CN109134516B - 一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药以及一种光调控纳米药物及应用 - Google Patents

一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药以及一种光调控纳米药物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种光调控纳米药物，以式Ⅰ所示的具有肿瘤微环境响应的二聚体前药，两亲性高分子材料和共载药物，通过自组装形成纳米粒。形成的核壳结构纳米药物具有超高载药量和良好的稳定性。在光照的条件下，能够特异性的释放药物，实现协同抗肿瘤治疗。

Description

一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药以及一种光调控纳米 药物及应用
技术领域
本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药以及一种光调控纳米药物及应用。
背景技术
聚合物纳米药物通常是指利用两亲性聚合物分子间的相互作用，将小分子药物包载在自组装的载体内部，形成外部亲水、内部疏水的纳米药物递送***。纳米药物独特的结构可以有效的增加疏水药物的溶解性，提高稳定性，延长体内的循环时间。纳米药物递送至体内后，可以有效逃避人体网状内皮***吞噬，穿过毛细血管及血脑屏障被细胞摄取。同时利用载体自身的优势实现药物的靶向递送和可控释放，提高药物疗效并降低毒副作用。目前已有基于聚酯(Genexol-PM)、聚氨基酸(NK105、NC6004、CT-2103)的纳米药物被批准上市或正处于临床试验阶段。
近年来，虽然聚合物纳米药物凭借其显著的优势迅猛发展，但是依然限制于自身的性质(载药量、稳定性、释放性能)无法成功的临床转化。目前，常用的药物包载方式为简单的物理包载，然而由于药物之间强烈的疏水作用和π-π相互作用，往往无法获得超高的载药量。此外，由于药物不具有选择性，也会造成正常组织损伤、肿瘤耐药和疗效降低。在聚合物上通过刺激敏感键共价结合药物可以提高纳米药物的载药量，实现药物在瘤内的特异性释放。但是此举会改变聚合物的亲疏水性，并可能对纳米药物的结构尺寸等造成影响。
此外，聚合物载体需要具有良好的生物相容性和生物可降解性，合成工艺成熟、易大规模生产，价格低廉，为临床转化奠定良好的基础。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药以及一种光调控纳米药物及应用，在光照的条件下，能够特异性的释放药物，实现协同抗肿瘤治疗。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药，具有式Ⅰ所示结构：
Figure BDA0001778422990000011
其中，R1为对肿瘤内过度表达的ROS敏感时，可“自消除”脱落、具有肿瘤微环境ROS敏感性的基团；或对肿瘤内的乏氧环境敏感时，可“自消除”脱落、具有肿瘤乏氧敏感性的基团。
在本发明的一些具体实施例中，R1为具有肿瘤微环境ROS敏感性的基团，具体为硼酸基团、二烃基硼酸基团、二芳香基硼酸基团、芳烷基硼酸基团、环戊硼烷基团、二氧环戊硼烷基团。
其中，所述硼酸基团指-BO3。
所述二烃基硼酸基团指-BO(R9)2；R9优选为取代或非取代的C1～C10的烷基，更优选为取代或非取代的C1～C6的烷基，在本发明的一些具体实施例中，所述R9为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基。
所述二芳香基硼酸基团指-BO(R10)2；R10优选为取代或非取代的C6～C20的芳基或取代或非取代的五元或六元杂芳基，更优选为取代或非取代的C6～C12的芳基或取代或非取代的五元或六元杂芳基，在本发明的一些具体实施例中，所述R10为苯基、甲基苯基、卤代苯基、萘基、吡啶基、哌嗪基、吡咯基、噻吩基或呋喃基等。
所述芳烷基硼酸基团指-BO(R11)2；R11优选为取代或非取代的C7～C30的芳烷基，更优选为取代或非取代的C7～C21的芳烷基，在本发明的一些具体实施例中，R11为苄基。
所述环戊硼烷基团具有式h所示结构：
Figure BDA0001778422990000021
R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的优选为取代或非取代的C1-C10烷基或C1～C10烷氧基；更优选的，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自取代或非取代的C1-C6烷基或C1～C6烷氧基；在本发明的一些具体实施例中，所述R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基等。
所述二氧环戊硼烷基团具有式i所示结构：
Figure BDA0001778422990000022
R4-1、R4-2、R4-3、R4-4的范围同上，在此不再赘述。
优选的，所述R1具有式Ⅰ-a所示结构：
Figure BDA0001778422990000023
其中，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的优选为取代或非取代的C1-C10烷基或C1～C10烷氧基；更优选的，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的优选为取代或非取代的C1-C6烷基或C1～C6烷氧基；在本发明的一些具体实施例中，所述R4为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基等。
在本发明的另外一些具体实施例中，R1为具有肿瘤乏氧敏感性的基团，具体为式Ⅰ-b、式Ⅰ-c、式I-d或式I-e所示结构：
Figure BDA0001778422990000031
其中，R4-1、R4-2、R4-3的范围同上，在此不再赘述。
本发明优选的，R1具有式Ⅰ-a或式Ⅰ-b所示结构：
Figure BDA0001778422990000032
其中，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4的范围同上，在此不再赘述。
R2为小分子抗癌药物；优选为阿霉素、多烯紫杉醇、喜树碱、放线菌素-D、六甲蜜胺、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、比卡鲁胺、争光霉素、硼替佐米、乙基酰胺、白消安、卡培他滨、卡铂、卡非佐米、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氯喹、顺铂、克拉屈滨、氯磷酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、道诺霉素、***、二氯乙酸盐、已二烯雌酚、己烯雌酚、表阿霉素、环氧甲酮四肽蛋白酶体抑制剂、***、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、氟***、氟他胺、吉西他滨、染料木素、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、伊沙匹隆、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、环己亚硝脲、氯尼达明、二氯甲基二乙胺、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、二甲双胍、甲氨蝶呤、甲基强的松龙、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、培美曲塞、喷司他丁、哌立福辛、普卡霉素、泊马度胺、卟菲尔纳、强的松、甲苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、苏拉明、三苯氧胺、替莫唑胺、西罗莫司脂化物、替尼泊苷、***、萨力多胺、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、曲妥单抗、维甲酸、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、MG-132、PSI、CEP-18770、MLN-2238、MLN-9708、NC-005、YU-101、LU-005、YU-102、NC-001、LU-001、NC-022、PR-957(LMP7)、CPSI(β5)、10LMP2-sp-ek、BODIPY-NC-001、azido-NC-002、ONX-0912、PS-519/1251-NIP-L3VS、NC-005-VS或MV151。在本发明的一些具体实施例中，所述R2为喜树碱。
R3为H、取代或非取代的C1～C6烷基。更优选的，所述R3为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基。
X1为N、O或S；更优选的，X1为O。
所述X2为
Figure BDA0001778422990000041
且氨基与R2相连；更优选的，所述X2为
Figure BDA0001778422990000042
L为单键，或选自式a～式g任一结构，且N原子与R1相连：
Figure BDA0001778422990000043
更优选的，所述L为式g所示结构。
其中，R5为H、(R8)3Si-或-C(O)R8；更优选的，R5为H、三甲基硅基或乙醛基。
R8为C1～C6烷基；更优选的，R8为甲基。
R6、R6＇独立的选自H或取代或非取代的C1-C6烷基；更优选的，R6、R6＇独立的选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基。
R7为H、卤素、-COOH、取代或非取代C1-C6烷氧基、取代或非取代C1～C6烷基R8NH-、-NO2、羟基、氨基、氰基、磺酸基、-O(CH2CH2O)qCH3，q为1或2；更优选的，R7为H或甲氧基或甲基。
在本发明的一些具体实施例中，所述L为式g所示结构：
Figure BDA0001778422990000044
其中，R6、R6＇独立的选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基。
本发明优选的，所述二聚体前药，具有式Ⅱ所示结构：
Figure BDA0001778422990000051
其中，R1为式Ⅰ-a或式Ⅰ-b所示结构：
Figure BDA0001778422990000052
R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自取代或非取代的C1-C10烷基或C1～C10烷氧基；优选的，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基；
