CN109097375A - 通过表达木糖转运蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过表达木糖转运蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法，以大肠杆菌中的木糖转运蛋白基因序列为模板，结合乳酸菌的密码子偏好和RNA的稳定性考量，编码一个全新的适用于乳酸菌的木糖转运蛋白基因序列，在乳酸乳球菌中表达此蛋白来提高利用木糖发酵乳酸效率。本发明方法通过表达木糖转运蛋白来提高木糖利用率，相较于传统方法更简单快捷，发酵时间缩短12小时，乳酸产量提升16.7%~21%，具有很好的应用推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种编码的木糖转运蛋白基因，以及通过在乳酸乳球菌中表达此蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法。
背景技术
国内外乳酸发酵进入工业化时代已有一段时间了，但发酵原料普遍采用葡萄糖或淀粉水解物等已糖。在当今对环境的重视，对粮食的珍视，非常有必要开发出以非粮食物资做为原料来生产乳酸的方法。木质纤维的主要分解产物为葡萄糖和木糖，其被视为未来最重要的原料替代物资。以往主要是通过从自然界挑选和变异优化的方法来进行发酵菌株的选育，利用已经较成熟的从葡萄糖到乳酸的发酵途径理论知识为基础，进行培养基、培养条件等的优化来进行乳酸发酵的研究。而乳酸菌对戊糖，特别是利用木糖发酵产乳酸的知识仍然远远不够。
大部分微生物都能利用葡萄糖，但是只有很少的细菌，比如大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）等能够利用木糖。大量的研究结果显示，因为诸多微生物的木糖转运蛋白或木糖代谢途径酶有或多或少的缺失致使木糖利用非常困难。
目前，作为乳酸工业生产菌株主要有根霉属和细菌中的乳酸菌属。根霉菌存在一些缺点：发酵温度不高，糖酸转化率低，发酵过程需通气和搅拌，能耗高等不足限制了其生产乳酸的发展。随着对细菌发酵生产乳酸各种优点的认识，比如代谢快，可以缩短发酵周期；耐受温度高，可以减少发酵过程中对冷却水的消耗，同时也减少了染菌概率等各种好处。
随着分子生物学的发展，很多乳酸菌的基因序列已经测序完成，比如植物乳杆菌有3种，乳酸乳球菌有7种，德氏乳杆菌有4种已经公布其序列。根据已公布的基因序列可知乳酸乳球菌含有完整的木糖代谢途径的酶和木糖转运蛋白。文献（Two differentpathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration onthe yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lacticacid bacterium Lactococcus lactis 10-1）中，K. Tanaka就是利用乳酸乳球菌发酵木糖产乳酸。但是除乳酸乳球菌以外的乳酸菌大都没有完整的木糖代谢途径。也有些研究人员是利用传统方法从自然界挑选和变异来得到木糖发酵乳酸菌，但此种方法将会是一个长期、工作量大并且靠运气的工作。如果通过传统的方法得到了可以利用木糖发酵产乳酸的乳酸菌，接着再利用传统的变异等方法来提高产乳酸效率，将又会是一个长期、工作量大并且靠运气的工作。
发明内容
本发明的目的是：设计一种通过表达木糖转运蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法，以大肠杆菌中的木糖转运蛋白基因序列为模板，结合乳酸菌的密码子偏好和RNA的稳定性考量，编码一个全新的适用于乳酸菌的木糖转运蛋白基因序列，在乳酸乳球菌中表达此蛋白来提高利用木糖发酵乳酸效率。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是该方法包括以下步骤：
（1）配制培养基：将培养基分别配制，并在各个固体培养基配方的基础上分别加20g/L琼脂，培养基灭菌方式为121 ℃，20 min；其中，各个培养基配方如下：
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L；
LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；
乳酸菌种子培养基（MRS）：酪蛋白胨 10g/L，牛肉浸取物 10g/L，酵母提取液 5g/L，葡萄糖 5g/L，乙酸钠 5g/L，柠檬酸二铵 2g/L，吐温80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，一水硫酸锰 0.05g/L，碳酸钙 10g/L；
乳酸发酵培养基：葡萄糖 5g/L，木糖 50g/L，牛肉浸取物 10g/L，酵母提取物 15g/L，磷酸氢二钾2g/L,七水硫酸镁0.6g/L,一水硫酸锰0.1g/L,七水硫酸亚铁 0.2g/L；
（2）编码木糖转运蛋白基因和所需引物的制备：由南京金斯瑞生物科技有限公司制作编码木糖转运蛋白基因XylE，长度为1476bp；由南京金斯瑞生物科技有限公司制作引物序列；其中，Lp启动子引物Fp序列为CCGGGGATCGATCCTCTTCAATGCTCTCCGTAGTCG，Rp序列GTATTGAGTGTTCATGATGTAGTCCTCCGT；Lt终止子引物Ft序列为ACTGCTACTCTTTAAATGGTAGTTAAAGTT，Rt序列CAGACTTTGCAAGCTCATCGGCCATTGGTGCTAAAC；
