CN105233282A - 一种多功能纳米药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多功能纳米药物组合物及其制备方法，该组合物包括载体和负载在该载体上的活性成分，所述载体为mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与卟啉类化合物共价键连接的聚合物；活性成份包括疏水性药物和亲水性药物，优选所述载体和负载在该载体上的活性成分形成纳米尺寸为50～1000nm颗粒；该多功能纳米药物组合物具有光热效果，使得在传统化学药物治疗的基础上，结合光热治疗，提高治疗效率，可应用于肿瘤治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医药领域，具体涉及一种多功能纳米药物组合物及其制备方法。
背景技术
纳米载药体系是指药物与纳米载体形成的粒径介于1～1000nm的药物输送***，包括纳米球、纳米囊、纳米粒子和纳米脂质体等。纳米载药体系与其它药物载体相比，具有显著优势：(1)超微小体积，可通过人体最小的毛细血管，不易被吞噬细胞迅速清除，延长了在循环***中的存留时间；(2)到达网状内皮***分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位；(3)能穿透组织间隙并被细胞吸收，有利于透皮吸收和细胞内药效发挥；(4)药物可包埋或键合在纳米粒子内部，也可吸附或偶合在其表面；(5)利用纳米材料本身的生物可降解性，pH或温度敏感性等，达到药物控制释放的效果；(6)提高药物的生物利用度和降低毒副作用等。
纳米粒子是纳米载药体系中常用的一种选择，通常用作为药物载体的聚合物负载药物，来得到纳米粒子药物组合物。但是，目前公开的纳米粒子药物组合物的制备方法得到的纳米粒子药物组合物多为只负载一种药物化合物的纳米粒子药物组合物。此种纳米粒子药物组合物治疗方式单一，无法解决药物耐受问题并且治疗效果欠佳。为了避免重复繁琐给药，提高患者顺应性，临床实践中需要单一的给药***拥有多种化疗药物同时递送和光热治疗的功能。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多功能纳米药物组合物及其制备方法。
实现本发明目的技术方案如下：
一种多功能纳米药物组合物，包括载体和负载在该载体上的活性成分，其中，所述载体为单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物；所述活性成份包括疏水性药物和亲水性药物，所述载体和负载在该载体上的活性成分形成纳米颗粒。优选地，所述纳米颗粒尺寸为50～1000nm。进一步优选地，所述纳米颗粒尺寸为50nm～300nm。
本发明还提供上述多功能纳米药物组合物的制备方法，其包括如下步骤：
将所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物溶于与水不混溶的第一有机溶剂中，得修饰卟啉的聚合物溶液；
向所述修饰卟啉的聚合物溶液中加入所述亲水性药物的水溶液，乳化，得初乳；
向所述初乳中加入表面活性剂和溶于第二有机溶剂的所述疏水药物，超声，减压去除有机溶剂后离心洗涤，即得。
本发明提供的多功能纳米药物组合物，可以同时携载亲水药物和疏水药物，载药量高。该药物组合物采用乳化溶剂蒸发法制备，得到的药物组合物尺寸纳米级，且分布窄。进一步，卟啉共价键链接在单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)上，制备成纳米粒子后，具有光热效果，使得在传统化学药物治疗的基础上，结合光热治疗，提高治疗效率，可应用于肿瘤治疗药物。
附图说明
图1-4为实验例1实验结果图；其中：
图1表示不同浓度的mPEG-PLGA-卟啉纳米颗粒在不同时间下对MDA-MB-231细胞活性的影响；
图2表示不同浓度的阿霉素和紫杉醇混合药物对MDA-MB-231细胞活性的影响；
图3表示实施例1制备的多功能纳米药物组合物对MDA-MB-231细胞活性的影响；
图4表示实施例1中的多功能纳米药物组合物与细胞培养12h后，在680nm的激光器照射5min对MDA-MB-231细胞活性的影响。
图5表示实施例2制备的多功能纳米药物组合物的透射电镜图。
图6表示实施例4中的载体的透射电镜图。
图7表示实施例4中的载体的粒径分布图。
图8表示实施例4中的载体和原卟啉的荧光光谱图。
图9表示实施例5中的载体、二氢卟吩e6和PBS缓冲溶液在680nm激光照射下照射时间与温度的变化曲线图。
图10表示实施例4中的载体和修饰卟啉聚合物的吸收光谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种多功能纳米药物组合物，包括载体和负载在该载体上的活性成分，其中，所述载体为单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物(简称mPEG-PLGA-卟啉或者PEG-PLGA-卟啉)；所述活性成份包括疏水性药物和亲水性药物，所述载体和负载在该载体上的活性成分形成纳米颗粒。优选地，所述纳米颗粒尺寸为50～1000nm。进一步优选地，所述纳米颗粒尺寸为50nm～300nm。
