CN109082407A - 一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，包括DMEM基础培养基和添加剂，所述添加剂包括转铁蛋白、胰岛素、***钠、抗坏血酸、脯氨酸、***和转化生长银子2型。本发明能够让间充质干细胞在立体空间形成三维类软骨球，不需要额外添加载体或设备。

Description

一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基
发明领域
本发明涉及用于间充质干细胞定向分化为三维软骨球体的诱导培养基。
背景技术
干细胞研究是目前生物医学行业最热门的方向之一；干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成为多种功能性细胞。根据干细胞所在的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于胚胎干细胞涉及道德伦理的问题，所以在研究和应用上大家多选择成体干细胞。成体干细胞多分为间充质干细胞，其来源丰富，动物体的骨髓、脂肪、皮肤、甚至牙髓等组织均可提取；其分化能力也很强，在特定条件下具备良好的单方向分化能力，因而在再生医学上应用广泛。
间充质干细胞在特定条件下可以分化为软骨细胞或者软骨前体细胞，常规的多方向诱导均在二维平面空间进行，而在平面诱导软骨细胞的过程中，由于细胞骨化而导致细胞贴壁性下降，细胞整片脱落；细胞脱落则直接导致诱导失败。本发明可在三维空间进行，则直接解决因为细胞脱落而造成的失败，其次，高密度的细胞球也在模拟体内软骨发育的过程，细胞之间的紧密粘附和生长有利于细胞之间的信号传递，也利于细胞外基质的分泌，更容易形成组织微环境。
本发明避开干细胞在平面生长诱导的情况，将细胞设计在无菌试剂管中立体培养；更佳的，为了避免胎牛血清对于细胞的促贴壁生长的作用，在培养基主体的选择上选择了无血清的体系，在无血清的培养基体系中，更需要注重细胞生长蛋白的优化，为了达到蛋白混合液可支撑细胞球体生长，但不至于疯狂长大影响诱导结果，本发明选择转铁蛋白-胰岛素-***钠混合蛋白液，明确培养体系中蛋白质的结构，减少实验的影响因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维的间充质干细胞定向分化为软骨球体的诱导分化培养基。
本发明所采取的技术方案是：
一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，采用基础细胞培养基，含有0.1-5％的蛋白混合物，50-500μM 的抗坏血酸，0.8-8mM的脯氨酸，50-500nM的有机刺激剂***，以及提供信号通常方向的5-50ng/ml 的转化生长因子2型。
优选的，蛋白混合物中包含0.1-2mg/mL的转铁蛋白、0.1-1mg/mL的胰岛素和0.1-2μg/mL***钠。
优选的，基础培养基中包含一种或多种无机盐、氨基酸、维生素、抗生素和能量源等。
附图说明
图1是人间充质干细胞三维诱导成软骨球；
图2是人间充质干细胞软骨球切片阿利新蓝染色图；
图3是兔间充质干细胞成软骨切片阿利新蓝染色图；
图4是大鼠间充质干细胞成软骨切片阿利新蓝染色图；
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面结合具体实施例做进一步说明。
实例1：
一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，包含0.67mg/ml的转铁蛋白、0.67mg/ml的胰岛素、0.67μg/ml 的***钠、200μM的抗坏血酸、4mM的脯氨酸、80nM的***、2ng/ml的转化生长因子2型，余量为含1.2g/L葡萄糖的DMEM基础培养基。培养基应用于第五代的人骨髓间充质干细胞上，在15mL容量的试剂管中培养，培养环境的二氧化碳浓度为4％；细胞在24小时内形成微小球体，在培养30天后形成有弹性的类软骨球，进行石蜡切片后使用阿利新蓝染料染色，软骨细胞特异分泌的硫酸软骨素、硫酸胶质等蛋白可被染上蓝色，结果呈阳性。
实例2：
一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，包含0.8mg/ml的转铁蛋白、0.7mg/ml的胰岛素、1.2μg/ml的***钠、300μM的抗坏血酸、4mM的脯氨酸、100nM的***、5ng/ml的转化生长因子2型，余量为含4.5g/L葡萄糖的DMEM基础培养基。培养基应用于第七代的兔子骨髓间充质干细胞上，在15mL容量试剂管中培养，培养环境的二氧化碳浓度为5％；细胞集落在24小时内形成微小球体，在培养24天可形成有弹性的类软骨球，进行石蜡切片后使用阿利新蓝染料染色，软骨细胞特异分泌的硫酸软骨素、硫酸胶质等蛋白可被染上蓝色，结果呈阳性。
实例3：
一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，包含1mg/ml的转铁蛋白、0.5mg/ml的胰岛素、0.7μg/ml的***钠、300μM的抗坏血酸、6mM的脯氨酸、120nM的***、10ng/ml的转化生长因子2型，余量为含4.5g/L葡萄糖的DMEM基础培养基。培养基应用于第十代的大鼠骨髓间充质干细胞上，在15mL容量试剂管中培养，培养环境的二氧化碳浓度为5％；细胞集落在24小时内形成微小球体，在培养28天可形成有弹性的类软骨球，进行石蜡切片后使用阿利新蓝染料染色，软骨细胞特异分泌的硫酸软骨素、硫酸胶质等蛋白可被染上蓝色，结果呈阳性。

