CN109096376A - 流感病毒ha多肽、klh偶联多肽及多克隆抗体的制备方法 - Google Patents
流感病毒ha多肽、klh偶联多肽及多克隆抗体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一类流感病毒HA多肽及其应用。流感病毒HA多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、3、5、7、9。流感病毒HA蛋白KLH偶联多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2、4、6、8、10。多克隆抗体的制备方法，以SEQ ID NO.2、4、6、8、10中的任意一个作为免疫原，通过免疫小鼠获得抗HA蛋白helix A的C端具有交叉反应的多克隆抗体。本发明可直接提供流感病毒HA蛋白KLH偶联多肽作为免疫原获得抗HA蛋白helix A的C端具有交叉反应的多克隆抗体。本发明将为进一步探究基于C端helix‑A多肽能否作为有效抗原表位，刺激机体产生中和抗体，评价其广谱流感多肽疫苗打下基础，提供了材料。
Description
技术领域
本发明涉及一类流感病毒HA多肽及其应用。
背景技术
疫苗以及抗病毒药物的使用对流感病毒的防控作出了积极贡献。但由于流感病毒抗原的持续变异以及重组病毒的不断出现，时常导致人流感的大流行以及禽流感的爆发，严重影响人类健康以及畜牧业的持续发展。根据流感病毒表面两个主要抗原蛋白HA以及NA的抗原性，目前流感病毒可以分为18个HA以及11个NA亚群。根据HA的结构及其抗原性，18个HA亚群又可进一步归为GROUP1以及GROUP2两大类。值得注意的是，目前流感病毒疫苗均为亚群特异或毒株特异的疫苗，一般只能对相应的特定亚群或毒株提供有效保护，而对其它亚群或毒株往往不能提供有效保护。另外，流感病毒耐药毒株的不断出现也大大限制了抗流感病毒药物的使用。因此，筛选18个HA中的保守中和表位，研制流感病毒广谱通用疫苗一直是流感病毒免疫防控研究中的一大热点。利用单克隆抗体技术，国内外研究发现，这些广谱的流感病毒中和抗原表位位于流感病毒HA的融合肽以及helix-A区域。然而，HA的融合肽以及helix-A区域能否作为流感病毒广谱亚单位疫苗尚无定论。本发明对广谱单抗3A11鉴定的C端helix-A的抗原表位进行了多肽合成，并将KLH偶联的多肽作为免疫原，发现基于流感病毒H9,H7,H3的多肽具有GROUP1与GROUP2交叉反应抗原位点，基于流感病毒H5的多肽仅具有GROUP1不同毒株交叉反应抗原位点；而基于流感病毒H1的相应多肽抗原性最弱。本发明为进一步探究基于C端helix-A多肽能否作为广谱流感多肽疫苗打下了基础，提供了材料。
发明内容
本发明的目的是在于通过对基于不同亚型流感病毒HA的C端helix-A的抗原表位及其KLH偶联多肽的合成，免疫小鼠以及与不同多肽的反应性，获得具有良好交叉广谱反应性的多肽。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计了能被流感病毒广谱单克隆抗体识别的基于不同流感病毒HA的C端helix-A的抗原多肽，并通过免疫小鼠制备多抗，评价其免疫原性。
本发明能被流感病毒广谱单克隆抗体识别的基于不同流感病毒HA的C端helix-A的抗原多肽，包括以下10个多肽序列：
1)H1PEP:YAADLKSTQNAIDEITNKVN；
2)H3PEP:TAADKKSTQAAIDQITGKLN；
3)H5PEP:YAADKESTQKAIDGVTNKVN；
4)H7PEP:TAADYKSTQSAIDQITGKLN；
5)H9PEP:IAADRDSTQRAIDKITSKVN；
6)KLH-H1PEP:KLH-CYAADLKSTQNAIDEITNKVN；
7)KLH-H3PEP:KLH-CTAADKKSTQAAIDQITGKLN；
8)KLH-H5PEP:KLH-CYAADKESTQKAIDGVTNKVN；
9)KLH-H7PEP:KLH-CTAADYKSTQSAIDQITGKLN；
10)KLH-H9PEP:KLH-CIAADRDSTQRAIDKITSKVN；
本发明公开了以上10个基于不同流感病毒HA的C端helix-A的抗原多肽序列。序列1，2，3，4以及5分别基于H1，H3，H5，H7以及H9流感病毒HA的C端helix-A的抗原多肽,序列6，7，8，9以及10分别为相应多肽的KLH偶联多肽。
多肽设计与KLH偶联多肽的合成：根据本研究室前期发现的广谱单抗3A11鉴定的H7N9流感病毒HA2中C端helix-A的抗原表位TAADYKSTQSAIDQITGKLN(362-381位20个氨基酸)，将H1、H3、H5、H7、H9不同流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸进行了多肽合成，同时合成对应偶联KLH的多肽。为了增加氨基酸的免疫原性，在氨基酸序列的N端加了个半胱氨酸。具体多肽序列见附表1，由南京杰肽生物科技有限公司合成。
合成多肽与不同单克隆抗体反应：以合成具有H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸的未偶联多肽包被于ELISA板，以抗H7N9流感病毒HA2蛋白的4个单克隆抗体作为一抗进行ELISA试验(附图1)。
多肽免疫小鼠：将H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸偶联的多肽的通过常规免疫方法进行小鼠的腹腔免疫，制备抗多肽小鼠血清。