（3）乳酸乳球菌glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapA）基因的启动子和终止子基因片段的获得：从穿刺试管中挑取一环乳酸乳球菌接种于种子培养基10mL，37℃，螺口试管静置培养至OD660到0.6后，用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit进行乳酸乳球菌基因组DNA提取；以提取的基因组DNA做为模板，使用引物Fp和Rp，获得gapA基因的启动子PCR片段，长度为977bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® MaxDNA Polymerase kit；以提取的乳酸乳球菌基因组DNA做为模板，使用引物Ft和Rt，获得gapA基因的终止子PCR片段，长度为517bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，35s共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerasekit；PCR结束后，2%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquickGel Extraction Kit；回收的片段分别命名为Pgx和Tgx；
（4）编码表达基因的获得：利用Overlap PCR方式进行编码表达基因PXT的获得；以编码的XylE基因、片段Pgx和片段Tgx做为模板，使用引物Fp和Rt，获得编码表达基因PXT的PCR片段，长度为2940bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；PCR结束后，1%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit；
（5）重组质粒pMG36e-PXT的制备：质粒pMG36e使用HindIII和XbaI进行双酶切后，纯化回收酶切后线型质粒片段，和编码表达基因PXT片段构建重组质粒pMG36e-PXT；构建方法和试剂采用Takara公司的In-Fusion HD Cloning Plus kit；
（6）乳酸乳球菌感受态细胞的制备及转化：
（6-1）将乳酸乳球菌单菌落接入3 mL MRS液体培养基中，37 ℃螺口试管静置培养12h，再按1%的接种量接种至50 mL液体MRS培养基（不含碳酸钙）中，37 ℃螺口试管静置培养至OD660=0.6，冰浴10 min，于4℃、4500 r/min离心7min来收集细胞，去上清，分别用冰浴预冷的1mmol/L MgCl2和300g/L聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）洗涤细胞，最后将细胞重悬于300g/L PEG中，电转化备用；
（6-2）取50μg重组质粒pMG36e-PXT与100μL感受态细胞混匀，冰浴5min后转入冰浴预冷的规格为0.2cm的电转杯中，设置电转参数（12.5 kV/cm，200 Ω）后进行电击，电击完毕后立即加入800μL液体MRS培养基（不含碳酸钙），并在37 ℃静置温育2h，然后取80μL涂布于含50μg/mL红霉素抗性MRS平板（不含碳酸钙），37 ℃厌氧培养48h后含有重组质粒的转化子长出；
（6-3）将挑选出的乳酸乳球菌转化子进行菌落PCR验证阳性菌落；PCR验证条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；引物为Fp和Rt；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；验证后接种至含50μg/mL红霉素抗性MRS液体培养基（不含碳酸钙）37℃螺口试管静置培养OD660=0.6，加入同等体积的消毒过的20%甘油混匀后放入-80℃冰箱保存；
（7）利用木糖产乳酸效果验证：将携带有质粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌进行利用木糖产乳酸发酵验证，37℃，发酵72h结束，每12h检测木糖残余量和乳酸含量。
其中，所述编码的木糖转运蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID:1。
本发明的有益效果是：使用本发明编码的木糖转运蛋白基因在乳酸乳球菌中表达，利用木糖产乳酸效率明显提高，发酵时间缩短12小时，乳酸产量提升16.7%~21%。
附图说明
图1是本发明的结合乳酸菌的密码子偏好和RNA的稳定性考量，编码用于乳酸菌的木糖转运蛋白基因序列SEQ ID NO：1；
图2是本发明的构建质粒示意图；
图3是本发明的编码转运蛋白基因序列与NCBI数据库进行Blast比对结果；
图4是实施例利用木糖产乳酸的发酵曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：
（1）编码木糖转运蛋白基因和所需引物的制备：由南京金斯瑞生物科技有限公司制作编码木糖转运蛋白基因XylE，长度为1476bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；由南京金斯瑞生物科技有限公司制作引物序列；其中，Lp启动子引物Fp序列为CCGGGGATCGATCCTCTTCAATGCTCTCCGTAGTCG，Rp序列GTATTGAGTGTTCATGATGTAGTCCTCCGT；Lt终止子引物Ft序列为ACTGCTACTCTTTAA ATGGTAGTTAAAGTT，Rt序列CAGACTTTGCAAGCTCATCGGCCATTGGTGCTAAAC；
