CN109085696A - 活体细胞批量转移板及其制备方法 - Google Patents

Abstract

活体细胞批量转移板及其制备方法，涉及细胞生物学和水生生物学。所述活体细胞批量转移板设有不锈钢片和玻璃片，所述不锈钢片垂直叠加于玻璃片之上，不锈钢片与玻璃片之间粘合。选取不锈钢片，选择带有计算机数控装置的激光切割机，拷贝切割数据到电脑，进行激光氧气切割，切割完成后，清除毛刺，打磨切口；将石英玻璃片平放于透光板上，A型不锈钢片不分正反面，B型不锈钢片的方形工作区划线面朝上放置，将AB胶混匀后，将AB胶涂抹在不锈钢片上，然后垂直叠放在石英玻璃片上，挤压，对齐，等AB胶完全固化之后，刮掉侧面多余的胶，然后清除圆孔和正方形工作区因挤压溢出的胶，打磨不锈钢片，抛光，清除粉末，制得活体细胞批量转移板。

Description

活体细胞批量转移板及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学和水生生物学，尤其是涉及浮游生物学领域，如：浮游生物筛选、纯化培养、种类鉴定、生物饵料育种、能源藻类筛选、沉积物包囊研究等等，具体涉及活体细胞批量转移板及其制备方法。

背景技术

科研工作者在浮游生物研究中，常常涉及到活体细胞筛选、清洗、转移和细胞图像采集等环节，其中，在活体细胞初步筛选过程中，因样品和细胞表面粘附有杂质(泥沙、沉积物碎屑、个体相对较小的非目的细胞和细菌等)，需要进行细胞清洗以保持细胞相对纯净，通常是选择水滴法操作，即在载玻片上滴几滴无菌水备用，在显微镜视野下，用毛细管从细胞分离框中吸取细胞，然后把细胞转移至水滴，反复几次，实现细胞的洁净；同时，针对珍稀、培养困难的细胞进行显微图像采集，如沉积物包囊研究工作中，包囊萌发，初始只有1个细胞。为了观察包囊萌发过程，亦是采取水滴法，把细胞转移到水滴中，等图像采集完成后，将细胞转移回96孔板继续培养。

水滴分离法是一种较传统的细胞分选、清洗和转移方法。该方法操作简单、便捷，为广大浮游生物研究者熟练掌握。水滴是透明的光介质，在空气中由于表面张力的作用呈椭圆体(在无重力场中呈球体)，表面为曲面。水滴法操作，水滴的体积可以由移液器确定，但水滴与载玻片接触面积和水滴厚度受到载玻片材质、洁净等级，甚至干燥程度等因素影响，通常无法掌控。另外，有些细胞在水滴里会不断游动，甚至游到水滴边缘，静止不动，在显微镜视野下极难寻找，容易丢失。同时，图像采集时，细胞图像有时会出现变形，失真。另外，载玻片一般不需灭菌，直接使用，容易带入外源细菌，增加了细胞培养的难度。以上这些问题，都给浮游生物研究者，尤其是浮游植物研究者，造成了一定的困扰。

发明内容

本发明的目的在于提供活体细胞批量转移板及其制备方法。

所述活体细胞批量转移板设有不锈钢片和玻璃片，所述不锈钢片垂直叠加于玻璃片之上，不锈钢片与玻璃片之间粘合。

所述不锈钢片可为带圆孔316不锈钢片，所述玻璃片可采用超白高透石英玻璃片，所述粘合可采用耐温AB胶无缝粘合；所述不锈钢片的规格可为长63.94mm，宽25.26mm，厚1mm；所述玻璃片的规格可为长75.90mm，宽25.30mm，厚0.8mm；所述AB胶可采用LEAFTOP/蓝田9940耐温AB胶；所述不锈钢片的圆孔直径可分别为5～9mm；