优选地，所述mPEG-PLGA或PEG-PLGA的PEG(聚乙二醇)段的重均分子量为1000～10000。
优选地，所述PLGA(聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物)段的重均分子量为5000～50000；进一步优选地，所述PLGA的丙交酯和乙交酯的摩尔比例为50:50～90:10。
优选地，所述载体(即mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与卟啉类化合物共价键连接的聚合物)是由mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA上的羟基与含有羧基的卟啉类化合物进行反应制备得到的。
优选地，所述卟啉类化合物为含有羧基的卟啉，优选为原卟啉、血卟啉、二氢卟吩e6等中的一种或几种。
优选地，所述载体与所述亲水性药物的质量比为10：1～150：1；所述载体与所述疏水药物的质量比为10：1～100：1。
优选地，所述亲水性药物为盐酸阿霉素、盐酸表柔比星等中的一种或几种；更优选为盐酸阿霉素。
优选地，所述疏水性药物为紫杉醇、硼替佐米、姜黄素等中的一种或几种；更优选为紫杉醇。
本发明实施例还提供上述多功能纳米药物组合物的制备方法，其包括如下步骤：
S01：将所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物溶于与水不混溶的第一有机溶剂中，得修饰卟啉的聚合物溶液；
S02：向所述修饰卟啉的聚合物溶液中加入所述亲水性药物的水溶液，乳化，得初乳；
S03：向所述初乳中加入表面活性剂和溶于第二有机溶剂的所述疏水药物，超声，减压去除有机溶剂后离心洗涤，即得。
上述制备方法，其中：
步骤S01中，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等中的一种或几种。
优选地，所述修饰卟啉的聚合物溶液的浓度为5～50mg/mL；
优选地，所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物(即载体)是由mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA上的羟基与含有羧基的卟啉类化合物进行反应制备得到的。
优选地，所述载体(即甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物与卟啉类化合物共价键连接的聚合物)的制备方法包括：将单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物溶于第三有机溶剂中，得共聚物溶液；向所述共聚物溶液中加入能够和所述共聚物上羟基反应的卟啉类化合物；或者还加入催化剂，搅拌反应。
优选地，所述第三有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种；
优选地，所述卟啉类化合物可以是已经被活化羧基的卟啉化合物，也可以是通过加入催化剂活化的羧基卟啉化合物；即催化剂将所述卟啉类化合物的羧基活化后再与mPEG-PLGA或者PEG-PLGA的羟基反应。进一步优选地，所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺等中的一种或几种。
进一步优选地，所述mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与所述卟啉类化合物进行反应时加入有机碱作为缚酸剂，以提高反应效率。所述缚酸剂优选为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种或几种。
优选地，所述mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与卟啉类化合物的摩尔比为1：10～10：1，所述催化剂与mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA的摩尔比为5：1～1：5。优选地，所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺中的一种或几种。
优选地，所述mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与所述卟啉类化合物进行反应的时间通常大于6h，以提高反应效率。
优选地，所述mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与卟啉类化合物进行反应后通过过滤和透析的方法提纯，及通过冷冻干燥得到所述载体(即mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与卟啉类化合物共价键连接的聚合物)。
步骤S02中，所述载体与所述亲水性药物的质量比为10：1～150：1，所述亲水性药物水溶液与所述修饰卟啉的聚合物溶液的体积比为1：5～1：100。所述乳化可以通过震荡、超声等方法实现。
步骤S03中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、丙二醇嵌段聚醚F68、吐温80、司盘和十二烷基磺酸钠中的一种或几种；优选为聚乙烯醇。
