CN109069574A

CN109069574A - 用于治疗黑色素瘤的方法和组合物

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Publication number: CN109069574A
Application number: CN201780024075.5A
Authority: CN
Inventors: R·索马斯达拉姆; M·赫林; D·赫林
Original assignee: Study On Anatomy And Biology Of Wistar
Current assignee: Study On Anatomy And Biology Of Wistar; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2018-12-21
Also published as: US20190276517A1; EP3416668A1; WO2017142988A1; US20220177548A1; EP3416668A4; US11208468B2

Abstract

提供了用于治疗黑色素瘤的组合物和方法。组合物包括单独的基于BRAF_V600E的肽或其与T辅助肽混合的肽。其他组合物包括单独的编码基于BRAF_V600E的肽的核酸序列或其与T辅助肽的核酸序列混合。还提供了用单独的基于BRAF_V600E的肽或其与T辅助肽混合的肽预处理的树突细胞。这些组合物对治疗黑色素瘤有效，任选地与检查点抑制剂的抗体或模拟这种抗体作用的分子共同施用。

Description

用于治疗黑色素瘤的方法和组合物

政府利益声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号P01 CA114046和P30 CA010815的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

以电子形式提交的材料通过引用并入

申请人在此通过引用并入以电子形式提交的序列表材料。此文件标记为“WST163PCT_ST25.txt”，日期为2017年2月15日，大小为22KB。

背景技术

BRAF是一种在黑色素瘤中经常表达的细胞内信号蛋白，其中在70％的黑色素瘤、大多数类型的痣，和少数其他癌症，包括肺癌、结肠癌和卵巢癌中，其等位基因被鉴定为体细胞突变，而在正常细胞中并非如此。BRAF突变位于外显子11或15中，BRAF_V600E代表黑色素瘤中几乎所有(92％)的BRAF等位基因。BRAF_V600E通过激活MAP激酶途径具有致癌活性。

美国专利号7,811,993中鉴定了诱导MHC I类、HLA-A2依赖性细胞毒性T细胞应答的某些基于BRAF_V600E的肽，其通过引用并入本文。这些基于BRAF_V600E的肽是根据BRAFV600E序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸597至606位设计的，用于黑色素瘤的预防性和治疗性治疗。更具体地说，其中描述的组合物对诱导非患者特异性的应答有效，但所有黑色素瘤患者中约70％发生的突变具有特异性。

然而，本领域仍然需要有效治疗、预防和诊断大多数患者中的黑色素瘤的另外的药物组合物和方法。

发明内容

在一方面，组合物包含基于BRAF_V600E的肽，其诱导MHC I类，HLA-A2依赖性细胞毒性T细胞应答肽，或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，这个组合物包含如本文所述的式II、III或IV的肽。

在另一方面，组合物包含基于BRAF_V600E的肽，包含下文所述的式I、II、III或IV的肽，其诱导MHC I类，HLA-A2依赖性细胞毒性T细胞应答和T辅助肽。

在另一方面，本文所述的组合物还包含结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。

在一方面，组合物包含编码如下所述的式II、III或IV的基于BRAF_V600E的肽的核酸序列。

在另一方面，组合物包含编码下面的式I、II、III或IV的基于BRAF_V600E的肽的核酸序列，其诱导MHC I类、HLA-A2依赖性细胞毒性T细胞应答和编码T辅助序列的核酸序列。

在另一方面，本文所述的含所述核酸序列的组合物还包含核酸序列，该核酸序列编码检查点抑制剂，或结合检查点抑制剂的抗体，或模拟检查点抑制剂功能的分子。

在另一方面，组合物包含重组树突细胞，其用含有下述物质的组合物离体预处理：如本文所述的基于BRAF_V600E的肽，任选的T辅助肽和/或任选的结合检查点抑制剂的抗体或任选的模拟检查点抑制剂功能的分子。

在另一方面，重组树突细胞被组合物离体预处理，该组合物含有编码如本文所述的基于BRAF_V600E的肽的核酸序列，任选地包括编码T辅助肽和/或结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子核酸序列。