R2为小分子抗癌药物。
在本发明的一些具体实施例中，得到具有ROS敏感性的二聚体前药BE-CPT2，其中R1为式Ⅰ-a，R2为喜树碱，R3为-CH3，X1的元素为氧，X2为-O-C＝O-O-。
在本发明的另外一些具体实施例中，得到具有乏氧敏感性的二聚体前药hQ-CPT2，其中R1为式Ⅰ-b，R2为喜树碱，R3为-CH3，X1的元素为氧，X2为-O-C＝O-O-。
在本发明的另外一些具体实施例中，所述的二聚体前药，具有式Ⅱ-a所示结构：
Figure BDA0001778422990000053
其中，R1为式Ⅰ-a或式Ⅰ-b所示结构：
Figure BDA0001778422990000061
R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自取代或非取代的C1-C10烷基或C1～C10烷氧基；更优选的，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自取代或非取代的C1-C6烷基或C1～C6烷氧基；在本发明的一些具体实施例中，所述R4为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基等。
上述式Ⅱ-a所示的前药中，当R1为式Ⅰ-a所示结构时，以下简称为BE-CPT2；当R1为式Ⅰ-b所示结构时，以下简称为hQ-CPT2。
上述前药具有肿瘤微环境响应性能，能够有效克服药物之间的疏水作用和π-π相互作用，提高纳米粒的载药量。
其中，hQ-CPT2，在乏氧、还原环境下，hQ-CPT2经过醌的环化反应、N,N’-二甲基乙二胺的自环化反应、苯酚的自消除反应，释放喜树碱。
BE-CPT2在ROS(活性氧自由基，包括单线态氧1O2、过氧化氢H2O2、超氧化物O2 -、羟基自由基-OH、次氯酸离子OCl-)的氧化作用下，可以氧化硼酸酯转化为苯酚，通过多步自消除反应释放喜树碱。
本发明提供了上述具有肿瘤微环境响应的二聚体前药的制备方法，包括以下步骤：
式Ⅱ-b所示化合物与N,N'-二甲基-乙二胺、2,6-bis((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)-4-甲酚在三光气的催化下反应，产物脱保护后与喜树碱反应，得到式Ⅲ所示结构；
或者式Ⅱ-c所示化合物与N,N'-二甲基-乙二胺、2,6-bis((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)-4-甲酚在三光气的催化下反应，产物脱保护后与喜树碱反应，得到式Ⅳ所示结构；
Figure BDA0001778422990000062
Figure BDA0001778422990000071
本发明还提供了一种光调控纳米药物，由上述二聚体前药，两亲性高分子材料和共载药物，通过自组装形成纳米粒。
所述纳米粒具有核壳机构。
其中，两亲性高分子材料作为药物载体，构成外壳。
二聚体前药和共载药物，如光敏剂，构成内核，可在光的调控下高效特异性释放药物分子，从而发挥高效治疗效果，在药物的控制释放上具有巨大的应用潜力。
本发明优选的，所述两亲性高分子材料为包含聚乙二醇、聚乳酸、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯和聚对二氧环己酮中的任意一种或多种嵌段结构的高分子材料。
更优选的，所述两亲性高分子材料为聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙交酯、聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚三亚甲基碳酸酯和聚乙二醇-聚对二氧环己酮中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施例中，所述两亲性高分子材料为聚乙二醇-聚乳酸。其为FDA批准的材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且代谢产物对人体无害。
所述共载药物优选为光敏剂。
更优选的，所述光敏剂为血卟啉、二氢卟吩e6、脱镁叶绿素a和原卟啉中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施例中，所述光敏剂为血卟啉或二氢卟吩e6。
本发明制备得到的纳米药物具有超高载药量和良好的稳定性，并且可通过时间、空间的方式调控药物释放，实现特异性的抗肿瘤治疗。
本发明中，所述纳米粒的粒径为10～500nm，粒径分布为0.01～0.30。
优选的，所述纳米粒的粒径为50～150nm，粒径分布为0.05～0.20。
本发明中，所述纳米粒中二聚体前药的包封率为20％～100％；载药量为10％～50％。
优选的，所述纳米粒中二聚体前药的包封率为65％～100％；载药量为35％～50％。
本发明中，所述纳米粒中共载药物的包封率为10％～100％；载药量为3％～20％。
优选的，所述纳米粒中光敏剂的包封率为15％～100％；载药量为3％～8％。
本发明还提供了上述光调控纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
将二聚体前药的有机溶液、共载药物的有机溶液和两亲性高分子材料的有机溶液混合，然后滴加至水中，得到光调控纳米药物。
本发明优选的，滴加至水中后，对体系进行纯化，本发明对所述纯化的方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的适用纯化方法，本发明优选采用透析的方法。
本发明提供了上述光调控纳米药物或上述制备方法制备的光调控纳米药物在制备抗癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种光调控纳米药物，以式Ⅰ所示的具有肿瘤微环境响应的二聚体前药，两亲性高分子材料和共载药物，通过自组装形成纳米粒。形成的核壳结构纳米药物具有超高载药量和良好的稳定性。在光照的条件下，能够特异性的释放药物，实现协同抗肿瘤治疗。
附图说明
图1为本发明高效液相色谱流动相比例图；
图2为实施例4中二聚体前药BE-CPT2在双氧水处理下的降解释放图；
图3为实施例5中二聚体前药hQ-CPT2在乏氧环境下的降解释放图；
图4为实施例6中BE-CPT2@Hp纳米粒在不同时间的尺寸变化图；
图5为实施例7中hQ-CPT2@Ce6纳米粒在不同时间的尺寸变化图；
图6为实施例8中BE-CPT2@Hp纳米粒在双氧水处理下的喜树碱释放数据图；
图7为实施例9中BE-CPT2@Hp纳米粒在光照条件下体外喜树碱的释放示意图；
图8为实施例10中hQ-CPT2@Ce6纳米粒在光照条件下体外喜树碱的释放示意图；
图9为实施例11、12中体内光照促进BE-CPT2@Hp、hQ-CPT2@Ce6纳米粒释放喜树碱的示意图；
图10为实施例13中BE-CPT2@Hp纳米粒在LLC、MCF-7细胞上的细胞毒性结果图；
图11实施例14中为hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1、MCF-7、LLC细胞上的细胞毒性结果图；
图12为实施例15、16中BE-CPT2@DiR、hQ-CPT2@DiR纳米粒在小鼠体内的血液循环数据图；
图13为实施例17中BE-CPT2@DiR纳米粒在C57BL/6移植瘤小鼠上的活体成像、生物分布图；
图14为实施例18中hQ-CPT2@DiR纳米粒在4T1移植瘤小鼠上的活体成像、生物分布图；
图15为实施例19中hQ-CPT2@Ce6纳米粒抑制HIF-1α表达的免疫荧光、westernblot图；
图16为实施例20中hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药后光照前后瘤内氧气含量的示意图；
图17为实施例21中BE-CPT2@Hp纳米粒在LLC移植瘤小鼠上肿瘤生长变化图；
图18为实施例21中BE-CPT2@Hp纳米粒在MCF-7原位瘤小鼠上肿瘤生长变化图、生存曲线图、H&E和TUNEL病理切片图；
图19为实施例22中hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1移植瘤小鼠上肿瘤生长变化图；
图20为实施例22中hQ-CPT2@Ce6纳米粒在MCF-7原位瘤小鼠上肿瘤生长变化图、生存曲线图、H&E和TUNEL病理切片图；
图21为实施例23中hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1转移瘤小鼠上肿瘤转移变化图；
图22为实施例24中BE-CPT2@Hp纳米粒的体内安全性图；
图23为实施例25中hQ-CPT2@Ce6纳米粒的体内安全性图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有肿瘤微环境响应的二聚体前药以及一种光调控纳米药物及应用进行详细描述。
实施例1 合成具有活性氧自由基敏感、苯硼酸修饰的喜树碱二聚体前药BE-CPT2
首先，向二氯甲烷(10mL)中加入4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯(400mg,1.7mmol)，然后缓慢加入三光气(按照15wt％溶于甲苯，6mL,8.4mmol)并在室温下搅拌36小时至完全澄清。反应结束后，旋蒸除去溶剂和未反应的三光气，迅速加入溶于二氯甲烷的叔丁基-N-甲基-N-[2-甲氨基-乙基]氨基甲酸酯(320mg,1.7mmol)。然后再加入10mL二氯甲烷和三乙胺(517μL,3.7mmol)并室温搅拌10分钟，最后加入1mL甲醇终止反应。浓缩反应液并进行过柱分离(流动相为正己烷：乙酸乙酯＝4:1至2:1)，最后得到无色油状物Boc-BE(391mg,产率为50％)。相关表征如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ7.75(d,2H,J＝8.0Hz)，7.30(d,2H,J＝8.0Hz)，5.08(s,2H)，3.27-3.33(m,4H)，2.70-2.90(m,6H)，1.38(s,9H)，1.28(s,12H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ156.0，139.7，134.9，127.1，126.9，125.9，83.7，79.5，66.9，47.1，46.7，35.4，34.4，28.3，24.8；质谱谱图HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calcdfor C23H37BN2O6Na+，471.2637；observed，471.2633。