优选地，所述表面活性剂在所述初乳中的质量浓度为0.5％～3％。
优选地，所述载体(即所述修饰卟啉的聚合物)与所述疏水药物的质量比为10：1～100：1。
所述第二有机溶剂优选为二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯等中的一种或几种。
所述超声的条件为100～300W功率下超声3～10min。
进一步，为了保证所获得的多功能纳米药物组合物的稳定性和分散性，将超声所得产物逐滴滴加到质量比为0.1％～1％的聚乙烯醇水溶液中，搅拌30～60min后再减压除去有机溶剂，离心，用去离子水再离心洗涤2～3次。具体地，所述离心洗涤的速度为10000～15000rpm。
研究发现，通过改变载体与药物的质量比可以得到不同载药量的多功能纳米药物组合物，如表1所示，在相同制备条件下，随着聚合物与药物质量比的提高，其载药量下降。因此，优选地，所述载体与亲水性药物以及疏水性药物的质量比为20：(1～2)：(1～2)；进一步优选地，所述亲水性药物为盐酸阿霉素，所述疏水性药物为紫杉醇；更优选地，所述载体与盐酸阿霉素和紫杉醇的质量比为20：1.5：1。
表1
表1中质量比是指mPEG-PLGA-卟啉载体或PEG-PLGA-卟啉载体与盐酸阿霉素及紫杉醇的质量比。
以下对本发明所述载体(即所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物)及其制备方法进一步详细说明。
本发明所述载体也可作为纳米光热治疗试剂。本发明所述载体中，卟啉通过共价键连接的可降解聚合物，不会在循环过程中释放，所述载体通过乳化-固化法制备，稳定时间长，所述载体还可以在形成过程中包载药物，在光热治疗试剂中具有一定的应用潜力。
本发明所述载体为由单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物。
优选地，所述载体为纳米颗粒；进一步优选地，所述纳米颗粒尺寸为50～1000nm；更优选地，所述纳米颗粒尺寸为50nm～300nm。
优选地，所述mPEG-PLGA或PEG-PLGA的PEG(聚乙二醇)段的重均分子量为1000～10000。
优选地，所述PLGA(聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物)段重均分子量为5000～50000；进一步优选地，所述PLGA的丙交酯和乙交酯的摩尔比例为50:50～90:10。
优选地，所述mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA与卟啉类化合物共价键连接的聚合物是由mPEG-PLGA和/或PEG-PLGA上的羟基与含有羧基的卟啉类化合物制备得到的。
优选地，所述卟啉类化合物为含有羧基的卟啉，优选为原卟啉、血卟啉、二氢卟吩e6等中的一种或几种。
本发明还提供上述载体的制备方法，其包括如下步骤：
S011：将单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)溶于第三有机溶剂中，得共聚物溶液；
S012：向所述共聚物溶液中加入能够和聚合物上羟基反应的卟啉类化合物；或者还加入催化剂，搅拌反应，得修饰卟啉的聚合物。
优选地，所述载体的制备方法还包括步骤S013：将所述修饰卟啉的聚合物制备成纳米颗粒；优选地，所述纳米颗粒尺寸为50～1000nm。
上述制备方法中：
步骤S011中，所述第三有机溶剂可以为能溶解mPEG-PLGA或者PEG-PLGA的有机溶剂；优选为二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯等中的一种或几种。
步骤S012中，mPEG-PLGA或者PEG-PLGA的羟基与卟啉类化合物进行反应，形成共价键连接的聚合物。所述卟啉类化合物可以是已经被活化羧基的卟啉化合物，也可以是通过加入催化剂活化的羧基卟啉化合物；即催化剂将所述卟啉类化合物的羧基活化后再与mPEG-PLGA或者PEG-PLGA的羟基反应。
优选地，所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺等中的一种或几种。
进一步优选地，步骤S012中，mPEG-PLGA或者PEG-PLGA的羟基与所述卟啉类化合物进行反应时加入有机碱作为缚酸剂，以提高反应效率。所述缚酸剂优选为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种或几种。
优选地，所述mPEG-PLGA或者PEG-PLGA与卟啉类化合物的摩尔比为1：10～10：1，所述催化剂与mPEG-PLGA或者PEG-PLGA的摩尔比为5：1～1：5。
优选地，mPEG-PLGA或者PEG-PLGA与所述卟啉类化合物进行反应的时间通常大于6h，以提高反应效率。
优选地，所述mPEG-PLGA或者PEG-PLGA与卟啉类化合物进行反应后通过过滤和透析的方法提纯，及通过冷冻干燥得到修饰卟啉的聚合物。
步骤S013中，将所述修饰卟啉的聚合物制备成纳米颗粒的方法可为乳化-固化法、纳米沉淀法、乳化-溶剂蒸发法等现有技术常规方法；优选地，选用乳化-溶剂蒸发法制备，这样得到的纳米颗粒结构更为致密和稳定，光热效果更好。