在另一方面，组合物包含适于同时施用的制剂形式的本文所述的预处理的树突细胞和结合检查点抑制剂的抗体。

在另一方面，提供了如本文所述的组合物，用于治疗或预防哺乳动物受试者的黑色素瘤。

在另一方面，在哺乳动物受试者中治疗或延缓或预防癌症，特别是黑色素瘤的发展的方法，包括向所述受试者施用一个或多个如本文所述的组合物。

在以下优选实施方案的详细描述中进一步描述了这些组合物和方法的其他方面和优点。

附图说明

图1显示了来自BRAF_V600E序列的肽对标记为WM35、WM3457和3451的三个不同黑色素瘤外周血单核细胞(PBMC)样品的增殖测定结果的三张图。筛选肽的T辅助序列(Th)：肽P8是BRAF的氨基酸残基608-622，即SHQFEQLSGSILWHA SEQ ID NO:15。肽P9是BRAF的氨基酸残基546-600，即EDLTVKIGDFGLATV SEQ ID NO:16。肽P10是BRAF的氨基酸残基547-601，即DLTVKIGDFGLATVK SEQ ID NO:17。这些肽使用计算机算法结合HLA-DR等位基因，如下文实施例1中所公开。通过标准³HTdR掺入测定法确定增殖反应。数据表示为平均cpm(三次重复测定)加上³HTdR掺入的SD(柱)。*值是与用对照肽获得的值存在显著(p<0.01)差异。该图表明T辅助肽可以在黑色素瘤患者PBMC中诱导增殖反应。

图2是显示在T辅助和基于BRAF_V600E的CTL肽都存在下诱导富集的CD8细胞毒性T细胞(CTL)的图。基于BRAF_V600E的CTL肽的序列是LMTEKSRWSG SEQ ID NO:25。T辅助序列是P9的SEQ ID NO:16。根据实施例2的方法，用T辅助合成肽(25μM)单独或与亲和力修饰的基于BRAF_V600E的CTL肽组合对粘附单核细胞进行脉冲并培养细胞。收获T细胞并用抗CD4或抗CD8抗体染色，并通过标准FACS试验分析T细胞结合。

图3是显示对暴露于淋巴细胞的黑色素瘤细胞进行的标准⁵¹Cr-释放试验的结果的图，所述淋巴细胞已经用上文在图1中鉴定的Th肽P9 SEQ ID NO:16，基于BRAF_V600E的CTL肽SEQ ID NO:25，或两种肽和天然人IL-2刺激，如实施例3中所述。测试淋巴细胞对HLA-A2+自体WM35(V600E+)或HLA-A2+匹配的同种异体WM3456(V600E-)黑色素瘤细胞的细胞溶解活性。在试验中使用指示的效应子(T细胞)与肿瘤靶标比率。

图4的图显示在实施例4中描述的建立的肿瘤模型中，基于BRAF_V600E的CTL肽SEQ IDNO:25，和检测点抑制剂(其是抗PD1抗体)的作用。以平均肿瘤体积和SEM显示肿瘤生长测量值，并将结果与接受对照HIV肽和抗PD1抗体的小鼠进行比较。肽免疫和抗PD1抗体疗法的组合显示出对肿瘤生长的显著抑制(p<0.05)。与同种型对照抗体治疗相比，单独的抗PD1抗体在肿瘤抑制中无效。

具体实施方式

本文描述了组合物和方法，其通过使用某些基于BRAF_V600E的肽，含有肽的组合物和编码这些肽的核酸组合物提供了治疗黑色素瘤和其他癌症的替代和增强方法。

以下定义在这些组合物和方法的描述中使用的某些组分和定义。

如本文所用术语BRAF_V600E是指SEQ ID NO:1的人氨基酸序列，其中600位的氨基酸残基由天然序列中的Val残基变为Glu。编码BRAF_V600E的核酸序列呈现在SEQ ID NO:21中。在一个实施方案中，编码SEQ ID NO:1的氨基酸595至620的核酸序列最常用于从天然序列进行改变以产生本文所述的肽或核酸组合物。天然人BRAF氨基酸及编码其的核酸序列显示在登录号为NM_004333.4的公开可用的NCBI数据库中。其他公开的序列可从NCBI或GenBank数据库获得。

