酶颗粒，颗粒均匀，具有微弹性；其中由于钙离子的耦合作用，将羧基的钠离子置换出来，形成空间网状结构，制备出的固定化酪氨酸酶可以实现初步缓释且固定化酪氨酸酶可多次回收利用，易与反应物分离，成本低廉。
（4）构造TTI缓释体系，将酪氨酸与固定化酪氨酸酶分别固定于PVA中，采用反复冷冻-解冻循环法制备出凝胶缓释薄膜，酪氨酸固定于尺寸较大的PVA薄膜中，固定化酪氨酸酶固定于尺寸较小的PVA薄膜中，酪氨酸酶从海藻酸钙的初步缓释与在PVA中的二次缓释，有效延长了酶促反应的颜色变化（由无色到黑色）时长，在4°C下指示时间可延长至115h，适用于大部分生鲜、果蔬类食品的品质指示。
（5）本发明采用包埋法固定酶技术，此固定技术具有操作简单、省时高效的特点；通过将固定化酪氨酸酶和酪氨酸分别固定于PVA中来制备缓释型时间温度指示剂，其工艺简单，易于操作，且反应物酪氨酸酶经过固定后，性能优良，可进行反复利用。
附图说明
图1为海藻酸钠浓度对释放速率的影响图；
图2为羧甲基纤维素钠浓度对释放速率的影响图；
图3为氯化钙浓度对释放速率的影响图；
图4为酪氨酸含量对TTI指示时间的影响图；
图5为酪氨酸酶含量对TTI指示时间的影响图；
图6为 PVA 浓度对TTI指示时间的影响图；
图7为TTI的初始状态照片；
图8为TTI的最终状态照片；
图中，1-水凝胶薄膜Ⅰ，2-水凝胶薄膜Ⅱ，3-区域A。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 固定化酪氨酸酶分散液的制备
（一）通过如下步骤制备固定化酪氨酸酶分散液：
（a）将2 mg的酶活为915 U/mg的酪氨酸酶溶解于1 mL、pH= 6.8的缓冲溶液中制备酪氨酸酶溶液，其中，缓冲溶液为PBS缓冲溶液，由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠制得；
（b）配制海藻酸钠溶液；
（c）配制羧甲基纤维素钠溶液；
（d）取1mL酪氨酸酶溶液、5mL海藻酸钠溶液、2 mL羧甲基纤维素钠溶液混合，加水稀释至10mL；
（e）配制氯化钙（CaCl2）溶液，并取100mL，将步骤（d）制得的混合溶液滴入其中，得到固定化酪氨酸酶小球；
（f）将固定化酪氨酸酶小球用水洗涤三次、然后加水定容到10mL，得到固定化酪氨酸酶分散液，将其置于4°C下贮存备用。
（二）配制不同浓度的海藻酸钠溶液，配制浓度为0.3wt%的羧甲基纤维素钠溶液，配制浓度为2wt%的氯化钙（CaCl2）溶液，结合上述步骤进行单因素实验，考察海藻酸钠溶液浓度对固定化酪氨酸酶小球的影响，主要实验参数见表1。其中，待制得的固定化酪氨酸酶小球稳定后，利用螺旋测微仪测量小球直径，根据测量结果取平均值，即为表中所列固定化酪氨酸酶小球粒径。
表1海藻酸钠浓度的变化
通过紫外分光光度计，在λ=475 nm处，分别测定实施例1-1至实施例1-4制得的固定化酪氨酸酶分散液在不同放置时间的吸光值，以时间为横坐标、以吸光值为纵坐标作图，如图1所示。从图1可以看出，酪氨酸酶的释放速率的变化趋势为先增加后趋于平稳。这是由于在反应初期释放的酪氨酸酶较快，随着海藻酸钠浓度的增加，吸光度值变化呈现先增加后缓慢降低的趋势。当海藻酸钠含量为1 wt%时，溶液的吸光值增长速度较为缓慢，因为此时溶液中L-多巴的生成速率慢，进而说明固定酪氨酸酶的释放速率较低。当海藻酸钠增加到4 wt%时，吸光度值反而出现下降，这说明固定化酶的释放速率下降，这是由于当海藻酸钠超过最适值之后，酪氨酸酶固定后形成致密的空间网状结构，酪氨酸酶扩散时受到的阻力增加，从而酪氨酸酶活力减弱，降低酪氨酸酶与酪氨酸反应的速度，吸光度值增长受到限制。当海藻酸钠的浓度为2 wt%和3 wt%时，酪氨酸酶颗粒球状表面圆滑并且强度大。但是实验过程中发现海藻酸钠浓度为3 wt%的反应体系的颜色变化较浅，不利于记录，综上所述，最终选取的最佳海藻酸钠浓度为2 wt%。