抗多肽小鼠血清的反应性：H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸KLH偶联的多肽三免小鼠后的第7天进行小鼠下颌静脉采集血清。以合成具有H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸的未偶联的多肽为抗原，三免小鼠血清为抗体进行ELISA实验，测定抗多肽小鼠血清与各流感病毒HA的C端helix-A的抗原多肽的的反应性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明设计的基于不同流感病毒HA的C端helix-A的抗原多肽序列以及合成的相应的KLH偶联多肽。此发明可直接提供流感病毒HA蛋白KLH偶联多肽作为免疫原获得抗HA蛋白helix A的C端具有流感病毒GROUP1以及GROUP2交叉反应的多克隆抗体。本发明将为进一步探究基于C端helix-A多肽能否作为有效抗原表位，刺激机体产生中和抗体，评价其广谱流感多肽疫苗打下基础，提供了材料，具有一定应用价值。
附图说明
图1不同合成多肽与不同单克隆抗体反应性关系图；
图1中：纵轴为ELISA的OD450的读值，横轴为抗HA2的4个单克隆抗体名称。
图2不同合成多肽与抗多肽小鼠血清反应性关系图；
图2中：纵轴为ELISA的OD450的读值，横轴为抗H1、H3、H5、H7、H9流感病毒的HA基因的C端helix-A偶联多肽的小鼠血清名称。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了流感病毒HA多肽及其应用。
实施例
1)多肽设计与KLH偶联多肽的合成：根据本研究室前期发现的广谱单抗3A11鉴定的H7N9流感病毒HA2中C端helix-A的抗原表位TAADYKSTQSAIDQITGKLN(362-381位20个氨基酸)，将H1、H3、H5、H7、H9不同流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸进行了多肽合成，同时合成对应偶联KLH的多肽。为了增加氨基酸的免疫原性，在氨基酸序列的N端加了个半胱氨酸。具体多肽序列见附表1，由南京杰肽生物科技有限公司合成。
表1流感病毒HA多肽序列
2)合成多肽与不同单克隆抗体反应：以合成具有H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸的未偶联多肽包被于ELISA板，以抗HA2蛋白的4个单克隆抗体作为一抗进行ELISA分析(附图1)。简要步骤如下：将5种合成的HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸未偶联的多肽分别作为抗原，以包被液稀释成0.1ug/孔的浓度包被于ELISA板中，4℃过夜包被；PBST洗涤5遍后，用含1％的小牛血清的5％的脱脂乳于37℃封闭2h；PBST洗涤5遍后，用PBST将单克隆抗体1:500稀释后，100ul每孔作为一抗，37℃反应1h；PBST洗涤5遍后，1:15000稀释的羊抗鼠HRP作为二抗，37℃反应1h；PBST洗涤5遍后，进行显色5分钟，之后加入终止液终止显色，读取OD450吸光值。
ELISA结果表明，单抗1A9能识别H3、H7、H9多肽；单抗1B11能识别H3、H7多肽；1H8能识别H3、H7、H9多肽；单抗3A11同时识别H1、H3、H5、H7、H9五种多肽，但与H5多肽的反应不如H1、H3、H7、H9多肽反应好。
3)多肽免疫小鼠：将H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸KLH偶联的多肽的通过常规免疫方法进行小鼠的腹腔免疫。免疫方法如下：100ug多肽与同体积的弗氏完全佐剂进行乳化后免疫6周龄的BAbL/c小鼠,每种多肽免疫4只小鼠。间隔7天后进行下一次免疫，三免后的第7天进行小鼠下颌静脉的血液采集，分离血清，待下一步试验。
4)抗多肽小鼠血清的反应性：于H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸偶联的多肽三免小鼠后的第7天进行小鼠下颌静脉采集血清。以合成具有H1、H3、H5、H7、H9流感病毒HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸的未偶联的多肽为抗原，三免小鼠血清为一抗进行ELISA分析(附图2)。将5种合成的HA的C端helix-A的362-381位20个氨基酸未偶联的多肽作为抗原，以包被液稀释成0.1ug/孔的浓度包被于ELISA板中，4℃过夜包被；PBST洗涤5遍后，用含1％的小牛血清的5％的脱脂乳于37℃封闭2h；PBST洗涤5遍后，用PBST将采集的抗多肽小鼠血清稀释成1:500的浓度每孔100ul作为一抗，37℃反应1h；PBST洗涤5遍后，1:15000稀释的羊抗鼠HRP作为二抗，37℃反应1h；PBST洗涤5遍后，进行显色5分钟，之后加入终止液终止显色，读取OD450吸光值。
ELISA结果分析发现：H1多肽的免疫原性较差。H3多肽免疫原性较好，且抗H3多肽的小鼠血清不与H5反应，而与H1、H3、H7、H9多肽反应；其中与H1、H9多肽的反应不如与H3、H7多肽反应好。H5多肽免疫原性较好，且抗H5多肽的小鼠血清与H1、H5、H9多肽反应较好，不与H3、H7多肽反应。H7多肽免疫原性较好，且抗H7多肽的小鼠血清不与H5反应，而与H1、H3、H7、H9多肽反应；其中与H9多肽的反应不如与H1、H3、H7多肽反应好。H9多肽免疫原性较好，且抗H9多肽的小鼠血清不与H5反应，而与H1、H3、H7、H9多肽反应；其中与H1多肽的反应不如与H3、H7、H9多肽反应好。
因此，以上基于流感病毒H9,H7,H3的多肽具有GROUP1与GROUP2交叉反应抗原位点，基于流感病毒H5的多肽仅具有GROUP1不同毒株交叉反应抗原位点；而基于流感病毒H1的相应多肽抗原性最弱。
<110> 扬州大学
<120> 流感病毒HA多肽、KLH偶联多肽及多克隆抗体的制备方法
<160> 10
SEQ ID NO.1
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala IIe Asp Glu IIe
1 5 10 15
Thr Asn Lys Val Asn
20
SEQ ID NO.2