如本文所用，术语“基于BRAF_V600E的肽”或“基于BRAF_V600E的CTL肽”指的是基于BRAF_V600E序列的氨基酸597-606，即Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly SEQ IDNO:2的肽，其诱导MHC I类、HLA-A2依赖性细胞毒性T细胞应答。在一个实施方案中，这个定义中包括的这种肽是美国专利号7,811,993中鉴定的肽，其通过引用并入本文。这种肽由式I定义：R1-Leu-AA2-AA3-Glu-AA5-AA6-AA7-Trp-AA9-AA10-R2(SEQ ID NO:3)，或其药学上可接受的盐，其中AA2是取代或未取代的Ala、Leu、Met、Val、Pro和Gly；AA3是取代或未取代的Thr和Ser；AA5是取代或未取代的Lys、Arg和His；AA6是取代或未取代的Ser和Thr；AA7是取代或未取代的Arg、Lys和His；AA9是取代或未取代的Thr、Val、Leu和Ser；AA10缺失或是取代或未取代的Gly、Pro或Leu。

基于BRAF_V600E的肽的该定义还包括由式II、III和IV定义的肽。式II是R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2(SEQ ID NO:4)，其中AA2是取代或未取代的Ile，和AA10是疏水残基。式III是R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2(SEQ IDNO:5)，其中AA2是疏水残基和AA10是取代或未取代的Gly、Val或Leu。式IV是R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2(SEQ ID NO:6)，其中AA2是取代的或未取代的Ala、Ile、Met或Leu，和其中AA10是取代或未取代的Gly、Ile、Val或Leu。

还有，根据式I、II、III或IV，在每个式的肽的一些实施方案中，R1和R2各自独立缺失或提供用于将每个式的肽偶联至该肽N-或C-末端的第二肽或蛋白的间隔序列。这种间隔序列可以是通常用作间隔物的氨基酸序列或化合物。例如，在一个实施方案中，R1是Cys；在另一个实施方案中，R1是Gly-Ser。在另一个实施方案中，R2是Cys。在又一个实施方案中，R2是Gly-Ser。在更进一步的实施方案中，R1和R2是相同的。在另一个实施方案中，R1和R2是不同的。在式II、III或IV的肽的另一个实施方案中，R1和R2独立缺失或是Cys用于偶联另外的肽或蛋白。

“疏水残基”是指取代或未取代的氨基酸，其赋予所得的基于BRAF_V600E的肽的疏水性。具有疏水侧链的未取代氨基酸是甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。接着可以对氨基酸进行各种取代或修饰使其或多或少具有疏水性。

基于BRAF_V600E的式I至IV的肽的实例包括以下序列：

R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:7)；

R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:8)；

R1-Leu-Leu-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:9)；

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Ile-R2(SEQ ID NO:10)；

Rl-Leu-Met-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:11)，

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:12)；

R1-Leu-Leu-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:13)；和

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Leu-R2(SEQ ID NO:14)。

本文使用的“T辅助肽”或“T辅助序列”或“Th肽”是指BRAF_V600ESEQ ID NO:1的某些T辅助序列或其修饰变体，即SEQ ID NO:1的氨基酸607-621，588至600和589至601。在一个实施方案中，合适的Th肽是Ser-His-Gln-Phe-Glu-Gln-Leu-Ser-Gly-Ser-Ile-Leu-Trp-His-Ala SEQ ID NO:15，其跨越BRAF_V600E的aa 607至622。在另一个实施方案中，合适的Th肽是Glu-Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val SEQ ID NO:16，其跨越BRAF_V600E的AA 588至600。在另一个实施方案中，合适的Th肽是Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val-Lys SEQ ID NO:17，其跨越BRAF_V600E的AA589至601。合适的Th序列的定义还包括所述肽序列的修饰形式及其药学上可接受的盐。跨越T辅助肽和基于BRAF_V600E的肽的肽，例如跨越AA597至622SEQ ID NO:32，或AA588至607SEQ IDNO:33或AA589至607SEQ ID NO:34，或衍生自BRAF_V600E序列的其他序列也是可能的。基于BRAF_V600E的肽的肽和T辅助肽的定义还包括所述肽序列的修饰形式及其药学上可接受的盐。