取部分固定化酪氨酸酶小球倒入培养皿中观察，发现随着海藻酸钠浓度的增大，形成的固定酶的粒径也逐渐增大。测量小球的粒径，并计算平均直径，见表1，随着海藻酸钠浓度的增大，固定酶颗粒直径逐渐增大，从1.69 mm增长到了2.65 mm。这是因为当海藻酸钠的浓度增大时，其单位体积内能与离子结合的位点数量也随之增加。
（三）配制不同浓度的羧甲基纤维素钠溶液，配制浓度为2wt%的海藻酸钠溶液，配制浓度为2wt%的氯化钙（CaCl2）溶液，结合上述步骤进行单因素实验，考察羧甲基纤维素钠溶液浓度对固定化酪氨酸酶小球的影响，主要实验参数见表2。
表2羧甲基纤维素钠浓度的变化
通过紫外分光光度计，在λ=475 nm处，分别测定实施例1-5、1-6、1-2及1-7制得的固定化酪氨酸酶小球分散液在不同放置时间的吸光值，以时间为横坐标、以吸光值为纵坐标作图，在图2中可以看出羧甲基纤维素钠对酪氨酸酶的释放速率的影响。随着其含量的增加，酪氨酸酶的释放量也逐渐增加。当羧甲基纤维素钠浓度为0.3 wt%和0.4 wt%时，吸光值上升很快，因为反应中的酪氨酸酶释放速率较快；而当其浓度为0.1 wt%时，溶液的吸光值上升速度较为缓慢，这时溶液中L-多巴的生成速率较低，同时可以推断出此时酪氨酸酶的释放速率较低。在图中我们可以看出羧甲基纤维素钠浓度为0.3 wt%和0.4 wt%时，吸光度值上升趋势相同且释放速率相差无几。但是实验过程中发现羧甲基纤维素钠浓度为0.4wt%时，机械强度过大且和成球难度较大，反应体系的颜色变化较浅不太利于肉眼的观察。综上所述，当羧甲基纤维素钠质量分数为0.3 wt%时，制备的固定化酪氨酸酶性能较优。
取部分固定化酪氨酸酶小球倒入培养皿中观察，发现随着CMC浓度的增大，形成的固定酶的粒径也逐渐增大。表2可以看出不同浓度的羧甲基纤维素钠（CMC）对固定化酶形态的影响。CMC的浓度0.1 wt%~0.4 wt%均可制备出透明球状的固定化酶小颗粒。其中，0.2wt%的CMC固定酪氨酸酶，制备的固定化酶球面平滑且强度大。这可能是在适宜的浓度范围内，随着CMC浓度的增加酪氨酸酶经固定后强度升高，但当其浓度进一步增加到0.4 wt%时，整个体系的粘度会增大，固定化酶的颗粒直径也会增加。因此，实验选择0.3 wt%的CMC作为最佳浓度进行固态酶型TTI的制备奠定基础。
（四）配制不同浓度的氯化钙溶液，配制浓度为0.3wt%的羧甲基纤维素钠溶液，配制浓度为2wt%的海藻酸钠溶液，结合上述步骤进行单因素实验，考察氯化钙溶液浓度对固定化酪氨酸酶小球的影响，主要实验参数见表3。
表3氯化钙浓度的变化
通过紫外分光光度计，在λ=475 nm处，分别测定实施例实施例1-8、1-2、1-9及1-10制得的固定化酪氨酸酶小球分散液的在不同时间的吸光值，以时间为横坐标、以吸光值为纵坐标作图，如图3所示。从图3可以看出氯化钙含量对释放速率的影响。随着氯化钙含量的增加，酪氨酸酶的释放量也逐渐增加。当氯化钙的浓度为1 wt%、1.5 wt%和2 wt%时，吸光值上升较快，这表明酪氨酸酶在固定体系中的释放速率较快；使用1 wt%氯化钙固定酪氨酸酶时，溶液的吸光值上升较为缓慢且吸光值较低，说明此时溶液中L-多巴的生成速率和生成量较低，并且生成的固定酪氨酸酶的颗粒强度低；当CaC12浓度为2.5 wt%时，吸光度值下降，可以推断出此时酪氨酸酶的释放速率较低，这是因为当氯化钙含量增大超过某一个值时，包埋法形成的结构过于致密，酪氨酸酶向外释放受到抑制。CaC12浓度过高会加大形成过高的空间网状结构对酪氨酸酶结构的挤压破坏，减弱酪氨酸酶的活性；另一方面，制备出的固定化酪氨酸酶颗粒存在拖尾现象。综上所述，固定酪氨酸酶单因素中CaC12的浓度确定为2 wt%。