向三氟乙酸和二氯甲烷的混合液(5/5mL)中加入Boc-BE(60mg,0.13mmol)，室温搅拌4小时脱去Boc保护基团。反应结束后，旋蒸直至完全除去溶剂。另一方面，将2,6-bis((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)苯酚(106mg,0.27mmol)、4-二甲氨基吡啶(71mg,0.59mmol)、三光气(27mg,0.09mmol)加入二氯甲烷(5mL)中，室温搅拌5分钟。然后将混合液加入脱保护后的BE-氨基中，室温搅拌40分钟。反应结束后，通过过柱分离提纯(流动相为正己烷：乙酸乙酯＝8:1-6:1-4:1)，最终得到白色固体BE-OTBS2(70mg,产率为67％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)，δ7.83(d,2H,J＝8.0Hz)，7.39(d,2H,J＝8.0Hz)，7.22(s,2H)，5.18(s,2H)，4.64(s,4H)，3.47-3.63(m,4H)，2.95-3.17(m,6H)，2.37(s,3H)，1.37(s,12H)，0.95(s,18H)，0.09(s,12H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ156.4，154.1，143.1，139.9，135.3，135.1，133.4，133.3，127.3，127.1，83.9，67.1，60.5，47.2，46.4，35.4，34.9，26.0，25.0，21.4，18.5，-5.2；质谱谱图HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calcd for C40H68BN2O8Si2 +，771.4602；observed,771.4603。
向二氯甲烷、甲醇的混合液(5/5mL)中加入BE-OTBS2(70mg,0.091mmol)和琥珀-15(～10mg)，室温搅拌过夜。反应结束后，过滤、浓缩，得到白色固体BE-OH2(40mg,产率为81％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ7.79(d,2H,J＝8.0Hz)，7.36(d,2H,J＝8.0Hz)，7.18(s,2H)，5.15(s,2H)，4.48(s,4H)，3.47-3.65(m,4H)，2.92-3.15(m,6H)，2.32(s,3H)，1.33(s,12H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ139.5，136.4，135.1，133.4，130.8，130.4，130.1，127.5，127.2，127.1，84.0，67.3，60.8，47.2，46.8，35.5，34.4，25.0，21.0；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C28H40BN2O8 +，543.2872；observed,543.2874。
向2mL二氯甲烷溶液中加入喜树碱(77mg,0.22mmol)、4-二甲氨基吡啶(54mg,0.44mmol)、三光气(22mg,0.074mmol)，室温搅拌10分钟直至喜树碱逐渐溶解。加入BE-OH2(40mg,0.074mmol)的DCM溶液(10mL)，通过TLC监测反应完全反应后，通过过柱分离提纯(流动相为二氯甲烷:甲醇＝50:1-乙酸乙酯：甲醇＝20:1)得到灰白色固体BE-CPT2(48mg,产率为50％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ8.34(s,2H)，8.18(d,J＝8.5Hz,2H)，7.90(d,J＝8.0Hz,2H)，7.82(dd,J1＝J2＝8.0Hz,2H)，7.68(d,2H,J＝7.5Hz)，7.64(dd,J1＝J2＝8.0Hz,2H)，7.28(s,2H)，7.21(d,2H,J＝7.5Hz)，7.11(s,2H)，5.51(dd,J＝148Hz,17Hz,4H)，5.23(m,4H)，4.99(m,6H)，3.30-3.58(m,4H)，2.82-3.06(m,6H)，2.21(dq,J＝51.5Hz,6.5Hz,4H)，2.15(s,3H)，1.32(s,12H)，0.97(t,J＝6.5Hz,6H)；碳谱谱图13CNMR(126MHz,CDCl3)：167.3，157.3，153.8，153.6，152.3，148.9，146.6，145.6，145.5，136.2，135.0，134.9，131.2，130.8，130.2，129.8，128.5，128.3，128.2，128.1，127.9，127.2，127.1，127.0，120.4，96.0，83.9，78.1，67.2，66.9，65.7，50.1，47.7，46.3，35.8，34.6，32.1，25.0，20.9，7.7；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C70H68BN6O18 +，1291.4678；observed,1291.4675。
上述反应的反应路线如下：
Figure BDA0001778422990000101
实施例2 合成具有乏氧敏感、醌修饰的喜树碱二聚体前药hQ-CPT2
首先，将hQ-NHS酯(1.39g,4.0mmol)、N,N-二异丙基乙胺(2mL)溶于DCM中，然后加入N,N'-二甲基-乙二胺(4.30mL,40mmol,10equiv)，室温搅拌30分钟。反应结束后，抽除溶剂，乙酸乙酯萃取，水、饱和Na2SO4溶液洗4遍(60mL×4)，收集有机相，Na2SO4干燥后，过滤、旋蒸，得到黄色固体单取代、双取代的hQ-NH混合物。下一步进行进一步的提纯。相关表征数据如下：质谱谱图ESI-MS(m/z)：[M+H]+calculated for C18H29N2O3，321.2；observed321.2。
将2,6-bis(叔丁基二甲基硅氧基)甲基)-4-甲酚(793mg,2mmol)、三光气(208mg,0.7mmol,0.35equiv)、4-二甲氨基吡啶(732mg,6mmol,3equiv)加入二氯甲烷(60mL)中，室温搅拌15分钟。然后加入hQ-NH(640mg,2mmol,1equiv)的二氯甲烷溶液(10mL)，室温搅拌1小时。反应结束后，除去溶剂，通过硅胶柱进行提纯(正己烷：乙酸乙酯＝8:1)，得到黄色固体产物hQ-BHP-OTBS(1.2g,产率为81％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ7.18(s,2H)，4.60(s,4H)，3.43(m,4H)，3.23–2.85(m,8H)，2.34(s,3H)，2.14(s,3H)，1.92(m,6H)，1.43(s,6H)，0.92(s,18H)，0.06(s,12H)；碳谱谱图13CNMR(126MHz,CDCl3)：δ191.1，187.5，172.3，154.5，153.9，153.6，143.2，138.0，136.3，135.3，133.3，128.2，60.5，53.4，47.8，45.6，37.7，36.4，35.7，28.7，25.9，21.3，14.1，12.6，12.0，-5.2，-5.3；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C40H67N2O7Si2 +，743.4482；observed,743.4474。
将hQ-BHP-OTBS(930mg)和琥珀-15(110mg)加入到二氯甲烷、甲醇的混合溶液(v/v,40/10mL)中，室温搅拌过夜。通过TLC检查反应进程，反应结束后，过滤、浓缩，经过闪蒸塔分离提纯(正己烷：乙酸乙酯＝1:2，乙酸乙酯：甲醇＝15:1)，得到黄色固体产物hQ-BHP-OH(610mg,产率为95％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ7.19(s,2H)，4.50(s,4H)，3.75–3.40(m,4H)，3.25–2.96(m,8H)，2.80(s,2H)，2.33(s,3H)，2.11(s,3H)，1.96–1.78(m,6H)，1.41(s,J＝8.0Hz,5H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ191.5，187.6，172.8，156.0，155.4，154.5，144.9，143.1，138.2，136.4，133.4，129.9，60.5，47.7，46.9，44.9，37.8，36.3，31.5，28.7，20.9，14.2，12.6，11.9；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C28H39N2O7 +，515.2747；observed，515.2755。
将喜树碱(83.6mg,0.24mmol,2.4equiv)、4-二甲氨基吡啶(65mg,0.53mmol,5.3equiv)、三光气(24.9mg,0.084mmol,0.84equiv)加入到二氯甲烷(10mL)中，室温搅拌15分钟。然后加入hQ-BHP-OH(51.5mg,0.1mmol)的二氯甲烷溶液(3mL)。通过TLC检测反应进程，反应结束后，浓缩溶液，经过硅胶柱分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝15:1，乙酸乙酯：甲醇＝25:1)，得到黄色固体产物hQ-CPT2(80mg,产率为64％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ8.38(s,2H)，8.18(d,J＝8.3Hz,2H)，7.93(d,J＝7.9Hz,2H)，7.83(dd,J＝8.3,7.9Hz,2H)，7.66(dd,J＝8.3,7.9Hz,2H)，7.29(s,2H)，7.16(s,2H)，5.52(dd,J＝146.0,17.2Hz,2H)，5.26(s,4H)，5.23–4.87(m,4H)，3.69–3.27(m,4H)，3.20–2.74(m,8H)，2.32–2.08(m,10H)，2.08–1.97(s,2H)，1.96–1.75(s,6H)，1.41–1.27(s,6H)，0.98(t,J＝7.5Hz,6H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ190.8，187.4，172.3，167.2，157.0，154.7，153.5，152.0，148.5，146.3，145.4，145.3，144.9，143.2，137.5，136.0，131.1，130.6，130.5，130.1，129.4，128.2，128.2，128.0，127.7，127.6，120.0，95.8，77.9，66.9，60.2，49.8，47.3，47.1，45.8，37.5，36.3，31.7，28.3，20.9，14.1，13.9，12.5，11.9，7.5；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C70H67N6O17 +，1263.4552；observed，1263.4551。