上述式I-IV的“修饰的”肽是指同源或类似的修饰序列，其中非可变氨基酸可以被具有相似特征的氨基酸残基单独地保守取代。在一个实施方案中，非可变氨基酸残基可以被具有相同电荷和/或相似侧链长度的其他氨基酸残基取代。类似地，非可变天然存在的氨基酸可以被非天然存在的氨基酸残基取代。对于上式的肽，氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸，意指自然界中存在的L形式的二十种氨基酸之一，其包括丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸，或通过天然存在的生物过程或途径产生的任何衍生物。

上述式I-IV的术语“修饰”还包括非天然存在的氨基酸。后一术语在本文中用于指除了如上定义的天然存在的氨基酸之外的氨基酸，其可以合成或“人造”，并且包括其衍生物，无论是合成产生还是通过生物学方法或途径产生。非天然存在的氨基酸包括但不限于D氨基酸，含有非天然取代侧链的氨基酸，例如N-甲基化氨基酸、环状氨基酸、二氨基酸、B-氨基酸、同源氨基酸。在一些实施方案中，上式中使用的非天然存在的氨基酸仅是那些不通过向肽主链添加额外原子而拉紧结合形式的氨基酸，因为这些肽需要主链与MHC氢键接触。非天然存在的或非天然的氨基酸的特征是新颖的主链和侧链结构，并且可以从商业试剂供应商广泛获得，例如Sigma-Aldrich(在sigmaaldrich.com的万维网上)，万维网Netchem.com和其他网站。当在本文的肽和组合物中使用这种非天然存在的氨基酸时，预期使得该化合物对血清、唾液、胃和肠中的哺乳动物酶的降解更具抗性，因此由一个或多个这种氨基酸组成的化合物可赋予该化合物在体内稳定性和生物利用度增强。用于生产非天然氨基酸的各种方法是已知的，并且可以由本领域技术人员选择。

在一个实施方案中，一类非天然存在的氨基酸包括影响立体化学的L氨基酸。因此，在化合物的一个实施方案中，所述肽中的一个或多个氨基酸可以是L形式，而其他氨基酸可以是D形式。另一种非天然存在的氨基酸是经过修饰以在氨基酸结构中的α-碳上含有取代基的氨基酸。例如，α-碳可以被合适的烃部分取代，例如氨基异丁酸酯。另一类非天然存在的氨基酸是经过修饰或突变以延长其碳链长度的氨基酸。例如，具有单个α-碳链的氨基酸可以延长至少一个另外的碳，即β-碳等等。对氨基酸的另一种修饰是在氨基的氮上***取代基。这种类型的修饰的实例是N-甲基氨基酸。在氨基酸分子的α碳或另外的碳上或氮上添加取代基可以在上式的任何氨基酸中发生。

用于产生非天然存在的氨基酸的有用取代基包括直链、支链、环或杂环C_1-12烷基，和直链、支链、环或杂环C_1-12烷酰基。所述氨基酸也可以通过***修饰糖、酰亚胺基团等进行修饰。其他氨基酸在邻位或间位被取代基例如H、OH、CH₃、卤素、OCH₃、NH₂、CH或NO₂取代。

包含在符合上式的化合物中的修饰或非天然存在的氨基酸的非排他性列表包括如下氨基酸的修饰：优选：N-末端乙酰化，C-末端酰胺化，N-末端甲硫氨酸甲酰化，该化合物中Asp、Asn、Pro或Lys残基的γ-羧基谷氨酸羟基化，Lys或Arg的甲基化；通常：该化合物中Ser、Thr、Tyr、Asp或His的磷酸化，使用吡咯烷酮羧酸，吡咯烷酮羧酸是N-末端谷氨酸，其形成内环状内酰胺，Tyr的磺化。非天然存在的氨基酸的其他修饰包括使用或用以下部分取代：2-氨基己二酸基团、3-氨基己二酸基团、β-Ala或β-氨基丙酸基团、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、6-N-甲基赖氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。