取部分固定化酪氨酸酶小球倒入培养皿中观察，发现随着氯化钙溶液浓度的逐渐增加，固定酶的透明球体的直径先增大后减小。这是因为在固定酪氨酸酶的过程中，CaC12会影响形成固定酶的交联程度。因此，CaC12溶液的浓度越大，固定化酶颗粒致密性增加，凝胶内部的阻力也会出现不同程度的增大。在表3可看出当CaC12浓度为2.5 wt%时，CaC12会对酶形状进行挤压，形成的固定化酶颗粒为1.59 mm。综合以上结果，实验选择浓度为2 wt%的CaC12溶液进行下一步操作。
综上，确定实施例1-2为最佳实施例，制备的固定化酪氨酸酶小球粒径为低于2mm，尺寸粒径比传统的粒径小，且形成的颗粒均匀，具有微弹性，固定化酪氨酸酶可以实现初步缓释，缓释效果良好，可延长TTI的指示时间。
实施例2 固态酶型时间-温度指示剂及其制备方法
固态酶型时间-温度指示剂（TTI），包括水凝胶薄膜Ⅰ和水凝胶薄膜Ⅱ。
水凝胶薄膜Ⅰ为直径6cm的圆形薄膜，由10g聚乙烯醇水溶液与1mL酪氨酸水溶液的混合物注入直径为6cm的模具中经冷冻-解冻法制备成水凝胶薄膜；
水凝胶薄膜Ⅱ为直径1cm的圆形薄膜，由3g聚乙烯醇水溶液与0.1～0.6g固定化酪氨酸酶分散液的混合物注入直径为1cm的模具中经冷冻-解冻法制备成水凝胶薄膜；
水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ同心叠合成两层结构，然后将水凝胶薄膜Ⅰ与Ⅱ形成的两层结构封装早透明塑料膜中，水凝胶薄膜Ⅰ上未被水凝胶薄膜Ⅱ覆盖的环形区域即为区域A，透明膜作为一个大的观察窗，能够观察到区域A的颜色变化。形成的TTI产品的照片如图7所示，图8是TTI变色后到达指示终点的照片，图中编号1对应水凝胶薄膜Ⅰ，2对应水凝胶薄膜Ⅱ，3对应区域A。
或是水凝胶薄膜Ⅰ的一面贴敷于食品或食品包装上，然后将透明膜水凝胶薄膜Ⅱ贴在水凝胶薄膜Ⅰ的另一面，进一步在外侧覆盖透明塑料膜，塑料膜与食品或食品包装围合成密闭容器。
作为其他的实施方式，可以将水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ制成方形、三角形、六边形或其他异型形状，两者叠合成两层结构，但应在水凝胶薄膜Ⅰ表面留出未被水凝胶薄膜Ⅱ的区域A。可将上述两层结构封装在提前制备好的泡罩中，在暴露区域A的一面全部设置透明观察窗，或是只在与区域A对应的位置设置透明观察窗。
固态酶型时间-温度指示剂的制备方法包括以下步骤：
（1）取10g聚乙烯醇水溶液和lmL浓度酪氨酸水溶液混合均匀，注入到直径为6cm的模具内，经冷冻-解冻法，冷冻温度为-20°C，解冻温度为26°C，每隔两小时交替循环，冷冻和解冻为一个完整过程，共循环4次，得到直径为6cm的水凝胶薄膜Ⅰ。
（2）取3g聚乙烯醇水溶液和0.1～0.6g固定化酪氨酸酶分散液混合均匀，注入到直径为1cm的模具内，经冷冻-解冻法，冷冻温度为-20°C，解冻温度为26°C，每隔两小时交替循环，冷冻和解冻为一个完整过程，共循环4次，得到直径为1cm的水凝胶薄膜Ⅱ。
（3）将上述制备的水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ同心叠放成双层结构，然后将该两层结构封装在透明塑料膜中，即得到固态酶型时间-温度指示剂。能看到水凝胶薄膜Ⅱ的一面为观察面。