上述反应的反应路线如下：
Figure BDA0001778422990000121
实施例3 合成无敏感的喜树碱二聚体前药Boc-CPT2
将2,6-bis((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)苯酚(110mg,0.28mmol)、4-二甲氨基吡啶(85mg,0.69mmol)、三光气(27mg,0.092mmol)加入二氯甲烷(8mL)中，室温搅拌15分钟。然后向混合液中加入叔丁基-N-甲基-N-[2-甲氨基-乙基]氨基甲酸酯(44mg,0.23mmol)并室温搅拌1小时。混合液经过过柱分离提纯(流动相为正己烷：乙酸乙酯＝10:1-8:1)，得到无色油状物Boc-OTBS2(85mg,产率为60％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ7.19(s,2H)，4.61(s,4H)，3.31-3.68(m,4H)，2.86-3.22(m,6H)，2.34(s,3H)，1.46(s,9H)，0.92(s,18H)，0.07(s,12H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ154.0，153.8，142.9，135.3，133.4，133.3，127.1，60.5，60.3，47.6，47.4，35.5，35.3，28.5，26.0，21.4，18.5，-5.1；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C31H59N2O6Si2 +，611.3906；observed，611.3915。
向甲醇溶液(10mL)中加入Boc-OTBS2(387mg,0.63mmol)、琥珀-15(～10mg)，室温搅拌过夜。反应结束后，过滤、浓缩，经过过柱分离提纯(乙酸乙酯-乙酸乙酯：甲醇＝10:1)，得到无色油状物Boc-OH2(161mg,产率为67％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ7.14(s,2H)，4.46(s,4H)，2.78-3.65(m,14H)，2.28(s,3H)，1.40(s,9H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ155.8，155.6，136.1，133.4，130.4，130.0，80.3，60.3，50.4，47.0，35.6，35.0，28.5，20.9；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+Na]+calcdforC19H30N2NaO6 +，405.1996；observed，405.1995。
向2mL二氯甲烷溶液中加入喜树碱(67mg,0.19mmol)、4-二甲氨基吡啶(49mg,0.4mmol)、三光气(19mg,0.064mmol)，室温搅拌5分钟直至喜树碱逐渐溶解。加入Boc-OH2(31mg,0.081mmol)的二氯甲烷溶液(1mL)，通过TLC监测反应完全反应后，通过过柱分离提纯(流动相为二氯甲烷:甲醇＝50:1-乙酸乙酯：甲醇＝20:1)得到浅黄色固体Boc-CPT2(74mg,产率为81％)。相关表征数据如下：氢谱图谱1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ8.34(s,2H)，8.16(d,J＝8.5Hz,2H)，7.89(d,J＝8.5Hz,2H)，7.81(dd,J1＝J2＝8.5Hz,2H)，7.63(dd,J1＝J2＝8.5Hz,2H)，7.27(s,2H)，7.10(s,2H)，5.50(dd,J＝144Hz,17Hz,4H)，5.22(m,4H)，5.06(m,2H)，4.96(m,2H)，3.24-3.65(m,4H)，2.73-3.15(m,6H)，2.06-2.33(m,7H)，1.36(s,9H)，0.96(t,J＝7.5Hz,6H)；碳谱谱图13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ167.2，157.2，155.4，153.6，152.2，148.8，146.49，145.6，145.5，136.1，131.2，130.7，130.5，130.0，129.6，128.4，128.2，128.1，128.1，127.7，120.3，95.9，78.0，67.1，65.8，60.4，50.0，47.4，46.5，35.4，32.0，28.4，20.8，14.2，7.7；质谱谱图HRMS-ESI(m/z)：[M+H]+calcd for C61H59N6O16 +，1131.3982；observed，1131.3975。
上述反应的反应路线如下：
Figure BDA0001778422990000131
实施例4 BE-CPT2的释放机制
将BE-CPT2溶于乙腈、PBS的混合液中(1:1,v/v)，浓度为20μg/mL。然后向混合液中加入H2O2(终浓度为100μM)。在预设的时间点时，取出100μL释放液，加入400μL0.1％TFA-H2O溶液稀释，然后通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。没有H2O2处理的BE-CPT2溶液作为对照组，释放中间产物的质谱谱图数据如下：A([M+H]+calcdfor C64H57N6O17 +：1181.4；observed:1181.4)，B([M+H]+calcd for C56H51N6O14 +：1031.3；observed:1131.4)。
图2为BE-CPT2在双氧水处理下的降解释放图。
结果表明：双氧水可氧化硼酸酯变为苯酚，通过多步的自消除反应释放喜树碱。在24小时内喜树碱的释放量可高达81％。
释放机理如下式a所示：
Figure BDA0001778422990000141
实施例5 hQ-CPT2的释放机制
将hQ-CPT2溶于DMF、PBS的混合液中(1:1,v/v)，浓度为50μg/mL。然后向溶液中鼓5分钟氮气除去氧气。随后加入连二亚硫酸钠至终浓度为10mM。在预设的时间点，取出100μL释放液，加入400μL 0.1％TFA-H2O溶液稀释，通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。
图3为hQ-CPT2在乏氧环境下的降解释放图。结果表明：在乏氧、还原环境下，hQ-CPT2经过醌的环化反应、N,N’-二甲基乙二胺的自环化反应、苯酚的自消除反应释放喜树碱。在33小时内喜树碱的释放量可高达95％。
释放机制如下式b所示：
Figure BDA0001778422990000142
实施例6 BE-CPT2、光敏剂血卟啉共载纳米粒的制备
聚乙二醇-聚乳酸PEG-PLA、BE-CPT2分别溶于THF且终浓度为10mg/mL，血卟啉(haematoporphyrin,Hp)溶于DMF且终浓度为5mg/mL。将BE-CPT2(16μL)、Hp(5μL)加入PEG-PLA(16μL)溶液中，混合、震荡10秒后，逐滴加入去离子水(740μL)中，室温搅拌30分钟，透析6小时(截留分子量为3500)后，得到BE-CPT2、Hp共载纳米粒(BE-CPT2@Hp)。Boc-CPT2、Hp共载纳米粒(Boc-CPT2@Hp)、BE-CPT2单载纳米粒(BE-CPT2)均按照上述方法制备。为了评估BE-CPT2@Hp纳米粒的稳定性，新鲜制备的BE-CPT2@Hp纳米粒放置室温不同时间，并通过DLS检测粒径。为了进一步测定载药量，新鲜制备的纳米粒被大量乙腈稀释破坏后，通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)，载药量和包封率的计算公式如下：
Figure BDA0001778422990000143
Figure BDA0001778422990000151
图4为BE-CPT2@Hp纳米粒在不同时间的尺寸变化图。结果表明：在室温放置14天内，BE-CPT2@Hp纳米粒的粒径维持在90nm左右，并且没有沉淀物析出，说明BE-CPT2@Hp纳米粒具有很好的稳定性。此外，通过高效液相色谱检测、计算得出，BE-CPT2@Hp纳米粒中BE-CPT2的载药量为44.5％，Hp的载药量为6.3％。
实施例7 hQ-CPT2、光敏剂二氢卟吩e6共载纳米粒的制备
PEG-PLA、hQ-CPT2分别溶于四氢呋喃且终浓度为10mg/mL，光敏剂二氢卟吩e6(chlorin e6,Ce6)溶于N,N-二甲基甲酰胺且终浓度为5mg/mL。将hQ-CPT2(16μL)、Ce6(10μL)加入到PEG-PLA(16μL)溶液中，混合、震荡10秒后，逐滴加入去离子水(840μL)中，室温搅拌30分钟，透析6小时(截留分子量为3500)后，得到hQ-CPT2、Ce6共载纳米粒(hQ-CPT2@Ce6)。Boc-CPT2、Ce6共载纳米粒(Boc-CPT2@Ce6)、hQ-CPT2单载纳米粒(hQ-CPT2)均按照上述方法制备。为了评估hQ-CPT2@Ce6纳米粒的稳定性，新鲜制备的hQ-CPT2@Ce6纳米粒放置室温不同时间，并通过DLS检测粒径。为了进一步测定载药量，新鲜制备的纳米粒被大量乙腈稀释破坏后，通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。载药量和包封率的计算公式如下：
Figure BDA0001778422990000152
Figure BDA0001778422990000153
图5为hQ-CPT2@Ce6纳米粒在不同时间的尺寸变化图。结果表明：在室温放置14天内，hQ-CPT2@Ce6纳米粒的粒径维持在90nm左右，并且没有沉淀物析出，说明hQ-CPT2@Ce6纳米粒具有很好的稳定性。此外，通过高效液相色谱检测、计算得出，hQ-CPT2@Ce6纳米粒中BE-CPT2的载药量为46.8％，Ce6的载药量为6.5％。
实施例8 双氧水刺激的体外药物释放