当R1或R2两者之一不存在或是任选的氨基酸(例如，Cys、-Gly-Ser-)或其他氨基酸或化合物间隔序列可以包含在肽的N-或C-末端，目的是将两个或多个相同或不同的基于BRAF_V600E的肽连接在一起或将该肽与第二肽(例如Th肽之一)或载体，式I-IV的肽的其他修饰包括融合成多肽或其他多聚体构建体或组合物。连接。优选地，R1或R2的间隔序列是蛋白水解敏感的间隔序列，以允许表位在其进入与MHC结合的细胞区室之前被切割。在一个实施方案中，相同的基于BRAF_V600E的肽的多个拷贝依次连接并表达为重组或合成产生的多肽。在一个实施方案中，多种不同的基于BRAF_V600E的肽在其间具有和不具有间隔氨基酸的情况下顺序连接，以形成更大的重组或合成的融合多肽。在一个实施方案中，相同的基于BRAF_V600E的肽的至少2,3,4,5,6,7,8,9或10个重复单元形成多肽。在另一个实施方案中，相同融合肽的至少2,3,4,5,6,7,8,9或10个重复单元，即基于BRAF_V600E的肽-T辅助肽融合。在又一个实施方案中，如所述的多个基于BRAF_V600E的融合肽与载体偶联。这种肽和多聚体组合物可通过常规方法合成或重组产生。在一个实施方案中，通过已知的化学合成技术常规制备该肽。

“载体”是指可以增强稳定性或递送、提高产量或改变肽的活性谱的蛋白、肽或其他底物。作为一些众所周知的实例，此类载体可以是人白蛋白、匙孔血蓝蛋白、聚乙二醇，其他生物聚合物或其他天然或非天然存在的聚合物。在一个实施方案中，所述部分理想地是蛋白或其他分子，其可以增强肽的稳定性或增强其向靶细胞的渗透。本文所述的基于BRAF_V600E的肽可通过间隔序列包括匙孔血蓝蛋白或另外的MHC分子连接其他蛋白或肽。其他载体还包括活的抗原呈递细胞，例如树突细胞，其显示本文所述的肽。另外的替代载体或肽载体构建体利用脂肽。

本文所用的术语“编码基于BRAF_V600E的肽的核酸序列”是指编码如本文所述的基于BRAF_V600E的肽的氨基酸序列的RNA或DNA序列，例如任何式I至式IV的肽。SEQ ID NO:21提供了BRAF_V600E的DNA序列，由它可以获得其他修饰的核酸序列，例如，编码本文所述的修饰的肽或融合肽。本文所用的“编码T辅助序列的核酸序列”是指编码如本文所述的T辅助细胞的氨基酸序列的RNA或DNA序列，例如SEQ ID Nos：15,16和17的氨基酸序列等。核酸序列还可以编码多肽或所引用的肽的融合物。核酸序列可以通过常规技术产生和/或修饰，并且可用在预防、诊断和治疗组合物和方法中，所述组合物和方法设计用于体内递送核酸和体内肽的表达。编码本文所述肽的核酸序列可通过已知的重组DNA技术制备，并用于在宿主微生物或细胞内克隆和表达肽。这种核酸序列还可编码所述肽的不同或优选密码子。

可替代地，可以设计这种编码这些肽的核酸序列以掺入递送给受试者所必需的其他核酸序列，例如，作为裸DNA或其他DNA疫苗形式。例如，可以构建合适的质粒，其含有编码选择的基于BRAF_V600E的肽或T辅助肽或两者的核酸序列，在调控序列的控制下，指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中的表达。质粒本身的组分是常规的。还可以使用病毒和细菌来源的其他核酸构建体和载体。参见，例如，美国专利号7,811,993，其通过引用并入本文。

