CN109136156B - 固体复合菌剂及其制备方法和在铁皮石斛栽培中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固体复合菌剂，该菌剂包含巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NL‑7菌剂、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)NL‑11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)NL‑1菌剂。还公开了上述复合菌剂的制备方法及其在铁皮石斛栽培中的应用。本发明的优点在于：本发明固体复合菌剂施加到铁皮石斛后，增加了单位种植面积铁皮石斛茎干重，提高了石斛多糖含量，可提高铁皮石斛的药用价值，具有很好的应用开发前景。

Description

固体复合菌剂及其制备方法和在铁皮石斛栽培中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一种固体复合菌剂及其制备方法和在铁皮石斛栽培中的应用。
背景技术
微生物菌剂作为一种新型栽培基质改良剂，施入土壤后，通过其特定菌株的快速繁殖，能改善土壤养分供给状况，发挥环境养分的潜力，为作物生长营造一个良好的土壤微环境，在降低环境污染、提高作物产量和品质等方面具有重要意义。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kmiura et Migo)为兰科石斛属植物，是我国传统名贵中药材，在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，具有养阴生津、润喉护嗓、温胃明目、补肾益力、延年益寿的功效。现代药理研究表明，铁皮石斛药用活性强弱与多糖量高低相关，其多糖具有提高免疫力、抗衰老、抑制肿瘤、降血糖、降血压等功效。铁皮石斛生长范围广，但面积小，基本上呈点状分布，其喜温暖、湿润、阴凉的环境，局限生长于山地湿润而又郁闭的原生性阔叶林中，特别是悬崖峭壁、下临深潭、有斜射阳光反射、山岭重叠、沟壑纵横的小生境，以其气生根着生于满布苔藓的有腐殖质聚集的岩石或枯朽树上。
由于铁皮石斛极高的药用价值，其野生资源被大量采挖，加上其特殊的生长环境，导致铁皮石斛的野生资源濒临灭绝。目前铁皮石斛主要为人工栽培，但人工栽培存在多糖含量低、药效不如野生等问题。人们已经发现铁皮石斛内生真菌对其生长有促进作用，还能提高其次生代谢产物含量。但是对于直接作用于铁皮石斛栽培基质的微生物固体复合菌剂的使用，目前尚未见报道。
专利CN103087953A公开了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NL-7，保藏编号CCTCC NO：M 2012452，保藏日期：2012年11月9日；专利CN103087954A公开了苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)NL-11，保藏编号CCTCC NO：M 2012453，保藏日期：2012年11月9日；专利CN103103151A公开了嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)NL-1，保藏编号CCTCC NO：M 2012460，保藏日期：2012年11月19日。上述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学。上述三种菌株均从岩石表面菌落筛选获得，对石灰岩有很强的侵蚀能力，能促进岩石中Ca、Mg等主要离子的释放，加速石灰岩侵蚀成土；能降低喷播基质容量，增强喷播基质的抗冲性和抗剪性。其中，巨大芽孢杆菌NL-7和苏云金芽孢杆菌NL-11还有解K、P的潜能；而资料显示，嗜热一氧化碳链霉菌类有降解纤维素性能。但目前尚无将三者复配使用的报道，也无将其用于以岩石和树皮为主体的铁皮石斛栽培基质中的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种能够增加铁皮石斛的茎干重和提高石斛多糖含量的固体复合菌剂及其制备方法和在铁皮石斛栽培中的应用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一方面，提供一种固体复合菌剂，该固体复合菌剂包含：巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)NL-1菌剂。
优选地，巨大芽孢杆菌NL-7菌剂和苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂活菌数均大于4×108个/g，嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂活菌数大于1.5×108个/g。
优选地，巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂的重量比为1:1:1。
另一方面，还提供上述固体复合菌剂的制备方法，该方法包括：分别将巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株接种至活化培养基，进行活化培养；将活化后的菌株分别接种至种子培养基培养，获得菌株种子液；按照固体基质重量的3％～5％分别将巨大芽孢杆菌NL-7菌株种子液、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株种子液和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株种子液接入固体基质中培养，获得巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂；将巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂按照重量比1:1:1混合均匀，即得固体复合菌剂。
优选地，巨大芽孢杆菌NL-7和苏云金芽孢杆菌NL-11菌株种子液中菌株均不少于1.5×109cfu，嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株种子液菌丝体达到浓稠。
优选地，巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株的活化培养基成分为5g蔗糖、2g Na2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.005g FeCl3、0.5g CaCO3、18g琼脂粉和1000mL水；嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株的活化培养基成分为1g KNO3、20g可溶性淀粉、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.5g NaCl、0.5gCaCO3、0.01g FeSO4、18g琼脂粉和1000mL水，每300mL培养基中加入1mL浓度为3％的重铬酸钾。