为了评估喜树碱从BE-CPT2@Hp纳米粒的释放情况，新鲜制备的BE-CPT2@Hp纳米粒用PBS(5mM,pH 7.4)缓冲液稀释，加入双氧水(终浓度为100μM)。将释放介质放在37℃、200rpm的摇床内，在预设的时间点取出100μL释放液，并用100μL 0.1％TFA-H2O稀释，最后通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。没有H2O2处理的作为对照组。
图6为BE-CPT2@Hp纳米粒在双氧水处理下的喜树碱释放数据图。结果表明：在双氧水的处理下喜树碱的释放急剧增加，48小时内的累计释放量有52％。这些结果说明双氧水可以有效的促进BE-CPT2自消除释放喜树碱。
实施例9 体外光照促进BE-CPT2@Hp纳米粒释放喜树碱
通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察LLC细胞光照前后细胞内活性氧自由基(ROS)的产生和喜树碱的释放。将悬浮于500μL DMEM(含10％FBS)培养基的LLC细胞按照1.5×104细胞/孔种在24孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。按照20μg二聚体前药/mL加入Boc-CPT2@Hp纳米粒和BE-CPT2@Hp纳米粒。共孵育4小时后，移除培养基，PBS洗三次，加入DCFH-DA溶液(终浓度为10μM)，光照(635nm,2mW/cm2)30分钟后，4％多聚甲醛固定10分钟，DAPI(5μg/mL)染色10分钟，最后通过CLSM观察。为了进一步评估光动力治疗过程产生的ROS是否可以促进喜树碱的释放，LLC细胞预先经过ROS消耗剂维他命C(VC，终浓度为200μM)处理12小时，然后按照上述方法加入BE-CPT2@Hp纳米粒进行观察。
为了定量检测光照后喜树碱的释放量，将悬浮于2mL DMEM(含10％FBS)培养基的LLC细胞按照2×105细胞/孔种在6孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。按照30μg二聚体前药/mL加入BE-CPT2@Hp纳米粒，共孵育24小时后光照(635nm,2mW/cm2)30分钟，并继续孵育2、4、8小时。在不同时间点时分别收集培养基和细胞，其中向细胞加入RIPA裂解液并室温裂解20分钟，冰上进一步超声破坏。然后用混合液(甲醇/二氯甲烷＝1/1，v/v,回收率为94％)萃取细胞和培养基中的喜树碱和BE-CPT2，并-20℃放置过夜。4℃、10000rpm离心30分钟，上清液通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。
图7为光照促进BE-CPT2@Hp纳米粒释放喜树碱的示意图。在光照的条件(635nm,2mW/cm2)下，细胞质中分布着大量喜树碱的蓝色荧光，表明有大量喜树碱从BE-CPT2@Hp纳米粒中释放。此外ROS消耗剂维他命C(VC)预处理细胞后与BE-CPT2@Hp纳米粒共孵育、光照，细胞内几乎没有ROS、喜树碱产生，说明光动力治疗可以加速细胞内的喜树碱释放。定量的高效液相色谱检测数据也表明光照2小时后，光照组中喜树碱(60μg/mg protein)的释放量是无光照组(27μg/mg protein)的2.2倍，表明光动力产生的ROS可以加速纳米粒中喜树碱的释放。
实施例10 体外光照促进hQ-CPT2@Ce6NPs释放喜树碱
通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察4T1细胞光照前后细胞内ROS的产生和喜树碱的释放。将悬浮于500μL 1640(含10％FBS)培养基的4T1细胞按照1.5×104细胞/孔种在24孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。加入CoCl2(终浓度为100μM)预处理细胞12小时，然后按照20μg二聚体前药/mL加入hQ-CPT2纳米粒。共孵育4小时后，移除培养基，PBS洗三次，加入DCFH-DA溶液(终浓度为10μM)，4％多聚甲醛固定10分钟，DAPI(5μg/mL)染色10分钟后通过CLSM观察。为了进一步观察光照后的药物释放，按照20μg二聚体前药/mL向细胞加入Boc-CPT2@Ce6纳米粒、hQ-CPT2@Ce6纳米粒，共孵育4小时后，光照(660nm,2mW/cm2)30分钟然后按照上述方法进行DCFH-DA染色。
为了定量检测光照后喜树碱的释放量，将悬浮于2mL 1640(含10％FBS)培养基的4T1细胞按照2×105细胞/孔种在6孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。按照30μg二聚体前药/mL加入hQ-CPT2@Ce6纳米粒，共孵育24小时后，换成新鲜的1640培养基(含有10％FBS)，光照(660nm,2mW/cm2)30分钟，并且继续孵育2、4、8小时。在不同时间点时分别收集培养基和细胞，其中向细胞加入RIPA裂解液并室温裂解20分钟，冰上进一步超声破坏。然后用混合液(甲醇/二氯甲烷＝1/1，v/v,回收率为94％)萃取细胞和培养基中的喜树碱和hQ-CPT2，并-20℃放置过夜。4℃、10000rpm离心30分钟，上清液通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。
图8为光照促进hQ-CPT2@Ce6纳米粒释放喜树碱的示意图。乏氧诱导剂CoCl2预处理细胞12小时后，大量的喜树碱从hQ-CPT2纳米粒中释放出来，表明乏氧环境可以促使hQ-CPT2纳米粒释放喜树碱。此外，hQ-CPT2@Ce6纳米粒与4T1细胞共孵育、光照后，细胞质中分布着大量释放的喜树碱，表明光动力引起的乏氧环境可以促进hQ-CPT2@Ce6纳米粒释放喜树碱。定量的高效液相色谱数据也表明光照8小时后，光照组中细胞裂解液、培养基中喜树碱的含量是无光照组2倍，表明光动力引起的细胞内乏氧可以促进纳米粒中喜树碱的释放。
实施例11 体内光照促进BE-CPT2@HpNPs释放喜树碱
C57BL/6小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106LLC细胞。当肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠分为2组(n＝3)：第一组瘤内注射BE-CPT2@Hp纳米粒(3.6mg喜树碱/kg)；第二组瘤内注射BE-CPT2@Hp纳米粒(3.6mg喜树碱/kg)，给药1小时后光照(635nm,10mW/cm2)30分钟。光照2、4、8小时后，收集肿瘤，PBS洗干净，加入裂解液后在冰上匀浆。通过混合液(甲醇/二氯甲烷＝1/1，v/v)萃取出裂解液中的喜树碱和BE-CPT2。4℃、10000rpm离心30分钟，上清液通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。
图9为体内光照促进BE-CPT2@Hp纳米粒释放喜树碱的示意图。当LLC移植瘤小鼠进行BE-CPT2@Hp纳米粒给药、光照后，光照组喜树碱的肿瘤富集量是13.6％ID/g，是无光照组的2.1倍，表明光动力可以产生大量ROS并且有效促进纳米粒中喜树碱的释放。
实施例12 体内光照促进hQ-CPT2@Ce6NPs释放喜树碱
BALB/c小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106 4T1细胞。当肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠分为2组(n＝4)：第一组瘤内注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒(3.6mg喜树碱/kg)；第二组瘤内注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒(3.6mg喜树碱/kg)，给药1小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟。光照2、4、8小时后，收集肿瘤，PBS洗干净，加入裂解液后在冰上匀浆。通过混合液(甲醇/二氯甲烷＝1/1，v/v)萃取出裂解液中的喜树碱和hQ-CPT2。4℃、10000rpm离心30分钟，上清液通过高效液相色谱进行检测、定量分析(λabs＝370nm，流动相按图1所示)。
图9为体内光照促进hQ-CPT2@Ce6纳米粒释放喜树碱的示意图。4T1移植瘤小鼠瘤内注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒、光照后，在光照4小时后光照组肿瘤裂解液中喜树碱的含量是无光照组的3倍。而且在光照8小时后仍是无光照组的2.5倍，说明光动力引起的局部乏氧环境可以持续性的促使喜树碱释放。
实施例13 体外BE-CPT2@Hp纳米粒抗肿瘤疗效
为了研究不同纳米粒的体外抗肿瘤疗效，将悬浮于100μL DMEM(含10％FBS)培养基的LLC细胞按照1×104细胞/孔种在96孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。按照不同二聚体前药浓度加入BE-CPT2纳米粒、Boc-CPT2@Hp纳米粒和BE-CPT2@Hp纳米粒。共孵育24小时后，细胞光照(635nm,2mW/cm2)30分钟，继续培养24小时后通过MTT法检测细胞存活率。为了验证BE-CPT2@Hp纳米粒抗肿瘤效果的普适性，用相同的方法在MCF-7细胞上也进行了体外抗肿瘤效果的评估。为了评估在光动力产生的ROS环境下的BE-CPT2@Hp纳米粒抗肿瘤效果，将悬浮于100μL DMEM(含10％FBS)培养基的LLC细胞按照1×104细胞/孔种在96孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。然后加入ROS消耗剂维他命C(VC，终浓度为200μM)处理12小时，继续加入BE-CPT2@Hp纳米粒共孵育24小时，然后光照(635nm,2mW/cm2)30分钟，继续培养24小时后通过MTT法检测细胞存活率。喜树碱和血卟啉的半数抑制浓度IC50可计算得到。为了进一步评估喜树碱和血卟啉之间的是否具有协同作用，通过Chou andTalalay’s方法计算CI值，判断二者之间的关系。相应的公式如下：
Figure BDA0001778422990000171
其中D1、D2表示共载体系(BE-CPT2@Hp纳米粒)中药物1(喜树碱)药物2(血卟啉)的半数抑制浓度，Dm1、Dm2分别表示药物1(BE-CPT2纳米粒中的喜树碱)药物2(Boc-CPT2@Hp纳米粒中的血卟啉)的半数抑制浓度。CI值低于、等于、高于1分别代表协同、叠加、拮抗作用。