如本文所用，术语“检查点抑制剂”是指抗体或小分子形式的组合物或组合物，其结合或抑制各种检查点蛋白。此类检查点蛋白包括但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA和CD160。作为实例，已知的检查点抑制剂包括抗体ipilimumabpembrolizumab和nivolumab等。在该定义中包括被开发作为小分子或其他检查点结合抗体或抗体片段的其他检查点抑制剂。

如本文所用，术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，包括抗体片段。该抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以是任何物种来源，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊、骆驼或人，或可以是嵌合抗体。参见，例如，Walker等,Molec.Immunol.26:403(1989)。该抗体可以是根据已知方法生产的重组单克隆抗体，参见例如美国专利号4,474,893或4,816,567，其通过引用并入本文。该抗体也可以根据已知方法化学构建，例如美国专利号4,676,980，其通过引用并入本文。还参见美国专利号8,613,922，其通过引用并入本文。抗体包括但不限于合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、可结合两个或更多个靶的多特异性结合构建体、双重特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体，或亲和力成熟的抗体。抗体片段包括但不限于抗原结合片段，例如单抗体链或scFv片段、双抗体、包含互补scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、Fab构建体、Fab'构建体、F(ab')2构建体、Fc构建体、已去除对单克隆抗体功能不重要的结构域的单价或二价构建体、含有一个V_L、一个V_H抗原结合结构域和任选通过连接子域连接的一个或两个恒定“效应子”结构域的单链分子、缺少铰链区的单价抗体、单域抗体、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白、纳米抗体、结构域抗体、疫苗抗体，线性抗体；重链或轻链互补决定区，和由抗体片段形成的多特异性抗体。该定义还包括抗体模拟物，例如亲和体，即一类工程化亲和蛋白，通常是小的(～6.5kDa)单结构域蛋白，其可以被分离以对任何给定的蛋白靶标具有高亲和力和特异性。这种抗原结合片段可通过已知技术产生。

本文所用的术语“患者”或“受试者”是指哺乳动物，包括人、兽医或农场动物、家畜或宠物，以及通常用于临床研究的动物。在一个实施方案中，用所述方法和组合物治疗的受试者是人。在另一个实施方案中，用所述方法和组合物治疗的受试者患有癌症。在另一个实施方案中，这些方法的受试者患有黑色素瘤。

如本文所用，术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。在一个实施方案中，术语“癌症”意指以存在实体瘤为特征的任何癌症。在一个实施方案中，通过本文所述方法治疗的合适癌症包括存在BRAF_V600E突变的癌症。在另一个实施方案中，合适的癌症包括但不限于具有此类突变的黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和卵巢癌。在另一个实施方案中，合适的癌症包括但不限于其他形式的黑色素瘤、脑癌、结肠/直肠癌、肺癌、卵巢癌、肾上腺癌、***癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、肾癌、喉癌、肝癌、头颈癌、鼻咽癌、骨肉瘤、口腔癌、胰腺癌、***癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、***癌、肺癌和神经内分泌癌。

如本文所用，术语“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌细胞和组织。在一个实施方案中，所述方法靶向的肿瘤的特征在于缺氧、T淋巴细胞的明显浸润和肿瘤微环境中低糖。

“治疗试剂”或“方案”是指用于治疗患有或不患有实体瘤的癌症中使用的任何类型的治疗，包括但不限于化疗药物、生物反应调节剂、放射、饮食、维生素疗法、激素疗法、基因治疗、手术切除等。

“免疫治疗组合物”或“免疫治疗疫苗”是指包括基于BRAF_V600E的肽或编码其的核酸序列的刺激受试者的免疫***的任何组合物。这种免疫治疗组合物被设计为通过给予受试者的免疫原性组合物所递送的BRAF靶基因产物引发体液(例如抗体)或细胞(例如，细胞毒性T细胞或T辅助细胞)应答。如本文所述的免疫治疗组合物或疫苗使用已知的重组和合成技术产生。