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Cys Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala IIe Asp Glu
1 5 10 15
IIe Thr Asn Lys Val Asn
20
SEQ ID NO.3
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Thr Ala Ala Asp Lys Lys Ser Thr Gln Ala Ala IIe Asp Gln IIe
1 5 10 15
Thr Gly Lys Leu Asn
20
SEQ ID NO.4
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Cys Thr Ala Ala Asp Lys Lys Ser Thr Gln Ala Ala IIe Asp Gln
1 5 10 15
IIe Thr Gly Lys Leu Asn
20
SEQ ID NO.5
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala IIe Asp Gly Val
1 5 10 15
Thr Asn Lys Val Asn
20
SEQ ID NO.6
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Cys Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala IIe Asp Gly
1 5 10 15
Val Thr Asn Lys Val Asn
20
SEQ ID NO.7
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala IIe Asp Gln IIe
1 5 10 15
Thr Gly Lys Leu Asn
20
SEQ ID NO.8
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Cys Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala IIe Asp Gln
1 5 10 15
IIe Thr Gly Lys Leu Asn
20
SEQ ID NO.9
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
IIe Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Arg Ala IIe Asp Lys IIe
1 5 10 15
Thr Ser Lys Val Asn
20
SEQ ID NO.10
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Cys IIe Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Arg Ala IIe Asp Lys
1 5 10 15
IIe Thr Ser Lys Val Asn
20
Claims (3)
1.流感病毒HA多肽，包括：
H1PEP:YAADLKSTQNAIDEITNKVN；或者
H3PEP:TAADKKSTQAAIDQITGKLN；或者
H5PEP:YAADKESTQKAIDGVTNKVN；或者
H7PEP:TAADYKSTQSAIDQITGKLN；或者
H9PEP:IAADRDSTQRAIDKITSKVN。
2. 流感病毒HA蛋白KLH偶联多肽，包括：
KLH-H1PEP:KLH-CYAADLKSTQNAIDEITNKVN；或者
KLH-H3PEP:KLH-CTAADKKSTQAAIDQITGKLN；或者
KLH-H5PEP:KLH-CYAADKESTQKAIDGVTNKVN；或者
KLH-H7PEP:KLH-CTAADYKSTQSAIDQITGKLN；或者
KLH-H9PEP:KLH-CIAADRDSTQRAIDKITSKVN。
3. 多克隆抗体的制备方法，以权利要求2所述的流感病毒HA蛋白KLH偶联多肽中的任意一个作为免疫原，通过免疫小鼠获得抗HA蛋白helix A的C端具有交叉反应的多克隆抗体。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101879312A (zh) * | 2010-06-11 | 2010-11-10 | 北京精益泰翔技术发展有限公司 | 广谱型流感疫苗及其制备方法 |
| US20120014972A1 (en) * | 2010-01-26 | 2012-01-19 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Influenza virus compositions and methods for universal vaccines |
| CN102397559A (zh) * | 2010-06-11 | 2012-04-04 | 北京精益泰翔技术发展有限公司 | 广谱型流感疫苗及其制备方法 |
| WO2012082803A2 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | Cel-Sci Corporation | Method for inducing an immune response against avian, swine, spanish, h1n1, h5n9 influenza viruses and formulations thereof |
| WO2012162564A1 (en) * | 2011-05-25 | 2012-11-29 | Cel-Sci Corporation | Method for inducing an immune response and formulations thereof |