其中，聚乙烯醇水溶液的浓度控制在10～35wt%，酪氨酸水溶液浓度控制在10～60mg/mL；固定化酪氨酸酶分散液利用实施例1～2的方法制备，固定化酪氨酸酶分散液的用量控制在0.1～0.6g。在实施例中的具体取值见表4～6。
（一）不同酪氨酸含量对指示时间的影响
参照上述方法和表4参数制备TTI。
表4酪氨酸含量变化对指示时间的影响
将实施例2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6制得的TTI至于4℃下观察，当水凝胶薄膜由透明变为黑色时即到达指示终点，记录指示时间具体数据列于表4。
以TTI中酪氨酸的含量为横坐标、以指示时间为纵坐标作图，得到酪氨酸含量对TTI指示时间的影响图，如图4所示，考察酪氨酸含量变化对指示时间的影响。从图中可以看出，TTI的指示时间随着酪氨酸含量的增加不断增加。酪氨酸酶含量不变，在酪氨酸含量在20～40 mg时，酶促反应的颜色变化明显，易于观察。当酪氨酸含量为50～60 mg时，颜色变化快；当酪氨酸含量为10 mg时，TTI的颜色变化和扩散范围较小，不便于观察与记录。综上以上结果，固态TTI中单因素酪氨酸含量的最佳范围为20～40 mg。
（二）不同酪氨酸酶含量对指示时间的影响
参照上述方法和表5参数制备TTI。
表5酪氨酸酶含量指示时间的影响
将实施例2-7、2-8、2-3、2-9、2-10、2-11制得的TTI至于4℃下观察，当水凝胶薄膜由透明变为黑色时即到达指示终点，记录指示时间，具体数据列于表5。
以TTI中固定化酪氨酸酶分散液的重量为横坐标、以指示时间为纵坐标作图，得到酪氨酸酶含量对TTI指示时间的影响图，如图5所示，考察固定化酪氨酸酶分散液的重量变化对指示时间的影响。从图5可以看出TTI的指示时间随着酪氨酸酶含量的增加不断减小。酪氨酸含量不变，随着酪氨酸酶含量的增加，酶促反应增长速度加快，当酪氨酸酶为0.5 g～0.6 g时，指示时间短，不利于分析记录TTI的响应时间。在酪氨酸酶含量为0.1 g时，TTI的颜色变化慢，不利于观察与记录。由此可得，固态TTI中单因素酪氨酸酶含量的最佳范围确定为0.2～0.4 g。
（三）不同PVA含量对指示时间的影响
参照上述方法和表6参数制备TTI。
表6 PVA 浓度对指示时间的影响
将实施例2-12、2-13、2-3、2-14、2-15、2-16、制得的TTI至于4℃下观察，当水凝胶薄膜由透明变为黑色时即到达指示终点，记录指示时间，具体数据列于表6。
以TTI中PVA的含量为横坐标、以指示时间为纵坐标作图，得到PVA 浓度对TTI指示时间的影响图，如图6所示，考察PVA含量变化对指示时间的影响。从图6中可以看出，TTI的指示时间随着PVA浓度的增加出现逐步增长的趋势。当PVA浓度增加到35 wt%，PVA凝胶形成的网状结构过于致密，严重影响反应物的扩散，导致TTI的扩散圈很小，不利于观察与记录。此外，PVA浓度为35 wt%，在溶解过程中极易凝结，影响PVA的透明度；当PVA浓度为10 wt%时，形成的PVA薄膜的力学性能极差，容易破损。因此，固态TTI的单因素中PVA的适宜浓度范围是15 wt%～25 wt%。
综上，固态酶型时间-温度指示剂的适宜范围为：水凝胶薄膜Ⅰ中酪氨酸含量的最佳范围为20～40 mg，PVA的适宜浓度范围是15 wt%～25 wt%；水凝胶薄膜Ⅱ中固定化酪氨酸酶水溶液的适宜范围确定为0.2～0.4 g，PVA的适宜浓度范围是15 wt%～25 wt%，在4°C的温度下，得到指示时间的范围为：65～115 h。
（四）TTI的颜色变化
如图7所示，TTI开始反应时，即初始状态的颜色为无色，随着指示时间的增加，TTI的样色逐渐变深，如图8所示，当颜色为黑色时，TTI达到最终指示时间。