（2）乳酸乳球菌glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapA）基因的启动子和终止子基因片段的获得：从穿刺试管中挑取一环乳酸乳球菌接种于种子培养基10mL，37℃，螺口试管静置培养至OD660到0.6后，用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit进行乳酸乳球菌基因组DNA提取；以提取的基因组DNA做为模板，使用引物Fp和Rp，获得gapA基因的启动子PCR片段，长度为977bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® MaxDNA Polymerase kit；以提取的乳酸乳球菌基因组DNA做为模板，使用引物Ft和Rt，获得gapA基因的终止子PCR片段，长度为517bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，35s共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerasekit；PCR结束后，2%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquickGel Extraction Kit；回收的片段分别命名为Pgx和Tgx；
（3）编码表达基因的获得：利用Overlap PCR方式进行编码表达基因PXT的获得；以编码的XylE基因、片段Pgx和片段Tgx做为模板，使用引物Fp和Rt，获得编码表达基因PXT的PCR片段，长度为2940bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；PCR结束后，1%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit；
（4）重组质粒pMG36e-PXT的制备：质粒pMG36e使用HindIII和XbaI进行双酶切后，纯化回收酶切后线型质粒片段，和编码表达基因PXT片段构建重组质粒pMG36e-PXT；构建方法和试剂采用Takara公司的In-Fusion HD Cloning Plus kit；
（5）乳酸乳球菌感受态细胞的制备及转化：
（5.1）将乳酸乳球菌单菌落接入3 mL MRS液体培养基中，37 ℃螺口试管静置培养12h，再按1%的接种量接种至50 mL液体MRS培养基（不含碳酸钙）中，37 ℃螺口试管静置培养至OD660=0.6，冰浴10 min，于4℃、4500 r/min离心7min来收集细胞，去上清，分别用冰浴预冷的1mmol/L MgCl2和300g/L聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）洗涤细胞，最后将细胞重悬于300g/L PEG中，电转化备用；
（5.2）取50μg重组质粒pMG36e-PXT与100μL感受态细胞混匀，冰浴5min后转入冰浴预冷的规格为0.2cm的电转杯中，设置电转参数（12.5 kV/cm，200 Ω）后进行电击，电击完毕后立即加入800μL液体MRS培养基（不含碳酸钙），并在37 ℃静置温育2h，然后取80μL涂布于含50μg/mL红霉素抗性MRS平板（不含碳酸钙），37 ℃厌氧培养48h后含有重组质粒的转化子长出；
（5.3）将挑选出的乳酸乳球菌转化子进行菌落PCR验证阳性菌落；PCR验证条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；引物为Fp和Rt；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；验证后接种至含50μg/mL红霉素抗性MRS液体培养基（不含碳酸钙）37℃螺口试管静置培养OD660=0.6，加入同等体积的消毒过的20%甘油混匀后放入-80℃冰箱保存；
（6）利用木糖产乳酸效果验证：将-80℃冰箱保存的携带有质粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌和乳酸乳球菌ATCC11454分别置于冰上溶解后，100μL接种于种子培养基10mL，37℃，螺口试管培养24h后5%接种量转接至发酵培养基（含有碳酸钙 25g/L）；发酵条件为250mL广口瓶（橡胶塞带无菌空气过滤器）装液量200mL，37℃，每2h振荡一次，发酵72h结束，每12h检测木糖残余量和乳酸含量；携带有质粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌在60h产乳酸达到最高值42g/L，木糖残余量2g/L；乳酸乳球菌ATCC11454在72h产乳酸达到最高值36g/L，木糖残余量5 g/L。
实施例2：
（1）编码木糖转运蛋白基因和所需引物的制备：由南京金斯瑞生物科技有限公司制作编码木糖转运蛋白基因XylE，长度为1476bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；由南京金斯瑞生物科技有限公司制作引物序列；其中，Lp启动子引物Fp序列为CCGGGGATCGATCCTCTTCAATGCTCTCCGTAGTCG，Rp序列GTATTGAGTGTTCATGATGTAGTCCTCCGT；Lt终止子引物Ft序列为ACTGCTACTCTTTAA ATGGTAGTTAAAGTT，Rt序列CAGACTTTGCAAGCTCATCGGCCATTGGTGCTAAAC；