所述不锈钢片上的圆孔可分为A型不锈钢片和B型不锈钢片，所述A型不锈钢片可根据圆孔的直径不同，分为5种，分别标记为A1～A5；所述B型不锈钢片在A型不锈钢片的基础上，圆孔的中央位置增加一个方形工作区(20mm×20mm)，即：不锈钢片正中位置切割出一个20mm×20mm的正方形镂空，与之相对应的玻璃片区域(20mm×20mm)，采用划线蚀刻法加工，线宽20μm，线距2mm，均分成100小格，根据圆孔的直径不同，亦分为5种，分别标记为B1～B5。

所述活体细胞批量转移板的制备方法包括以下步骤：

1)不锈钢片加工：选取不锈钢片，选择带有计算机数控装置的激光切割机，拷贝切割数据到电脑，进行激光氧气切割，切割完成后，清除毛刺，打磨切口；

在步骤1)中，所述不锈钢片可采用厚度为1mm的316不锈钢片；所述激光氧气切割可采用德国通快TruLaser 3030；所述清除毛刺可采用金刚石锉刀清除毛刺；所述打磨切口可采用400目碳化硅砂纸打磨切口，所述切口可采用2000目砂纸抛光。

2)石英玻璃片加工：将石英玻璃片导入切割数据到电脑，进行激光切割；

在步骤2)中，所述石英玻璃片可采用厚度为0.8mm的石英玻璃片；所述激光切割可在B型不锈钢片的方形工作区(20mm×20mm)采用划线蚀刻法加工，线宽20μm，线距2mm,均分为100小格。

3)无缝粘合：将石英玻璃片平放于透光板上，A型不锈钢片不分正反面，B型不锈钢片的方形工作区划线面朝上放置，将AB胶混匀后，将AB胶涂抹在不锈钢片上，然后垂直叠放在石英玻璃片上，挤压，对齐，翻转检查背面有无气泡和缝隙，如果有气泡，滑动不锈钢片，挤压掉气泡；如果有缝隙，将不锈钢片和石英玻璃片分离，重新打胶；B型不锈钢片粘合须在体视显微镜或放大镜下操作，使不锈钢正方形镂空与石英玻玻璃片划线区域对齐，再无缝粘合；

在步骤3)中，所述AB胶混匀可采用蓝田9940耐温AB胶混匀。

4)修整：等AB胶完全固化之后，刮掉侧面多余的胶，然后清除圆孔和正方形工作区因挤压溢出的胶，打磨不锈钢片，抛光，清除粉末，制得活体细胞批量转移板。

在步骤4)中，所述刮掉侧面多余的胶可采用美工刀刮掉侧面多余的胶；所述打磨不锈钢片可采用400目碳化硅砂纸打磨不锈钢片；所述抛光可采用2000目砂纸抛光；所述清除粉末可采用棉签沾70％酒精擦拭不锈钢片以清除掉粉末，其中，B型正方形工作区的清理要在体视显微镜或者放大镜下进行，刀片倾斜玻璃面操作，避免划伤玻璃表面和工作区的划线。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

本发明所制备的活体细胞批量转移板，作为传统方法—水滴法的工具替代，设计成不同容量的加样孔(20，30，40，50，60μL)，根据需要，可以选用不同容量的转移板。加入无菌水到加样孔，液体将均匀分布到加样孔，形成了固定的液体深度，明显降低液体表面曲度，可以有效解决显微镜下细胞难定位，细胞清洗过程中易丢失等问题，图像采集时可最大程度呈现细胞真实形态。同时降低水分蒸发速度，给科研工作者更长的操作时间。

B型不锈钢片在A型不锈钢片的基础上，中央增加了一个方形划线工作区。这种设计便于研究者在显微镜下操作，可根据划线方格定位，快捷抓取细胞的同时，不需要频繁更换细胞分离框和转移板，从而节省时间和精力。同时，B型也可以作为细胞计数框单独使用。

本发明选取316不锈钢材质，性能稳定，耐高温，可耐低浓度酸碱、海水腐蚀；超白高透石英玻璃片，透光性好，跟普通载玻片相比，时间长之后不会变色泛黄，大大增加了使用寿命；9940耐温AB胶，耐高温、耐水、耐油、耐酸碱及溶剂和化学品。因此本发明可以整体高压灭菌，从而有效减少使用过程中的外源细菌污染。