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
对以下实施例中所得到的多功能纳米药物组合物和载体进行动态光散射(ZetasizerNanoZS)、透射电镜(美国FEI,TecnaiG220S-TWIN，200kV)、透光率(美国PerkinElmer,Lambda950UV-spectrophotometer)、荧光分析(美国PerkinElmer,LS-55)以及光热效应测定。
实施例1
将100nmol的mPEG-PLGA、50nmol的原卟啉、50nmol的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、25nmol的4-(二甲氨基)吡啶和50μL的N,N-二异丙基乙胺在10mL无水二氯甲烷中混合，氩气保护下室温反应48h，产物透析24h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-卟啉载体；
将20mgmPEG-PLGA-卟啉溶于1mL二氯甲烷中，加入0.2mL盐酸阿霉素水溶液(7.5mg/mL)，混合后超声3min，然后加入2mL2％的聚乙烯醇水溶液，涡旋震荡混合均匀，加入0.2mL溶于二氯甲烷的紫杉醇(5mg/mL)，然后超声乳化8min后，混合物缓慢加入到10mL0.3％的聚乙烯醇中搅拌10min。用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷后，13000rpm离心10min，再用去离子水离心洗涤，得到所述多功能纳米药物组合物。
实施例2
100nmolofmPEG-PLGA、100nmol二氢卟吩e6、50nmol1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、25nmol4-(二甲氨基)吡啶和50μL三乙胺在10mL无水二氯甲烷中混合，氩气保护下室温反应48h，产物透析48h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-二氢卟吩e6。
将20mgmPEG-PLGA-二氢卟吩e6溶于1mL二氯甲烷中，加入0.2mL盐酸阿霉素水溶液(5mg/mL)，混合后超声5min，然后加入10mL2％的聚乙烯醇水溶液，涡旋震荡混合均匀，加入0.2mL溶于二氯甲烷的紫杉醇(5mg/mL)，然后超声乳化8min后，用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷后，13000rpm离心10min，再用去离子水离心洗涤，得到所述多功能纳米药物组合物。
实施例3
100nmolofPEG-PLGA、100nmol血卟啉、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺、300nmol二环己基碳二亚胺，室温反应48h，过滤后产物透析48h，冷冻干燥，获得PEG-PLGA-卟啉。
将20mgmPEG-PLGA-二氢卟吩e6溶于1mL乙酸乙酯中，加入0.2mL盐酸表柔比星水溶液(5mg/mL)，混合后超声5min，然后加入10mL2％的聚乙烯醇和10mL2％的丙二醇嵌段聚醚F68水溶液，涡旋震荡混合均匀，加入0.2mL溶于二氯甲烷的紫杉醇(1mg/mL)，然后超声乳化8min后，用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷后，13000rpm离心10min，再用去离子水离心洗涤，得到所述多功能纳米药物组合物。
实施例4
一种载体，其为由单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物形成的纳米颗粒。该载体可作为纳米光热治疗试剂。
该载体的制备方法包括：
1)将100nmol的mPEG-PLGA溶于10mL无水二氯甲烷中，得聚合物溶液；
2)向所得聚合物溶液中加入50nmol的原卟啉、50nmol的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、25nmol的4-(二甲氨基)吡啶和50μL的N,N-二异丙基乙胺在氩气保护下室温反应48h；将所得产物过滤、透析24h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-卟啉；
3)将所得mPEG-PLGA-卟啉溶于二氯甲烷中，mPEG-PLGA-卟啉浓度为20mg/mL，超声15min至完全溶解；取0.2mL去离子水与1.0mL的mPEG-PLGA-卟啉溶液，用细胞超声破碎机乳化3min，得油包水初乳；将初乳加入到3mL的PVA(聚乙烯醇)水溶液中，涡旋震荡混合均匀，然后超声乳化5min得到水包油包水复乳；利用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷，得到所述载体。
实施例5
一种载体，其为由单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物形成的纳米颗粒。该载体可作为纳米光热治疗试剂。
该载体的制备方法包括：