图10为BE-CPT2@Hp纳米粒在LLC、MCF-7细胞上的细胞毒性结果图。数据表明：BE-CPT2@Hp纳米粒在LLC、MCF-7细胞中展示出了更显著的抗肿瘤效果，并且喜树碱与血卟啉之间的复合指数(CI)在LLC、MCF-7细胞中均小于1，表明二者之间有协同效应。ROS消耗剂VC处理后，BE-CPT2@Hp纳米粒中喜树碱的IC50相比于无VC处理组的显著增加，表明光动力产生的ROS可以显著提高BE-CPT2@Hp纳米粒的抗肿瘤疗效。
实施例14 体外hQ-CPT2@Ce6纳米粒抗肿瘤疗效
为了研究不同纳米粒的体外抗肿瘤疗效，将悬浮于100μL 1640(含10％FBS)培养基的4T1细胞按照1×104细胞/孔种在96孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。按照不同二聚体前药浓度加入hQ-CPT2纳米粒、Boc-CPT2@Ce6纳米粒和hQ-CPT2@Ce6纳米粒。共孵育24小时后，细胞光照(660nm,2mW/cm2)30分钟，继续培养48小时后通过MTT法检测细胞存活率。为了验证hQ-CPT2@Ce6纳米粒抗肿瘤效果的普适性，用相同的方法在MCF-7、LLC细胞上也进行了体外抗肿瘤效果的评估。
为了探索乏氧促进的抗肿瘤疗效，将悬浮于100μL 1640(含10％FBS)培养基的4T1细胞按照1×104细胞/孔种在96孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。然后加入乏氧化学诱导剂CoCl2(终浓度为100μM)处理12小时后，继续加入hQ-CPT2纳米粒共孵育72小时，最后通过MTT检测细胞存活率。
为了评估在光动力产生的乏氧环境下的hQ-CPT2@Ce6纳米粒抗肿瘤效果，将悬浮于100μL 1640(含10％FBS)培养基的4T1细胞按照1×104细胞/孔种在96孔板内，在37℃、5％CO2培养箱内培养24小时。然后加入ROS消耗剂维他命C(VC，终浓度为200μM)处理12小时后，继续加入hQ-CPT2@Ce6纳米粒共孵育24小时，光照(660nm,2mW/cm2)30分钟，继续培养48小时后通过MTT法检测细胞存活率。喜树碱和二氢卟吩e6的半数抑制浓度IC50可计算得到。为了进一步评估喜树碱和二氢卟吩e6之间的是否具有协同作用，通过Chou and Talalay’s方法计算CI值，判断二者之间的关系。相应的公式如下：
Figure BDA0001778422990000181
其中D1、D2表示共载体系(hQ-CPT2@Ce6纳米粒)中药物1(喜树碱)药物2(二氢卟吩e6)的IC50，Dm1、Dm2分别表示药物1(hQ-CPT2纳米粒中喜树碱)和药物2(Boc-CPT2@Ce6纳米粒中二氢卟吩e6)的IC50。CI值低于、等于、高于1分别代表协同、叠加、拮抗作用。
图11为hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1、MCF-7、LLC细胞上的细胞毒性结果图。数据表明：hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1、MCF-7、LLC细胞中展示出了更显著的抗肿瘤效果，并且喜树碱与二氢卟吩e6之间的复合指数(CI)在4T1、MCF-7、LLC细胞中均小于1，表明二者之间有协同效应。在CoCl2诱导的乏氧环境下，hQ-CPT2纳米粒中喜树碱的IC50显著降低，表明乏氧环境可提高hQ-CPT2纳米粒的抗肿瘤疗效。ROS消耗剂VC处理后，hQ-CPT2@Ce6纳米粒中喜树碱的IC50相比于无VC处理组的显著增加，表明光动力产生的乏氧环境可以显著提高hQ-CPT2@Ce6纳米粒的抗肿瘤疗效。
实施例15 BE-CPT2@DiR纳米粒的药代动力学
为了评估纳米粒的药代动力学参数，C57BL/6小鼠被分为2组(n＝3)，第一组尾静脉注射BE-CPT2@DiR纳米粒(1.25mgDiR/kg)；第二组尾静脉注射DiR(1.25mgDiR/kg)。在给药后的不同时间点，通过眼眶取血20μL，然后加入1％Triton X-100(100μL)并超声使其完全溶解。加入HCl-IPA混合液，涡旋混合，放置-20℃静置过夜。12000rpm离心30分钟后，上清液中DiR的含量可通过荧光光谱仪测定(λex＝748nm,λem＝780nm)。
图12为BE-CPT2@DiR纳米粒在小鼠体内的血液循环数据图。结果表明：BE-CPT2@DiR纳米粒具有良好的稳定性，可以在体内实现长时间循环。
实施例16 hQ-CPT2@DiR纳米粒的药代动力学
为了评估hQ-CPT2@DiR纳米粒的药代动力学参数，BALB/c小鼠被分为2组(n＝4)，第一组尾静脉注射hQ-CPT2@DiR纳米粒(1.25mgDiR/kg)；第二组尾静脉注射DiR(1.25mgDiR/kg)。在给药后的不同时间点，通过眼眶取血20μL，然后加入1％Triton X-100(100μL)并超声使其完全溶解。加入HCl-IPA混合液，涡旋混合，放置-20℃静置过夜。12000rpm离心30分钟后，上清液中DiR的含量可通过荧光光谱仪测定(λex＝748nm,λem＝780nm)。
图12为hQ-CPT2@DiR纳米粒在小鼠体内的血液循环数据图。结果表明：hQ-CPT2@DiR纳米粒具有良好的稳定性，可以在体内实现长时间循环。
实施例17 BE-CPT2@DiR纳米粒的组织分布
为了评估纳米粒的体内组织分布情况，C57BL/6小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106LLC细胞。当肿瘤体积达到150mm3时，将小鼠分为2组(n＝3)，按照1.25mg DiR/kg分别尾静脉注射DiR和BE-CPT2@DiR纳米粒。在注射后不同时间点使用小动物活体成像***(
Figure BDA0001778422990000191
LuminaⅢ,PerkinElmer,USA)进行荧光成像，观察纳米粒在体内的分布情况。与此同时，在给药6小时后将小鼠处死，收集心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等主要组织，PBS洗净后进行荧光成像。为了进一步定量检测DiR在各个组织内的含量，收集给药6小时后的主要组织，PBS洗净，称重，加入1％Triton X-100溶液匀浆。加入HCl-IPA混合液，涡旋混合，放置-20℃静置过夜。12000rpm离心30分钟后，上清液中DiR的含量可通过荧光光谱仪测定(λex＝748nm,λem＝780nm)。
图13为BE-CPT2@DiR纳米粒在C57BL/6移植瘤小鼠上的活体成像、生物分布图。结果表明：相比于游离的DiR，BE-CPT2@DiR纳米粒给药组的LLC移植瘤小鼠在给药后的6小时，肿瘤部位显示出更强的荧光；甚至在给药后的12小时，BE-CPT2@DiR纳米粒中DiR的荧光依然可以在肿瘤部位显示，而游离DiR在肿瘤部位的荧光几乎完全消失，这进一步说明BE-CPT2@DiR纳米粒具有很好的肿瘤富集能力。此外，定量的荧光光谱仪检测数据表明，肿瘤组织内BE-CPT2@DiR纳米粒中的DiR富集量是7.5％ID/g，是游离DiR富集量的4倍。这些结果都表明了BE-CPT2@DiR纳米粒具有显著的肿瘤富集能力。
实施例18 hQ-CPT2@DiR纳米粒的组织分布
为了评估纳米粒的体内组织分布情况，BALB/c小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106 4T1细胞。当肿瘤体积达到150mm3时，将小鼠分为2组(n＝4)，按照1.25mg DiR/kg分别尾静脉注射DiR和hQ-CPT2@DiR纳米粒。在注射后不同时间点使用小动物活体成像***(
Figure BDA0001778422990000192
LuminaⅢ,PerkinElmer,USA)进行荧光成像，观察纳米粒在体内的分布情况。与此同时，在给药6小时后将小鼠处死，收集心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等主要组织，PBS洗净后进行荧光成像。为了进一步定量检测DiR在各个组织内的含量，收集给药6小时后的主要组织，PBS洗净，称重，加入1％Triton X-100溶液匀浆。加入HCl-IPA混合液，涡旋混合，放置-20℃静置过夜。12000rpm离心30分钟后，上清液中DiR的含量可通过荧光光谱仪测定(λex＝748nm,λem＝780nm)。
图14为hQ-CPT2@DiR纳米粒在4T1移植瘤小鼠上的活体成像、生物分布图。结果表明：相比于游离的DiR，hQ-CPT2@DiR纳米粒给药组的4T1移植瘤小鼠在给药后的6小时，肿瘤部位显示出更强的荧光；甚至在给药后的12小时，hQ-CPT2@DiR纳米粒中DiR的荧光依然可以在肿瘤部位显示，而游离DiR在肿瘤部位的荧光几乎完全消失，说明hQ-CPT2@DiR纳米粒具有很好的肿瘤富集能力。此外，定量的荧光光谱仪检测数据也表明，肿瘤组织内hQ-CPT2@DiR纳米粒中的DiR富集量是5.7％ID/g，是游离DiR富集量的5.2倍。这些结果都表明了hQ-CPT2@DiR纳米粒具有显著的肿瘤富集能力。
实施例19 体内hQ-CPT2@Ce6纳米粒的分子机制
BALB/c小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106 4T1细胞。当肿瘤体积达到70mm3时，将小鼠分为4组(n＝4)：每组分别瘤内注射PBS或纳米粒(3.6mg喜树碱/kg,0.8mg二氢卟吩e6/kg)。第一组瘤内注射PBS；第二组瘤内注射hQ-CPT2纳米粒；第三组瘤内注射Boc-CPT2@Ce6纳米粒，并在给药1小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟；第四组瘤内注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒，并在给药1小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟。光照3小时后，腹腔注射哌莫硝唑(60mg/kg,HypoxyprobeTM RedAPC Kit,Hypoxyprobe Inc)。1小时后收集肿瘤，PBS洗干净后，OCT包埋、冷冻切片。切片干燥后，在4℃丙酮中固定，最后通过CLSM进行观察。此外，在光照4小时后收集肿瘤，PBS洗干净后，OCT包埋、冷冻切片。切片干燥后，在4℃丙酮中固定、BSA封闭，HIF-1α用抗HIF-1α小鼠单抗(1:200稀释，Abcam)、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG抗体(1:500稀释，Beyotime)进行染色；血管用抗CD31小鼠单抗(1:200稀释，Abcam)、Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG抗体(1:500稀释，Beyotime)进行染色。