Claims (20)

1.一种应用于间充质干细胞在立体空间成软骨诱导分化培养基，其包含0.1-5％的蛋白混合物、50-500μM抗坏血酸、0.8-8mM脯氨酸、50-500nM***和5-50ng/mL转化生长因子2型。
2.根据权利要求1所述的诱导分化培养基，其中蛋白混合物包含0.1-2mg/mL的转铁蛋白、0.1-1mg/mL的胰岛素和0.1-2μg/mL***钠。
3.根据权利要求1-2所述的诱导分化培养基，其中蛋白混合物中的转铁蛋白浓度为约0.1mg/mL至约2mg/mL，如约1mg/mL。
4.根据权利要求1-2所述的诱导分化培养基，其中蛋白混合物中的胰岛素浓度为约0.1mg/mL至约1mg/mL，如约0.5mg/mL。
5.根据权利要求1-2所述的诱导分化培养基，其中蛋白混合物中的***钠浓度为约0.1μg/mL至约1μg/mL，如约0.7μg/mL。
6.根据权利要求1所述的诱导分化培养基，其中抗坏血酸的浓度为约50μM至约500μM，如约300μM。
7.根据权利要求1所述的诱导分化培养基，其中脯氨酸的浓度为约0.8mM至约8mM，如约4mM。
8.根据权利要求1所述的诱导分化培养基，其中***的浓度为约50nM至约500nM，如约100nM。
9.根据权利要求1所述的诱导分化培养基，其中转化生长因子2型为约5ng/mL至约50ng/mL，如约10ng/mL。
10.根据前述权利要求中任一项的培养基，其中所述培养基还含以下一种或多种：无机盐、氨基酸、维生素、抗生素和能量源等。
11.间充质干细胞往成软骨方向诱导的方法，所述方法包括在根据权利要求1-10中任一项的培养基诱导处理间充质干细胞。
12.在体外三维培养间充质干细胞诱导为软骨，能容纳高密度细胞群落，模拟胚胎体内软骨发育的过程，细胞外基质也可良好地固定在细胞群外，增强细胞之间的粘附和增殖，三维软骨形式所述方法，包括在根据权利要求1-10中任一项的培养基培养和诱导分化间充质干细胞。
13.根据权利要求2-5所述的诱导分化培养基的用途，可在体外提供间充质干细胞所需的营养，在无血清的条件下改善其生长速率，并改善细胞凋亡的程度。
14.根据权利要求6-7所述的诱导分化培养基的用途，可促进细胞分泌的基质有机排列和组合，改善内外源活性因子的传递，改善活性物质的储存和***。
15.根据权利要求6-7所述的诱导分化培养基的用途，促进细胞间的密切接触，促进自分泌和旁分泌作用，促进细胞发生转化。
16.根据权利要求8-9所述的诱导分化培养基的用途，促进未分化干细胞进行分化，促进软骨细胞基质的合成和分泌，促进软骨前体细胞的凝聚。
17.根据权利要求10所述的诱导分化培养基的用途，提供细胞培养的基础营养，促进权利要求2-9所述诱导分化培养基的效率。
18.根据权利要求11-17所述的诱导分化培养基的方法或用途，其中所述间充质干细胞为哺乳类动物间充质干细胞，如人、兔子和大鼠等。
19.根据权利要求11-17所述的诱导分化培养基的方法或用途，其中所述间充质干细胞可来源于动物体的骨髓、脂肪、牙髓和皮肤等，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、表皮干细胞等。
20.根据权利要求11-17所述的诱导分化培养基的方法或用途，其中所述间充质干细胞在具有5-10％之间的二氧化碳含量的环境下处理和/或培养所述间充质干细胞。
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