（2）乳酸乳球菌glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapA）基因的启动子和终止子基因片段的获得：从穿刺试管中挑取一环乳酸乳球菌接种于种子培养基10mL，37℃，螺口试管静置培养至OD660到0.6后，用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit进行乳酸乳球菌基因组DNA提取；以提取的基因组DNA做为模板，使用引物Fp和Rp，获得gapA基因的启动子PCR片段，长度为977bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® MaxDNA Polymerase kit；以提取的乳酸乳球菌基因组DNA做为模板，使用引物Ft和Rt，获得gapA基因的终止子PCR片段，长度为517bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，35s共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerasekit；PCR结束后，2%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquickGel Extraction Kit；回收的片段分别命名为Pgx和Tgx；
（3）编码表达基因的获得：利用Overlap PCR方式进行编码表达基因PXT的获得；以编码的XylE基因、片段Pgx和片段Tgx做为模板，使用引物Fp和Rt，获得编码表达基因PXT的PCR片段，长度为2940bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；PCR结束后，1%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit；
（4）重组质粒pMG36e-PXT的制备：质粒pMG36e使用HindIII和XbaI进行双酶切后，纯化回收酶切后线型质粒片段，和编码表达基因PXT片段构建重组质粒pMG36e-PXT；构建方法和试剂采用Takara公司的In-Fusion HD Cloning Plus kit；
（5）乳酸乳球菌感受态细胞的制备及转化：
（5.1）将乳酸乳球菌单菌落接入3 mL MRS液体培养基中，37 ℃螺口试管静置培养12h，再按1%的接种量接种至50 mL液体MRS培养基（不含碳酸钙）中，37 ℃螺口试管静置培养至OD660=0.6，冰浴10 min，于4℃、4500 r/min离心7min来收集细胞，去上清，分别用冰浴预冷的1mmol/L MgCl2和300g/L聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）洗涤细胞，最后将细胞重悬于300g/L PEG中，电转化备用；
（5.2）取50μg重组质粒pMG36e-PXT与100μL感受态细胞混匀，冰浴5min后转入冰浴预冷的规格为0.2cm的电转杯中，设置电转参数（12.5 kV/cm，200 Ω）后进行电击，电击完毕后立即加入800μL液体MRS培养基（不含碳酸钙），并在37 ℃静置温育2h，然后取80μL涂布于含50μg/mL红霉素抗性MRS平板（不含碳酸钙），37 ℃厌氧培养48h后含有重组质粒的转化子长出；
（5.3）将挑选出的乳酸乳球菌转化子进行菌落PCR验证阳性菌落。PCR验证条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；引物为Fp和Rt；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit。验证后接种至含50μg/mL红霉素抗性MRS液体培养基（不含碳酸钙）37℃螺口试管静置培养OD660=0.6，加入同等体积的消毒过的20%甘油混匀后放入-80℃冰箱保存；
（6）利用木糖产乳酸效果验证：将-80℃冰箱保存的携带有质粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌和乳酸乳球菌ATCC11454分别置于冰上溶解后，100μL接种于种子培养基10mL，37℃，螺口试管培养16h后5%接种量再次转接至种子培养基200mL，37℃，250mL广口瓶（橡胶塞带无菌空气过滤器）静置培养16h后5%接种量接至5L发酵罐发酵；发酵条件为装液量4L，37℃，120rpm，CO2通气量0.1vvm发酵72h结束，每12h检测木糖残余量和乳酸含量；携带有质粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌在48h产乳酸达到最高值46g/L，木糖残余量2 g/L；乳酸乳球菌ATCC11454在60h产乳酸达到最高值38g/L，木糖残余量5 g/L。
Claims (3)
1.通过表达木糖转运蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法，以大肠杆菌中的木糖转运蛋白基因序列为模板，结合乳酸菌的密码子偏好和RNA的稳定性考量，编码一个全新的适用于乳酸菌的木糖转运蛋白基因序列，在乳酸乳球菌中表达此蛋白来提高利用木糖发酵乳酸效率。
2.根据权利要求1所述的通过表达木糖转运蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法，其特征是该方法包括以下步骤：
（1）配制培养基：将培养基分别配制，并在各个固体培养基配方的基础上分别加20g/L琼脂，培养基灭菌方式为121 ℃，20 min；其中，各个培养基配方如下：
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L；
LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；
乳酸菌种子培养基（MRS）：酪蛋白胨 10g/L，牛肉浸取物 10g/L，酵母提取液 5g/L，葡萄糖 5g/L，乙酸钠 5g/L，柠檬酸二铵 2g/L，吐温80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，一水硫酸锰 0.05g/L，碳酸钙 10g/L；