100nmolofmPEG-PLGA、100nmol二氢卟吩e6、50nmol1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、25nmol4-(二甲氨基)吡啶和50μL三乙胺在10mL无水二氯甲烷中混合，氩气保护下室温反应48h，产物透析48h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-二氢卟吩e6。
将7.5mgmPEG-PLGA-二氢卟吩e6溶于1.5mL丙酮中，超声15min至完全溶解。在磁力搅拌下将上述溶液以30μL/min的速度滴加到10mL的去离子水中。继续搅拌30min，固化纳米颗粒。利用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的有机溶剂，得到所述载体。
实施例6
一种载体，其为由聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物形成的纳米颗粒。该载体可作为纳米光热治疗试剂。
该载体的制备方法包括：
100nmolofPEG-PLGA、100nmol血卟啉、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺、300nmol二环己基碳二亚胺，室温反应48h，过滤后产物透析48h，冷冻干燥，获得PEG-PLGA-卟啉。
将20mgPEG-PLGA-卟啉溶于1mL二氯甲烷中，超声15min至完全溶解。加入10mLPVA(1％)溶液，涡旋震荡使其混合均匀，利用高速剪切机乳化5min，乳化功率6,000rmp，得到水包油乳状液。利用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的有机溶剂，得到所述载体。
实施例7
一种载体，其为由单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物形成的纳米颗粒。该载体可作为纳米光热治疗试剂。
该载体的制备方法包括：
100nmolofmPEG-PLGA、50nmol原卟啉、50nmol1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、25nmol4-(二甲氨基)吡啶和50μLN,N-二异丙基乙胺在10mL无水二氯甲烷中混合，氩气保护下室温反应48h，产物透析24h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-卟啉。
将mPEG-PLGA-卟啉溶于二氯甲烷中，浓度为20mg/mL，超声15min至完全溶解。取0.2mL去离子水与1.0mLmPEG-PLGA-卟啉溶液，用细胞超声破碎机乳化3min，得油包水初乳。将初乳加入到3mLPVA水溶液中，涡旋震荡混合均匀，然后超声乳化5min得到水包油包水复乳。利用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷，得到所述载体。
实施例8
一种载体，其为由单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物形成的纳米颗粒。该载体可作为纳米光热治疗试剂。
该载体的制备方法包括：
1)将120nmol的mPEG-PLGA和PEG-PLGA溶于15mL无水二氯甲烷中，得聚合物溶液；其中，mPEG-PLGA与PEG-PLGA的比例为1∶1；
2)向所得聚合物溶液中加入60nmol的原卟啉、60nmol的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、30nmol的4-(二甲氨基)吡啶和60μL的N,N-二异丙基乙胺在氩气保护下室温反应48h；将所得产物过滤、透析24h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉；
3)将所得mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉溶于二氯甲烷中，mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉浓度分别为12mg/mL，超声15min至完全溶解；取0.2mL去离子水与1.0mL的mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉溶液，用细胞超声破碎机乳化3min，得油包水初乳；将初乳加入到3mL的PVA(聚乙烯醇)水溶液中，涡旋震荡混合均匀，然后超声乳化5min得到水包油包水复乳；利用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷，得到所述载体。
实施例9
一种载体，其为由单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(mPEG-PLGA)和聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)与卟啉类化合物共价键连接的聚合物形成的纳米颗粒。该载体可作为纳米光热治疗试剂。
该载体的制备方法包括：
1)将120nmol的mPEG-PLGA和PEG-PLGA溶于15mL无水二氯甲烷中，得聚合物溶液；其中，mPEG-PLGA与PEG-PLGA的比例为1∶1；