HIF-1α的表达也可通过western blot进行检测分析。4T1移植瘤小鼠按照免疫荧光染色实验进行给药。光照4小时后收集肿瘤，PBS洗干净，在含有蛋白酶抑制剂的裂解液中进行冰上匀浆。4℃、10000rpm离心30分钟后，上清液用BSA Kit进行蛋白质浓度检测。向10％十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶的每孔中加入100μg蛋白质样品，电泳分离蛋白质后，将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜上。5％BSA封闭后，将PVDF膜浸泡至抗HIF-1α小鼠单抗溶液中(1:1000稀释，Abcam)4℃孵育过夜，TBST洗涤，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体(1:1000稀释，Beyotime)溶液孵育1小时。最后通过增强化学发光(Amersham Pharmacia Biotech)进行蛋白质的显色、检测。β-肌动蛋白作为内参蛋白。
图15为hQ-CPT2@Ce6纳米粒抑制HIF-1α表达的免疫荧光、western blot图。结果表明：Boc-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠在光照后肿瘤中HIF-1α的表达量是PBS给药组的2倍，表明光动力引起的乏氧环境显著的上调了HIF-1α的表达。western blot实验也表明，Boc-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠在光照后肿瘤中HIF-1α蛋白质条带明显加粗，说明其HIF-1α的表达量显著高于PBS给药组中HIF-1α的表达量。相反，hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠在光照后，肿瘤中HIF-1α的荧光强度低于Boc-CPT2@Ce6纳米粒给药组6倍，而且HIF-1α的表达量也明显降低，说明光动力促进释放的喜树碱可以有效的抑制HIF-1α的表达。以上数据表明光动力促进释放的喜树碱可以有效缓解乏氧环境、抑制HIF-1α表达。
实施例20 体内hQ-CPT2@Ce6纳米粒的光声成像
为了检测光照前后瘤内氧气含量的变化，BALB/c小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106 4T1细胞。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠分为3组(n＝4)。每组分别瘤内注射不同载药的纳米粒(3.6mg喜树碱/kg)。第一组瘤内注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒；第二组瘤内注射Boc-CPT2@Ce6纳米粒，第三组瘤内注射hQ-CPT2纳米粒。其中第一、二组在给药1小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟；光照不同时间后，通过PA成像***(FujiFilmVisualSonics Inc.)中的Oxy-hem模式(750nm、850nm)检测瘤内的氧气含量。
图16为hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药后光照前后瘤内氧气含量的示意图。结果表明：Boc-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠在光照4小时后肿瘤内的氧气含量从14.8％下降至2.3％，表明光动力可以引起肿瘤内的乏氧环境。免疫荧光染色数据进一步显示，光照后图像中布满了大量的绿色荧光，说明光动力在光照4小时后引起了严重的乏氧环境。半定量的荧光统计数据表明，Boc-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠肿瘤内乏氧程度是PBS给药组的3倍。此外，hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠肿瘤内乏氧程度是PBS给药组的1.8倍，而PBS给药组小鼠肿瘤内乏氧程度是hQ-CPT2纳米粒给药组的5倍。以上数据表明光动力在治疗过程中消耗了大量的氧气。
实施例21 体内BE-CPT2@Hp纳米粒抗肿瘤疗效
C57BL/6小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106LLC细胞。当肿瘤体积达到50mm3时，将小鼠分为5组(n＝8)，分别在第1、4、7天按照10mg喜树碱/kg、1.4mg血卟啉/kg尾静脉给药。第1组注射生理盐水；第2组注射伊立替康；第3组注射BE-CPT2纳米粒；第4组注射Boc-CPT2@Hp纳米粒，并在给药6小时后光照(635nm,10mW/cm2)30分钟；第5组注射BE-CPT2@Hp纳米粒，并按照第4组的方法进行光照；每隔2天对小鼠的肿瘤体积、体重、存活率进行测定记录。肿瘤体积的计算公式为长×宽2×0.5。相对肿瘤体积表示为V/V0(V0代表最初没有给药时的体积)。当小鼠死亡或肿瘤体积达到1000mm3时，即认为小鼠死亡。
建立原位乳腺癌模型进一步评估BE-CPT2@Hp纳米粒抗肿瘤疗效的普适性。裸鼠异氟烷麻醉后，在小鼠乳腺垫上移植1×107MCF-7细胞。当肿瘤体积达到50mm3时，将小鼠分为5组(n＝8)，分别在第1、5、9天按照10mg喜树碱/kg、1.4mg血卟啉/kg尾静脉给药。第1组注射生理盐水；第2组注射伊立替康；第3组注射BE-CPT2纳米粒；第4组注射Boc-CPT2@Hp纳米粒，并在给药6小时后光照(635nm,10mW/cm2)30分钟；第5组注射BE-CPT2@Hp纳米粒，并按照第4组的方法进行光照；每隔2天对小鼠的肿瘤体积、体重、存活率进行测定记录。肿瘤体积的计算公式为长×宽2×0.5。相对肿瘤体积表示为V/V0(V0代表最初没有给药时的体积)。当小鼠死亡或肿瘤体积达到1000mm3时，即认为小鼠死亡。
图17为BE-CPT2@Hp纳米粒在LLC移植瘤小鼠上肿瘤生长变化图。单一的BE-CPT2纳米粒化疗和单一的Boc-CPT2@Hp纳米粒光动力治疗只表现出部分的肿瘤抑制效果，而BE-CPT2@Hp纳米粒几乎完全抑制了肿瘤的生长。
MCF-7原位瘤小鼠进行和体内抗肿瘤实验相同的治疗后，第14天处死小鼠，收集肿瘤和其他组织，浸泡于4％***进行固定，石蜡包埋、切片(10μm)，经过苏木素和伊红(H&E)染色后，显微镜观察。为了进一步观察肿瘤细胞的凋亡情况，肿瘤用OCT包埋，放置-20℃冻至发白后切片(10μm)，DAPI(5μg/mL)室温染色8分钟，最后通过One Step TUNELApoptosis Assay
Figure BDA0001778422990000211
(Beyotime Biotechnology,China)进行检测。所有的细胞都会被染成蓝色，凋亡细胞会染成绿色，凋亡率定义为凋亡细胞占全部细胞的百分比。
图18为BE-CPT2@Hp纳米粒在MCF-7原位瘤小鼠上肿瘤生长变化图。在给药、光照后，BE-CPT2@Hp纳米粒显著的抑制了肿瘤的生长和最高细胞凋亡率，表明光调节的光动力治疗与光动力激活的化疗之间有很好的协同抗肿瘤疗效。此外，小鼠的生存率也得到了显著的提升。
实施例22 体内hQ-CPT2@Ce6纳米粒抗肿瘤疗效
BALB/c小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠右背皮下移植4×106 4T1细胞。当肿瘤体积达到50mm3时，将小鼠分为5组(n＝8)，分别在第1、4、7天按照10mg喜树碱/kg、2.3mg二氢卟吩e6/kg尾静脉给药。第1组注射生理盐水；第2组注射伊立替康；第3组注射hQ-CPT2纳米粒；第4组注射Boc-CPT2@Ce6纳米粒，并在给药6小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟；第5组注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒，并按照第4组的方法进行光照；每隔2天对小鼠的肿瘤体积、体重、存活率进行测定记录。肿瘤体积的计算公式为长×宽2×0.5。相对肿瘤体积表示为V/V0(V0代表最初没有给药时的体积)。当小鼠死亡或肿瘤体积达到1000mm3时，即认为小鼠死亡。
图19为hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1移植瘤小鼠上肿瘤生长变化图。单一的hQ-CPT2纳米粒化疗和单一的Boc-CPT2@Ce6纳米粒光动力治疗只表现出部分的肿瘤抑制效果，而hQ-CPT2@Ce6纳米粒几乎完全抑制了肿瘤的生长。
建立原位乳腺癌模型进一步评估hQ-CPT2@Ce6纳米粒抗肿瘤疗效的普适性。裸鼠异氟烷麻醉后，在小鼠乳腺垫上移植1×107MCF-7细胞。当肿瘤体积达到50mm3时，将小鼠分为5组(n＝8)，分别在第1、5、9天按照10mg喜树碱/kg、2.3mg二氢卟吩e6/kg尾静脉给药。第1组注射生理盐水；第2组注射伊立替康；第3组注射hQ-CPT2纳米粒；第4组注射Boc-CPT2@Ce6纳米粒，并在给药6小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟；第5组注射hQ-CPT2@Ce6纳米粒，并按照第4组的方法进行光照；每隔2天对小鼠的肿瘤体积、体重、存活率进行测定记录。肿瘤体积的计算公式为长×宽2×0.5。相对肿瘤体积表示为V/V0(V0代表最初没有给药时的体积)。当小鼠死亡或肿瘤体积达到1000mm3时，即认为小鼠死亡。
MCF-7原位瘤小鼠进行和体内抗肿瘤实验相同的治疗后，第16天处死小鼠，收集肿瘤和其他组织，浸泡于4％***进行固定，石蜡包埋、切片(10μm)，经过苏木素和伊红(H&E)染色后，显微镜观察。为了进一步观察肿瘤细胞的凋亡情况，肿瘤用OCT包埋，放置-20℃冻至发白后切片(10μm)，DAPI(5μg/mL)室温染色8分钟，最后通过One Step TUNELApoptosis Assay
Figure BDA0001778422990000221
(Beyotime Biotechnology,China)进行检测。所有的细胞都会被染成蓝色，凋亡细胞会染成绿色，凋亡率定义为凋亡细胞占全部细胞的百分比。