| CN103458922A (zh) * | 2011-01-31 | 2013-12-18 | 巴克斯特国际公司 | 诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法 |
| CN104151403A (zh) * | 2013-04-08 | 2014-11-19 | 中国医学科学院药物研究所 | 一类多肽或其衍生物、及其在流感病毒感染中的应用 |
| CN104250304A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种融合蛋白及其编码的疫苗组合物与应用 |
| WO2016120412A1 (en) * | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Institut Pasteur | Rna virus attenuation by alteration of mutational robustness and sequence space |
| CN108164602A (zh) * | 2011-09-20 | 2018-06-15 | 西奈山医学院 | 流感病毒疫苗及其应用 |
-
2018
- 2018-09-20 CN CN201811100656.5A patent/CN109096376A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120014972A1 (en) * | 2010-01-26 | 2012-01-19 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Influenza virus compositions and methods for universal vaccines |
| CN101879312A (zh) * | 2010-06-11 | 2010-11-10 | 北京精益泰翔技术发展有限公司 | 广谱型流感疫苗及其制备方法 |
| CN102397559A (zh) * | 2010-06-11 | 2012-04-04 | 北京精益泰翔技术发展有限公司 | 广谱型流感疫苗及其制备方法 |
| WO2012082803A2 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | Cel-Sci Corporation | Method for inducing an immune response against avian, swine, spanish, h1n1, h5n9 influenza viruses and formulations thereof |
| CN103458922A (zh) * | 2011-01-31 | 2013-12-18 | 巴克斯特国际公司 | 诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法 |
| WO2012162564A1 (en) * | 2011-05-25 | 2012-11-29 | Cel-Sci Corporation | Method for inducing an immune response and formulations thereof |
| CN108164602A (zh) * | 2011-09-20 | 2018-06-15 | 西奈山医学院 | 流感病毒疫苗及其应用 |
| CN104151403A (zh) * | 2013-04-08 | 2014-11-19 | 中国医学科学院药物研究所 | 一类多肽或其衍生物、及其在流感病毒感染中的应用 |
| CN104250304A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种融合蛋白及其编码的疫苗组合物与应用 |
| WO2016120412A1 (en) * | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Institut Pasteur | Rna virus attenuation by alteration of mutational robustness and sequence space |
| US20180008689A1 (en) * | 2015-01-28 | 2018-01-11 | Institut Pasteur | Rna virus attenuation by alteration of mutational robustness and sequence space |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| SAI V. VEMULA等: "Vaccine approaches conferring cross-protection against influenza viruses", 《EXPERT REV VACCINES》 * |
| ZHANPING LI等: "A novel linear epitope crossing Group 1 and Group 2 influenza A viruses located in the helix A of HA2 derived from H7N9", 《VETERINARY MICROBIOLOGY》 * |
| 李占萍: "A型流感病毒HA融合肽+helix A线***叉抗原表位鉴定及其重组病毒构建", 《中国知网》 * |
| 杨新燕等: "基于流感病毒血凝素茎部结构域的通用疫苗研究进展", 《医学研究杂志》 * |
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