2)向所得聚合物溶液中加入60nmol的二氢卟吩e6、60nmol的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、30nmol的4-(二甲氨基)吡啶和60μL的N,N-二异丙基乙胺在氩气保护下室温反应48h；将所得产物过滤、透析24h，冷冻干燥，获得mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉；
3)将所得mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉溶于二氯甲烷中，mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉浓度分别为12mg/mL，超声15min至完全溶解；取0.2mL去离子水与1.0mL的mPEG-PLGA-卟啉和PEG-PLGA-卟啉溶液，用细胞超声破碎机乳化3min，得油包水初乳；将初乳加入到3mL的PVA(聚乙烯醇)和F68(聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物)的混合水溶液中，涡旋震荡混合均匀，然后超声乳化5min得到水包油包水复乳；利用旋转蒸发仪减压蒸发、除去溶液中的二氯甲烷，得到所述载体。
实验例1
将实施例1制得的多功能纳米药物组合物用PBS进行稀释，以阿霉素和紫杉醇药物总质量计，配制成浓度分别为10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL，0.1μg/mL、0.01μg/mL的不同浓度的药液。同时，将阿霉素和紫杉醇配成溶液，以二者质量比为1.5：1，稀释成总浓度分别为10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL，0.1μg/mL、0.01μg/mL的不同浓度的药液作为对照。以单纯的mPEG-PLGA-卟啉聚合物纳米颗粒作为对照。
培养乳腺癌细胞MDA-MB-231，温度为37℃，将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞分别按1000个/孔的密度接种于96孔培养板，12小时后，分别加入不同浓度的药液以及空载聚合物，每种浓度平行6孔。分别采用含有10重量％胎牛血清的DMEM培养基，每孔加100μL，培养24h和48h后，使用MTS试剂盒对细胞活性进行测定。具体操作完全按照试剂盒的说明进行。
对于肿瘤细胞的活力影响的实验结果如图1、图2、图3和图4所示。图1是mPEG-PLGA-卟啉纳米颗粒对MDA-MB-231细胞活性的影响(该纳米颗粒的制备方法同实施例1步骤1)中纳米药物组合物的制备方法，不含药物)，图2是药物分子阿霉素和紫杉醇对MDA-MB-231细胞活性的影响，图3表示实施例1制备的多功能纳米药物组合物对MDA-MB-231细胞活性的影响。图4表示实施例1制备的多功能纳米药物组合物对MDA-MB-231细胞培养12h后，在680nm的激光器(镭志威，北京)下，利用1W/cm2的激光对其照射5min后的细胞活性。
从实验结果可以看出，mPEG-PLGA-卟啉纳米颗粒对MDA-MB-231肿瘤细胞基本没有杀伤作用，载药纳米粒子的杀伤细胞能力与浓度成正比，从时间效应上来看，在药物相同浓度条件下，48h作用后纳米粒子抑制细胞活性的程度比24h效果增强，所述药物组合物表现出持续释放的效果。由于原卟啉在纳米光热治疗试剂中高度聚集，其具有良好光热性能，因此在外加激光的照射下，材料升温，增强了化疗药物的治疗效果，细胞存活率降低(图3和图4)。
实验例2
对实施例2制得的多功能纳米药物组合物用透射电镜(美国FEI,TecnaiG220S-TWIN，200kV)测定，如图5所示，该多功能纳米药物的尺寸在100nm。
实验例3
图6是实施例4制备的载体的透射电镜图，从电镜图上可以看出，纳米颗粒的尺寸在100nm左右，近似球形。利用激光粒度仪测定实施例4获得的载体的粒径分布，如图7所示，纳米颗粒的平均粒径为150nm左右，也进一步证实所述载体具有良好的分散性。对实施例4获得的载体和单纯的原卟啉进行荧光分析，如图8，结果显示所述载体荧光猝灭非常严重，说明原卟啉在纳米颗粒中高度聚集，这也是其具有良好光热性能的原因。
此外，对实施例5制备的载体以及二氢卟吩e6和PBS缓冲溶液进行光热效应测定，在680nm的激光器(镭志威，北京)下，利用1W/cm2的激光对其照射，并利用热成像仪(Ti27，Fluke)进行温度测评，结果显示如图9所示，由图9可知该所述载体具有良好的光热性能。利用紫外分光光度计对实施例4获得的载体和修饰卟啉的聚合物进行光谱扫描，结果如图10所示，该载体相比修饰卟啉的聚合物发生红移，因此，所述载体能够有效的吸收近红外光以用于光热治疗。
分别将实施例4-9制得的载体按与实施例1-3类似的方法制备成多功能纳米药物组合物，其效果与实施例1-3制备的多功能纳米药物组合物相当。限于篇幅，本文仅例举部分最具说服力的试验例。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种多功能纳米药物组合物，包括载体和负载在该载体上的活性成分，其中，所述载体为单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物与卟啉类化合物共价键连接的聚合物；所述活性成份包括疏水性药物和亲水性药物，所述载体和负载在该载体上的活性成分形成纳米颗粒；优选地，所述纳米颗粒尺寸为50～1000nm；进一步优选地，所述纳米颗粒尺寸为50nm～300nm。