优选地，巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株的种子培养基成分为5g蔗糖、2g Na2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.005g FeCl3、0.5g CaCO3和1000mL水；嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株的种子培养基成分为1g KNO3、20g可溶性淀粉、0.5g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.5g NaCl、0.5g CaCO3、0.01g FeSO4和1000mL水，每300mL培养基中加入1mL浓度为3％的重铬酸钾。
优选地，固体基质包含麸皮、黄豆粉和玉米粉，麸皮、黄豆粉和玉米粉的重量比为3:1:1。
优选地，菌株活化培养的温度为28℃，巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株的活化培养时间为2～3天；嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株的活化培养时间为4～6天；
菌株种子液培养的培养条件为28℃，180r/min震荡培养2～3天；
菌株种子液在固体基质中培养的温度为28℃，时间为8～10天。
又一方面，还提供固体复合菌剂在铁皮石斛栽培中的应用。
栽培方法为：将泥炭土、珍珠岩、松树皮、羊粪和菜籽饼混匀，经覆膜堆肥发酵40～60天后，用孔径约2～3cm的网筛筛分发酵物。将穿过网筛的发酵物，作为上层栽培基质，备用；将未穿过网筛的发酵物与粒级为3～4cm的石子按体积比为2:3混合，作为底层栽培基质，备用。栽培铁皮石斛时，将上层栽培基质与固体复合菌剂按质量比96:4混匀，覆盖铁皮石斛根部。
优选地，泥炭土、珍珠岩、松树皮、羊粪与菜籽饼的质量比为10:10:60:3:2。
优选地，上层栽培基质的厚度为2～3cm，底层栽培基质的厚度为5～8cm。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的固体复合菌剂，通过特定的菌株种类及配比，能够增加单位种植面积铁皮石斛茎干重、提高石斛多糖含量，使用方便快捷，具有很好的应用开发前景。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NL-7菌株公开于专利CN103087953A中；苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)NL-11菌株公开于专利CN103087954A中，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)NL-1菌株公开于专利CN103103151A中，上述菌株均取自中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
实施例1制备固体复合菌剂：
培养基的制备：苏云金芽孢杆菌NL-11、巨大芽孢杆菌NL-7的活化培养基成分为：5g蔗糖、2g Na2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.005g FeCl3、0.5g CaCO3、18g琼脂粉和1000mL水。苏云金芽孢杆菌NL-11、巨大芽孢杆菌NL-7的种子培养基成分与活化培养基成分的区别仅在于种子培养基中不添加琼脂粉。嗜热一氧化碳链霉菌NL-1的活化培养基成分为：1gKNO3、20g可溶性淀粉、0.5gK2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.5g NaCl、0.5g CaCO3、0.01gFeSO4、18g琼脂粉和1000mL水，每300mL培养基中加入1mL浓度为3％重铬酸钾。嗜热一氧化碳链霉菌NL-1的种子培养基成分与活化培养基成分的区别仅在于种子培养基中不添加琼脂粉。上述培养基经121℃，30min灭菌备用。
菌株活化：取保存的苏云金芽孢杆菌NL-11、巨大芽孢杆菌NL-7菌株涂布在装有其活化培养基的培养皿中，于28℃培养2～3天，备用。取保存的嗜热一氧化碳链霉菌NL-1涂布在装有其活化培养基的培养皿中，于28℃培养4～6天，备用。
种子液制备：分别用接种针取上述活化的苏云金芽孢杆菌NL-11、巨大芽孢杆菌NL-7、嗜热一氧化碳链霉菌NL-1的纯菌，分别接种于装有50mL各自种子培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min震荡培养2～3天，获得菌株种子液。其中，巨大芽孢杆菌NL-7和苏云金芽孢杆菌NL-11菌株种子液中菌株数不少于1.5×109cfu；嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株种子液菌丝体达到浓稠。
固体基质预处理：将3Kg麸皮、1Kg黄豆粉、1kg玉米粉蒸熟后晾干、捣碎、混匀。接种前121℃，30min灭菌。灭菌后在无菌通风处晾干，防止结块。
固体菌剂的制备：按照固体基质重量3％～5％的量，分别将上述制备的巨大芽孢杆菌NL-7菌、苏云金芽孢杆菌NL-11菌和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌的种子液接种到上述固体基质中混匀，用蒸馏水调节混合物的含水量为60％左右，将其装入灭菌后的一次性纸质餐盒，用4层灭菌纱包裹，置于28℃培养，每间隔2天在超净工作台上，无菌环境下翻动、搅拌，重新装入灭菌后的一次性纸质餐盒，用4层灭菌纱包裹，置于28℃培养，8～10天后即获得巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂。其中，巨大芽孢杆菌NL-7菌剂和苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂活菌数大于4×108个/g，嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂活菌数大于1.5×108个/g。
固体复合菌剂的制备：将巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂按照重量比1:1:1混合均匀，即制备出固体复合菌剂。所获得的固体复合菌剂为棕色、微臭味粉剂。
实施例2固体复合菌剂在铁皮石斛栽培中的应用
将泥炭土10Kg、珍珠岩10Kg、松树皮60Kg、羊粪3Kg、菜籽饼2Kg混匀，经覆膜堆肥发酵，40～60天后，用孔径约2～3cm的网筛筛分。将穿过网筛的发酵物作为覆盖铁皮石斛根部的上层栽培基质，覆盖厚度为2～3cm；将未穿过网筛的粗大的树皮等发酵物与粒级为3～4cm的石子按体积比2:3混匀后铺在底层作为底层栽培基质，厚度为5～8cm。