乳酸发酵培养基：葡萄糖 5g/L，木糖 50g/L，牛肉浸取物 10g/L，酵母提取物 15g/L，磷酸氢二钾2g/L,七水硫酸镁0.6g/L,一水硫酸锰0.1g/L,七水硫酸亚铁 0.2g/L；
（2）编码木糖转运蛋白基因和所需引物的制备：由南京金斯瑞生物科技有限公司制作编码木糖转运蛋白基因XylE，长度为1476bp；由南京金斯瑞生物科技有限公司制作引物序列；其中，Lp启动子引物Fp序列为CCGGGGATCGATCCTCTTCAATGCTCTCCGTAGTCG，Rp序列GTATTGAGTGTTCATGATGTAGTCCTCCGT；Lt终止子引物Ft序列为ACTGCTACTCTTTAAATGGTAGTTAAAGTT，Rt序列CAGACTTTGCAAGCTCATCGGCCATTGGTGCTAAAC；
（3）乳酸乳球菌glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapA）基因的启动子和终止子基因片段的获得：从穿刺试管中挑取一环乳酸乳球菌接种于种子培养基10mL，37℃，螺口试管静置培养至OD660到0.6后，用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit进行乳酸乳球菌基因组DNA提取；以提取的基因组DNA做为模板，使用引物Fp和Rp，获得gapA基因的启动子PCR片段，长度为977bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® MaxDNA Polymerase kit；以提取的乳酸乳球菌基因组DNA做为模板，使用引物Ft和Rt，获得gapA基因的终止子PCR片段，长度为517bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，35s共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerasekit；PCR结束后，2%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquickGel Extraction Kit；回收的片段分别命名为Pgx和Tgx；
（4）编码表达基因的获得：利用Overlap PCR方式进行编码表达基因PXT的获得；以编码的XylE基因、片段Pgx和片段Tgx做为模板，使用引物Fp和Rt，获得编码表达基因PXT的PCR片段，长度为2940bp；PCR扩增条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；PCR结束后，1%琼脂糖胶回收片段，测定浓度；胶回收用的是QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit；
（5）重组质粒pMG36e-PXT的制备：质粒pMG36e使用HindIII和XbaI进行双酶切后，纯化回收酶切后线型质粒片段，和编码表达基因PXT片段构建重组质粒pMG36e-PXT；构建方法和试剂采用Takara公司的In-Fusion HD Cloning Plus kit；
乳酸乳球菌感受态细胞的制备及转化：
（6-1）将乳酸乳球菌单菌落接入3 mL MRS液体培养基中，37 ℃螺口试管静置培养12h，再按1%的接种量接种至50 mL液体MRS培养基（不含碳酸钙）中，37 ℃螺口试管静置培养至OD660=0.6，冰浴10 min，于4℃、4500 r/min离心7min来收集细胞，去上清，分别用冰浴预冷的1mmol/L MgCl2和300g/L聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）洗涤细胞，最后将细胞重悬于300g/L PEG中，电转化备用；
（6-2）取50μg重组质粒pMG36e-PXT与100μL感受态细胞混匀，冰浴5min后转入冰浴预冷的规格为0.2cm的电转杯中，设置电转参数（12.5 kV/cm，200 Ω）后进行电击，电击完毕后立即加入800μL液体MRS培养基（不含碳酸钙），并在37 ℃静置温育2h，然后取80μL涂布于含50μg/mL红霉素抗性MRS平板（不含碳酸钙），37 ℃厌氧培养48h后含有重组质粒的转化子长出；
（6-3）将挑选出的乳酸乳球菌转化子进行菌落PCR验证阳性菌落；PCR验证条件为：50μL反应体系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30个循环；引物为Fp和Rt；使用的是Takara公司的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase kit；验证后接种至含50μg/mL红霉素抗性MRS液体培养基（不含碳酸钙）37℃螺口试管静置培养OD660=0.6，加入同等体积的消毒过的20%甘油混匀后放入-80℃冰箱保存；
（7）利用木糖产乳酸效果验证：将携带有质粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌进行利用木糖产乳酸发酵验证，37℃，发酵72h结束，每12h检测木糖残余量和乳酸含量。
3.根据权利要求1所述的通过表达木糖转运蛋白来提高乳酸乳球菌利用木糖发酵乳酸效率的方法，其特征是：所述编码的木糖转运蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID:1。
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