2.根据权利要求1所述的多功能纳米药物组合物，其特征在于，所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物的聚乙二醇段的重均分子量为1000～10000；
优选地，所述聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物段的重均分子量为5000～50000；进一步优选地，所述聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物的丙交酯和乙交酯的摩尔比例为50:50～90:10；
优选地，所述卟啉类化合物为含有羧基的卟啉，进一步优选为原卟啉、血卟啉、二氢卟吩e6中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的多功能纳米药物组合物，其特征在于，所述载体与所述亲水性药物的质量比为10：1～150：1；所述载体与所述疏水药物的质量比为10：1～100：1；
优选地，所述亲水性药物为盐酸阿霉素、盐酸表柔比星中的一种或几种；所述疏水性药物为紫杉醇、硼替佐米、姜黄素中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的多功能纳米药物组合物，其特征在于，所述载体与亲水性药物以及疏水性药物的质量比为20：(1～2)：(1～2)；
优选地，所述载体与盐酸阿霉素和紫杉醇的质量比为20：1.5：1。
5.权利要求1-4任一项所述多功能纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01：将所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物与卟啉类化合物共价键连接的聚合物溶于与水不混溶的第一有机溶剂中，得修饰卟啉的聚合物溶液；
S02：向所述修饰卟啉的聚合物溶液中加入所述亲水性药物的水溶液，乳化，得初乳；
S03：向所述初乳中加入表面活性剂和溶于第二有机溶剂的所述疏水药物，超声，减压去除有机溶剂后离心洗涤，即得。
6.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，步骤S01中，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或几种；
优选地，所述修饰卟啉的聚合物溶液的浓度为5～50mg/mL；
优选地，所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物与卟啉类化合物共价键连接的聚合物的制备方法包括：将单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物溶于第三有机溶剂中，得共聚物溶液；向所述共聚物溶液中加入能够和所述共聚物上羟基反应的卟啉类化合物；或者还加入催化剂，搅拌反应；
优选地，所述第三有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种；
优选地，所述卟啉类化合物是已经被活化羧基的卟啉化合物；或是通过加入催化剂活化的羧基卟啉化合物；进一步优选地，所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的的制备方法，其特征在于，所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物与所述卟啉类化合物进行反应时加入有机碱作为缚酸剂；所述缚酸剂优选为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的的制备方法，其特征在于，所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物与卟啉类化合物的摩尔比为1：10～10：1，所述催化剂与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸嵌段共聚物的摩尔比为5：1～1：5；优选地，所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，步骤S02中所述亲水性药物水溶液与所述修饰卟啉的聚合物溶液的体积比为1：5～1：100。
10.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，步骤S03中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、丙二醇嵌段聚醚F68、吐温80、司盘和十二烷基磺酸钠中的一种或几种；
优选地，所述表面活性剂在所述初乳中的质量浓度为0.5％～3％；
优选地，所述第二有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯中的一种或几种。
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