铁皮石斛的种植密度为每平米10×10丛，每丛3～5株。第一年春季4月份栽培，上层栽培基质与实施例1制备的固体复合菌剂按重量比96:4混匀使用。设置对照基质组和空白对照组，对照基质组与上述固体复合菌剂组区别仅在于，铁皮石斛上层栽培基质中添加等量对照基质，对照基质的处理同固体菌剂的制备，在固体基质中加入等量不接入菌株的相应三种菌株的种子培养基；空白对照组与上述栽培基质的区别仅在于，上层栽培基质不做任何处理，即不添加固体复合菌剂或对照基质。第二年4月份再向上层栽培基质中加入上层栽培基质重量2％的固体复合菌剂(对照基质组添加等量的对照基质，空白对照组不做任何处理)，其他管理措施一致，每种处理设置多个样地重复。
第二年12月份采集铁皮石斛当年生地上部分茎(选择长势相似的区域用于采样分析)，置于60℃烘箱烘干致恒重，分别称量其茎干重；多糖含量测定按照2015版《中国药典》(一部)药材和饮片中“铁皮石斛”多糖含量测定方法测定。
单位种植面积茎干重反映了铁皮石斛药用部分产量，由表1可见，固体复合菌剂处理后茎干重分别比对照基质组和空白对照组高出14.5％、15.5％，对照基质组与空白对照组的茎干重无显著性差异。
石斛多糖是铁皮石斛药用的主要成分，反映了铁皮石斛的品质，2015版《中国药典》(一部)规定石斛多糖不得少于25.0％。由表1可知，固体复合菌剂处理后茎中石斛多糖平均含量为38.1％，比对照基质组和空白对照组提高了22.1％和23.3％，对照基质组与空白对照组的石斛多糖含量无显著性差异。
表1固体复合菌剂对铁皮石斛茎干重和石斛多糖含量的影响
处理 茎干重(g/m<sup>2</sup>) 石斛多糖(％)
固体复合菌剂组 119.4±11.3a 38.1±4.3a
对照基质组 104.3±9.9b 31.2±4.8b
空白对照组 103.4±9.4b 30.9±4.7b
注：表中数值为均数±标准差，同列不同字母表示处理间在0.05水平上存在显著差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种固体复合菌剂在铁皮石斛栽培中的应用，其特征在于，所述固体复合菌剂为：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NL-7菌剂，其保藏编号为：M2012452；
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)NL-11菌剂，其保藏编号为：M2012453；
嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)NL-1菌剂， 其保藏编号为：M2012460。
2.根据权利要求1所述的固体复合菌剂在铁皮石斛栽培中的应用，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌NL-7菌剂和苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂活菌数均大于4×108个/g，所述嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂活菌数大于1.5×108个/g。
3.根据权利要求1所述的固体复合菌剂在铁皮石斛栽培中的应用，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂的重量比为1:1:1。
4.权利要求1至3中任一项所述的固体复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：分别将巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株接种至活化培养基，进行活化培养；将活化后的菌株分别接种至种子培养基培养，获得菌株种子液；按照固体基质重量的3％～5％分别将巨大芽孢杆菌NL-7菌株种子液、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株种子液和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株种子液接入所述固体基质中培养，获得芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂；将所述巨大芽孢杆菌NL-7菌剂、苏云金芽孢杆菌NL-11菌剂和嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌剂按照重量比1:1:1混合均匀，即得固体复合菌剂。
5.根据权利要求4所述的固体复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌NL-7和苏云金芽孢杆菌NL-11菌株种子液中菌株均不少于1.5×109cfu，所述嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株种子液菌丝体达到浓稠。
6.根据权利要求4所述的固体复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株的活化培养基成分为5g蔗糖、2g Na2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.005g FeCl3、0.5g CaCO3、18g琼脂粉和1000mL水；所述嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株的活化培养基成分为1g KNO3、20g可溶性淀粉、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.5g NaCl、0.5g CaCO3、0.01g FeSO4、18g琼脂粉和1000mL水，每300mL培养基中加入1mL浓度为3％的重铬酸钾；
所述巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株的种子培养基成分为5g蔗糖、2g Na2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.005g FeCl3、0.5g CaCO3和1000mL水；所述嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株的种子培养基成分为1g KNO3、20g可溶性淀粉、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.5g NaCl、0.5g CaCO3、0.01g FeSO4和1000mL水，每300mL培养基中加入1mL浓度为3％的重铬酸钾；
所述固体基质为麸皮、黄豆粉和玉米粉，麸皮、黄豆粉和玉米粉的重量比为3:1:1。
7.根据权利要求4所述的固体复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌株活化培养的温度为28℃，所述巨大芽孢杆菌NL-7菌株、苏云金芽孢杆菌NL-11菌株的活化培养时间为2～3天；所述嗜热一氧化碳链霉菌NL-1菌株的活化培养时间为4～6天；
所述菌株种子液培养的培养条件为28℃，180r/min震荡培养2～3天；
所述菌株种子液在固体基质中培养的温度为28℃，时间为8～10天。
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