Claims (2)
1.一种固态酶型时间-温度指示剂，其特征在于，包括含有由酪氨酸水溶液与聚乙烯醇水溶液的混合物经冷冻-解冻法制备而成的水凝胶薄膜Ⅰ和由固定化酪氨酸酶分散液分散到聚乙烯醇水溶液后经冷冻-解冻法制备而成的水凝胶薄膜Ⅱ，水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ叠合成两层，凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ相叠接的面上保留有未被水凝胶薄膜Ⅱ覆盖的区域A；其中，所述水凝胶薄膜Ⅰ中聚乙烯醇水溶液的浓度为20wt%，每10g聚乙烯醇水溶液添加1mL浓度为40mg/mL的酪氨酸水溶液；所述水凝胶薄膜Ⅱ中聚乙烯醇水溶液的浓度为20wt%，每3g聚乙烯醇水溶液添加0.3g的固定化酪氨酸酶分散液；所述固态酶型时间-温度指示剂还包括封装水凝胶薄膜Ⅰ和Ⅱ的密闭容器，所述密闭容器上设有能使区域A透出的透明观察窗；
所述水凝胶薄膜Ⅰ为直径6cm的圆形薄膜，由10g聚乙烯醇水溶液与1mL酪氨酸水溶液的混合物注入直径为6cm的模具中经冷冻-解冻法制备成水凝胶薄膜；所述水凝胶薄膜Ⅱ为直径1cm的圆形薄膜，由3g聚乙烯醇水溶液与0.3g固定化酪氨酸酶分散液的混合物注入直径为1cm的模具中经冷冻-解冻法制备成水凝胶薄膜；水凝胶薄膜Ⅰ与Ⅱ同心叠放；
所述固定化酪氨酸酶分散液由浓度为2wt%的海藻酸钠溶液、浓度为0.3wt%的羧甲基纤维素钠溶液与酪氨酸酶溶液混合后滴加到浓度为2wt%的氯化钙溶液中形成酪氨酸酶小球，然后对小球进行洗涤、过滤，加水定容至10mL，得到固定化酪氨酸酶分散液；其中，所述酪氨酸酶溶液由1830U酪氨酸酶溶于1mL缓冲溶液中制得，海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液、酪氨酸酶溶液和氯化钙溶液的体积比为5:2:1:50～100。
2.权利要求1所述的固态酶型时间-温度指示剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇水溶液和酪氨酸水溶液混合，经冷冻-解冻法，得到水凝胶薄膜Ⅰ；
（2）将聚乙烯醇水溶液和固定化酪氨酸酶分散液混合，经冷冻-解冻法，得到水凝胶薄膜Ⅱ；
（3）将水凝胶薄膜Ⅰ与水凝胶薄膜Ⅱ叠合成两层，然后封装于密闭容器中，得到固态酶型时间-温度指示剂；
所述固定化酪氨酸酶分散液的制备包括以下步骤：
（a）将2 mg的酶活为915 U/mg的酪氨酸酶溶解于1 mL、pH= 6.8的缓冲溶液中制备酪氨酸酶溶液；
（b）配制浓度为2wt%的海藻酸钠溶液；
（c）配制浓度为0.3wt%的羧甲基纤维素钠溶液；
（d）取1mL酪氨酸酶溶液、5mL海藻酸钠溶液、2 mL羧甲基纤维素钠溶液混合，加水稀释至10mL；
（e）取50～100mL浓度为2wt%的氯化钙溶液，将步骤（d）制得的混合溶液滴入其中，得到固定化酪氨酸酶小球；
（f）将固定化酪氨酸酶小球洗涤、过滤、加水定容到10mL，得到固定化酪氨酸酶分散液；
所述步骤（1）中，将浓度为20wt%聚乙烯醇水溶液和浓度为40mg/mL的酪氨酸水溶液混合均匀，注入到直径为6cm的模具内，经冷冻-解冻法，得到直径为6cm的水凝胶薄膜Ⅰ；所述步骤（2）中将浓度为20wt%聚乙烯醇水溶液和0.3g固定化酪氨酸酶分散液的混合，注入到直径为1cm的模具内，经冷冻-解冻法，得到直径为1cm的水凝胶薄膜Ⅱ。
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