图20为hQ-CPT2@Ce6纳米粒在MCF-7原位瘤小鼠上肿瘤生长变化图。在给药、光照后，hQ-CPT2@Ce6纳米粒显著的抑制了肿瘤的生长和最高细胞凋亡率，表明光调节的光动力治疗与光动力激活的化疗之间有很好的协同抗肿瘤疗效。此外，小鼠的生存率也得到了显著的提升。
实施例23 体内hQ-CPT2@Ce6NPs对4T1转移瘤的抗肿瘤疗效
BALB/c小鼠脱毛、异氟烷麻醉，然后在小鼠左下乳腺垫上种植4×106GFP/luc-4T1细胞。二周后，将小鼠分为5组(n＝6)，分别在第14、18、22、26天按照10mg CPT/kg、2.3mgCe6/kg尾静脉给药。第1组注射PBS；第2组注射伊立替康；第3组注射hQ-CPT2NPs；第4组注射Boc-CPT2@Ce6NPs，并在给药6小时后光照(660nm,10mW/cm2)30分钟；第5组注射hQ-CPT2@Ce6NPs，并按照第4组的方法进行光照。我们通过体内活体成像仪(
Figure BDA0001778422990000222
LuminaШ,PerkinElmer,USA)的生物发光成像模式，对小鼠的肿瘤转移进行监测。从第13天开始，每隔1周对小鼠进行监测。每次成像前，腹腔注射D-荧光素钾盐(150mg/kg)，注射10分钟后进行成像。生物发光图像可通过软件进行处理。第5周处死小鼠，收集肿瘤，PBS洗干净后，将其切成小块，加入Trizol进行匀浆。我们使用PrimeScript RT reagent Kit(Takara Bio,Shiga,Japan)进行RNA的反转录，然后在引物的作用下使用SYBR Premix Ex Taq(TakaraBio)通过real-time PCR进行MTA-1的检测。所有的样本都是在同一个运行中并行分析的。通过比较Ct的方法计算出倍数的变化，其中△Ct＝Ct(MTA-1)-Ct(GAPDH)，Ct是第一次检测到扩增产物的PCR循环数。
此外，在第5周处死小鼠的同时，摘除小鼠的眼球，收集小鼠的全血。一方面通过ELISA试剂盒(Invitrogen,USA)检测血液中MCP-1的含量，另一方面通过Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)检测血液中循环肿瘤细胞(CTC)的数量。收集到的CTC细胞种于4孔板中，37℃培养箱孵育6小时后进行CLSM观察。每孔随机挑选100个视野进行荧光成像，结果表示为每1mL血液中的CTC数量。
图21为hQ-CPT2@Ce6纳米粒在4T1转移瘤小鼠上肿瘤转移变化图。在5周的观察期内，所有载药纳米粒给药组的小鼠全身生物发光信号(除原位瘤以外)相比于生理盐水给药组都有明显的降低。相比于单一的Boc-CPT2@Ce6纳米粒的光动力治疗、hQ-CPT2纳米粒的化疗，hQ-CPT2@Ce6纳米粒能够更加显著的抑制小鼠全身的生物发光信号，说明hQ-CPT2@Ce6纳米粒具有更强的抑制肿瘤转移的能力。和生物发光成像数据相一致，全血中循环肿瘤细胞数(CTCs)进一步表明hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药组全血中具有更少的CTCs数量，从而具有更显著的抗肿瘤转移的能力。
实施例24 BE-CPT2@Hp纳米粒的体内安全性
C57BL/6小鼠按照60mg喜树碱/kg尾静脉分别注射伊立替康和BE-CPT2@Hp纳米粒。给药2天后，摘除小鼠眼球收集全血，用于血常规和血生化中谷丙转氨酶(ALT)/天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测。此外，收集胸骨，浸泡于4％***进行固定，脱钙，石蜡包埋、切片(10μm)，经过苏木素和伊红(H&E)染色后，显微镜观察。
图22为BE-CPT2@Hp纳米粒的体内安全性图。胸骨的组织学分析数据显示，伊立替康给药组小鼠的胸骨中只有部分骨髓腔充斥着造血细胞，而BE-CPT2@Hp纳米粒给药组小鼠的骨髓腔几乎没有发生变化，表明伊立替康对小鼠产生了严重的骨髓毒性。此外，伊立替康给药后导致中性粒细胞的急剧减少，而BE-CPT2@Hp纳米粒给药后中性粒细胞数只发生了轻微的变化，进一步说明伊立替康对小鼠产生了严重的骨髓毒性。伊立替康给药后小鼠全血中ALT、AST含量都明显增加，而BE-CPT2@Hp纳米粒给药后ALT、AST含量只发生了轻微的变化，进一步说明伊立替康对小鼠产生了严重的肝脏毒性。以上数据表明纳米粒可以显著的降低喜树碱对机体和主要组织的毒性。
实施例25 hQ-CPT2@Ce6纳米粒的体内安全性
BALB/c小鼠按照50mg喜树碱/kg尾静脉分别注射伊立替康和hQ-CPT2@Ce6纳米粒。给药2天后(小鼠体重下降≈9％)，摘除小鼠眼球收集全血，用于血常规和血生化中ALT/AST的检测。此外，收集胸骨，浸泡于4％***进行固定，脱钙，石蜡包埋、切片(10μm)，经过苏木素和伊红(H&E)染色后，显微镜观察。
图23为hQ-CPT2@Ce6纳米粒的体内安全性图。胸骨的组织学分析数据显示，伊立替康给药组小鼠的胸骨中只有部分骨髓腔充斥着造血细胞，而hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药组小鼠的骨髓腔几乎没有发生变化，表明伊立替康对小鼠产生了严重的骨髓毒性。此外，伊立替康给药后导致中性粒细胞的急剧减少，而hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药后中性粒细胞数只发生了轻微的变化，进一步说明伊立替康对小鼠产生了严重的骨髓毒性。伊立替康给药后小鼠全血中ALT、AST含量都明显增加，而hQ-CPT2@Ce6纳米粒给药后ALT、AST含量只发生了轻微的变化，进一步说明伊立替康对小鼠产生了严重的肝脏毒性。以上数据表明纳米粒可以显著的降低喜树碱对机体和主要组织的毒性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (14)

1.一种具有肿瘤微环境响应的二聚体前药，具有式Ⅰ所示结构：
Figure FDA0003294015950000011
其中，R1为式Ⅰ-a或式Ⅰ-b所示结构：
Figure FDA0003294015950000012
其中，R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自非取代的C1-C10烷基或C1～C10烷氧基；
所述R2为喜树碱；
R3为H、C1～C6烷基；
X1为O；
X2为
Figure FDA0003294015950000013
L为式g所示结构，且N原子与R1相连：
Figure FDA0003294015950000014
R6、R6＇独立的选自H或C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的二聚体前药，其特征在于，所述R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
3.根据权利要求1所述的二聚体前药，其特征在于，所述L为式g所示结构：
Figure FDA0003294015950000021
其中，R6、R6＇独立的选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基；
所述R3为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基。
4.根据权利要求1所述的二聚体前药，其特征在于，具有式Ⅱ所示结构：
Figure FDA0003294015950000022
其中，R1为式Ⅰ-a所示结构：
Figure FDA0003294015950000023
R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自C1-C10烷基或C1～C10烷氧基。
5.根据权利要求4所述的二聚体前药，其特征在于，所述R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
6.根据权利要求4所述的二聚体前药，其特征在于，具有式Ⅱ-a所示结构：
Figure FDA0003294015950000031
其中，R1为式Ⅰ-a所示结构：
Figure FDA0003294015950000032
R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自非取代的C1-C10烷基或C1～C10烷氧基。
7.根据权利要求6所述的二聚体前药，其特征在于，所述R4-1、R4-2、R4-3、R4-4独立的选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
8.一种光调控纳米药物，由权利要求1～7任一项所述的二聚体前药，两亲性高分子材料和共载药物，通过自组装形成纳米粒。
9.根据权利要求8所述的光调控纳米药物，其特征在于，所述两亲性高分子材料为结构中包含聚乙二醇、聚乳酸、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚多肽中的任意一种或多种嵌段结构的高分子材料；
所述共载药物为光敏剂。
10.根据权利要求9所述的光调控纳米药物，其特征在于，所述两亲性高分子材料为聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙交酯、聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚三亚甲基碳酸酯和聚乙二醇-聚对二氧环己酮中的一种或多种；
所述光敏剂为血卟啉、二氢卟吩e6、脱镁叶绿素a和原卟啉中的一种或多种。
11.根据权利要求8所述的光调控纳米药物，其特征在于，所述纳米粒的粒径为10～500nm；所述纳米粒的粒径分布为0.01～0.30；所述纳米粒中二聚体前药的包封率为20％～100％；所述二聚体前药的载药量为10％～80％；所述纳米粒中共载药物的包封率为10％～100％；所述共载药物的载药量为3％～20％。
12.根据权利要求11所述的光调控纳米药物，其特征在于，所述纳米粒的粒径为50～150nm；所述纳米粒的粒径分布为0.05～0.20；所述纳米粒中二聚体前药的包封率为65％～100％；所述二聚体前药的载药量为35％～80％；所述纳米粒中共载药物的包封率为15％～100％；所述共载药物的载药量为3％～8％。
13.权利要求8～12任一项所述的光调控纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
将二聚体前药的有机溶液、共载药物的有机溶液和两亲性高分子材料的有机溶液混合，然后滴加至缓冲溶液或水中，得到光调控纳米药物。
14.权利要求8～12任一项所述的光调控纳米药物或权利要求13所述的制备方法制备的光调控纳米药物在制备抗癌药物中的应用。
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