另外，本发明外规格与市场上主流载玻片规格一致，适合大多数带凹槽、卡槽和压片夹的显微镜配套使用。

附图说明

图1为本发明所述活体细胞批量转移板实施例的结构示意图。

图2为超白高透石英玻璃片示意图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

参见图1和2，所述活体细胞批量转移板实施例设有不锈钢片和玻璃片，所述不锈钢片垂直叠加于玻璃片之上，不锈钢片与玻璃片之间粘合。

所述不锈钢片可为带圆孔316不锈钢片，所述玻璃片可采用超白高透石英玻璃片，所述粘合可采用耐温AB胶无缝粘合；所述不锈钢片的规格可为长63.94mm，宽25.26mm，厚1mm；所述玻璃片的规格可为长75.90mm，宽25.30mm，厚0.8mm；所述AB胶可采用LEAFTOP/蓝田9940耐温AB胶；所述不锈钢片的圆孔直径可分别为5、6、7、8、9mm；

所述不锈钢片上的圆孔可分为A型不锈钢片和B型不锈钢片，所述A型不锈钢片可根据圆孔的直径不同，分为5种，分别标记为A1～A5；所述B型不锈钢片在A型不锈钢片的基础上，圆孔的中央位置增加了一个方形工作区(20mm×20mm)，即：不锈钢片正中位置切割出一个20mm×20mm的正方形镂空，与之相对应的玻璃片区域(20mm×20mm)，采用划线蚀刻法加工，线宽20μm，线距2mm，均分成100小格，根据圆孔的直径不同，亦分为5种，分别标记为B1～B5。

所述活体细胞批量转移板的制备方法包括以下步骤：

1)不锈钢片加工：选取不锈钢片，选择带有计算机数控装置的激光切割机器，拷贝切割数据到电脑，进行激光氧气切割，切割完成后，清除毛刺，打磨切口；所述不锈钢片可采用厚度为1mm的316不锈钢片；所述激光氧气切割可采用德国通快TruLaser 3030；所述清除毛刺可采用金刚石锉刀清除毛刺；所述打磨切口可采用400目碳化硅砂纸打磨切口，所述切口可采用2000目砂纸抛光。

2)石英玻璃片加工：将石英玻璃片导入切割数据到电脑，进行激光切割；所述石英玻璃片可采用厚度为0.8mm的石英玻璃片；所述激光切割可在B型不锈钢片的方形工作区(20mm×20mm)采用划线蚀刻法加工，线宽20μm，线距2mm,均分为100小格。

3)无缝粘合：将石英玻璃片平放于透光板上，A型不锈钢片不分正反面，B型不锈钢片的方形工作区划线面朝上放置，将AB胶混匀后，将AB胶涂抹在不锈钢片上，然后垂直叠放在石英玻璃片上，挤压，对齐，翻转检查背面有无气泡和缝隙，如果有气泡，滑动不锈钢片，挤压掉气泡；如果有缝隙，将不锈钢片和石英玻璃片分离，重新打胶；B型不锈钢片粘合须在体视显微镜或放大镜下操作，使不锈钢正方形镂空与石英玻玻璃片划线区域对齐，再无缝粘合；所述AB胶混匀可采用蓝田9940耐温AB胶混匀。

4)修整：等AB胶完全固化之后，刮掉侧面多余的胶，然后清除圆孔和正方形工作区因挤压溢出的胶，打磨不锈钢片，抛光，清除粉末，制得活体细胞批量转移板。所述刮掉侧面多余的胶可采用美工刀刮掉侧面多余的胶；所述打磨不锈钢片可采用400目碳化硅砂纸打磨不锈钢片；所述抛光可采用2000目砂纸抛光；所述清除粉末可采用棉签沾70％酒精擦拭不锈钢片以清除掉粉末，其中，B款正方形工作区的清理要在体视显微镜或者放大镜下进行，刀片倾斜玻璃面操作，避免划伤玻璃表面和工作区的划线。

以下给出本发明的测试与验收：

按照设计图，直径5、6、7、8、9mm的圆孔，加上AB胶粘合后的厚度，圆孔容量分别为：20，30，40，50，60μL，用移液器分别加水测试，水不溢出圆孔，不流入相邻圆孔，打胶部位无水渍，显微镜下观察圆孔和B型不锈钢片划线区玻璃表面无损伤，用纱布包裹，121℃高压灭菌30min，不锈钢片与玻璃片依旧粘合牢固，即为合格。

Claims (10)

1.活体细胞批量转移板，其特征在于设有不锈钢片和玻璃片，所述不锈钢片垂直叠加于玻璃片上，不锈钢片与玻璃片之间粘合。

2.如权利要求1所述活体细胞批量转移板，其特征在于所述不锈钢片为带圆孔316不锈钢片，所述玻璃片采用石英玻璃片，所述粘合采用耐温AB胶无缝粘合；所述不锈钢片的规格为长63.94mm，宽25.26mm，厚1mm；所述玻璃片的规格为长75.90mm，宽25.30mm，厚0.8mm；所述不锈钢片的圆孔直径分别为5～9mm。

3.如权利要求1所述活体细胞批量转移板，其特征在于所述不锈钢片上的圆孔分为A型不锈钢片和B型不锈钢片，所述A型不锈钢片根据圆孔的直径不同，分为5种，分别标记为A1～A5；所述B型不锈钢片在A型不锈钢片的基础上，圆孔的中央位置增加一个方形工作区为20mm×20mm，与相对应的玻璃片区域为20mm×20mm，采用划线蚀刻法加工，线宽20μm，线距2mm，均分成100小格，根据圆孔的直径不同，亦分为5种，分别标记为B1～B5。

4.如权利要求1～3所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)不锈钢片加工：选取不锈钢片，选择带有计算机数控装置的激光切割机，拷贝切割数据到电脑，进行激光氧气切割，切割完成后，清除毛刺，打磨切口；

2)石英玻璃片加工：将石英玻璃片导入切割数据到电脑，进行激光切割；

3)无缝粘合：将石英玻璃片平放于透光板上，A型不锈钢片不分正反面，B型不锈钢片的方形工作区划线面朝上放置，将AB胶混匀后，将AB胶涂抹在不锈钢片上，然后垂直叠放在石英玻璃片上，挤压，对齐，翻转检查背面有无气泡和缝隙，如果有气泡，滑动不锈钢片，挤压掉气泡；如果有缝隙，将不锈钢片和石英玻璃片分离，重新打胶；B型不锈钢片粘合须在体视显微镜或放大镜下操作，使不锈钢正方形镂空与石英玻玻璃片划线区域对齐，再无缝粘合；

4)修整：AB胶完全固化后，刮掉侧面多余的胶，然后清除圆孔和正方形工作区因挤压溢出的胶，打磨不锈钢片，抛光，清除粉末，制得活体细胞批量转移板。

5.如权利要求4所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述不锈钢片采用厚度为1mm的316不锈钢片；所述激光氧气切割采用德国通快TruLaser3030。

6.如权利要求4所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述清除毛刺采用金刚石锉刀清除毛刺。

7.如权利要求4所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述打磨切口采用400目碳化硅砂纸打磨切口，所述切口采用2000目砂纸抛光。

8.如权利要求4所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述石英玻璃片采用厚度为0.8mm的石英玻璃片；所述激光切割在B型不锈钢片的方形工作区20mm×20mm采用划线蚀刻法加工，线宽20μm，线距2mm,均分为100小格。

9.如权利要求4所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述AB胶混匀采用蓝田9940耐温AB胶混匀。

10.如权利要求4所述活体细胞批量转移板的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述刮掉侧面多余的胶采用美工刀刮掉侧面多余的胶；所述打磨不锈钢片采用400目碳化硅砂纸打磨不锈钢片；所述抛光采用2000目砂纸抛光；所述清除粉末采用棉签沾70％酒精擦拭不锈钢片以清除掉粉末，其中，B型正方形工作区的清理要在体视显微镜或者放大镜下进行，刀片倾斜玻璃面操作，避免划伤玻璃表面和工作区的划线。