在一个实施方案中，可用于这些方法的免疫治疗组合物包括将基于BRAF_V600E的肽呈递给受试者的免疫***。在另一个实施方案中，本文所述方法中使用的免疫治疗组合物是DNA或RNA组合物，其包含编码基于BRAF_V600E的肽的核酸。在另一个实施方案中，基于BRAF_V600E的肽或编码核酸序列通过病毒载体递送，例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、痘病毒或其他，或通过病毒样颗粒(VLP)递送。在另一个实施方案中，本文所述方法中使用的免疫治疗组合物是特异性结合癌抗原的单克隆抗体或抗原结合片段。

在另一个实施方案中，该免疫治疗组合物是树突细胞。树突细胞疗法包括从患者收集自体血细胞(单核细胞)并用基于BRAF_V600E的肽(任选地具有Th肽)离体预处理所述细胞。“用...预处理”是指在约1至约500μM的所选的基于BRAF_V600E的肽存在下培养和扩增自体树突细胞，使得该树突细胞在再输给受试者时激活免疫***。在一个实施方案中，预处理的时间是指体外培养的整个时间，其可以跨越数小时到至少数天。在另一个实施方案中，预处理的时间是体外培养最少24小时。用本文所述组合物的肽或核酸组分预处理的其他时间段可以是至少1,5,10,15或20或更多小时，或本文所述任何指定小时数之间的任何间隔时间。预处理的树突细胞重新引入，例如通过静脉内注射，回到患者，以允许大量树突细胞参与最佳的活化免疫***中。

“载体”是指将异源分子递送至细胞的实体，用于治疗或疫苗目的。如本文所用，载体可包括任何遗传成分，包括但不限于裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒或细菌。载体使用本文提供的技术和序列产生，如实施例中所述并结合本领域技术人员已知的技术。这些技术包括cDNA的常规克隆技术，例如文献中描述的那些，例如Green和Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.4^th Edit,Cold Spring HarborLaboratory Press,2012，使用沙门氏菌基因组的重叠寡核苷酸序列，聚合酶链反应和提供所需核苷酸序列的任何合适方法。

术语“药学上可接受的载体或媒介”是指对人类给药安全的溶液或悬浮液。任选地，这种载体增强稳定性和/或免疫原性。这种载体包括，例如，水、盐水、缓冲盐水、醇类、***树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、淀粉酶或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、脂质体、水包油乳剂等。该组合物可进一步包括去污剂以使肽更具生物可利用性，例如辛基葡糖苷。

“佐剂”是指当与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。在一个实施方案中，合适的佐剂是CPG。在另一个实施方案中，合适的佐剂是包封的PLG。其他有用的佐剂是已知的，和包括在美国专利号7,811,993中列出和公开的那些，以及其引用的参考文献，它们都通过引用并入本文。

“给药”或“给药途径”是指将本文方法中使用的基于BRAF_V600E的肽、多肽、核酸构建体、T辅助肽或编码它们的核酸构建体、或检测点抑制剂或预处理的树突细胞递送给受试者。如下面详细讨论的，这些方法对于该方法的每个步骤可以是独立的。每种给药方法可以在有或没有药物载体或赋形剂的情况下，或者在有或没有另外的化疗剂的情况下施用给受试者。常规和药学上可接受的给药途径包括但不限于全身途径，例如腹膜内、静脉内、皮内、皮下和其他非肠道给药途径或肿瘤内或结内给药。在一个实施方案中，对于肽和多肽，给药途径是皮内或皮下。在另一个实施方案中，对于检查点抑制剂抗体，给药途径是腹膜内或血管内。在另一个实施方案中，给药途径是血管内或静脉内用于递送基于树突细胞的疫苗。如果需要，给药途径可以组合。在一些实施方案中，定期重复给药，如下文详细讨论的。

在本文所述的组合物和方法的上下文中，所列出的组合物、肽、抗体或其他成分的“一个或多个”、“至少五个”等是指它们中的任何一个或任何几个和所有组合。

词语“包括”和“包含”应解释为包含在内而不是排他性的，即包括其他未指定的成分或方法步骤。

词语“由……组成”及其变体将被解释为排他性地，而不是包含性地，即排除未具体叙述的成分或步骤。

如本文所用，短语“基本上由……组成”将所述组合物或方法的范围限制于指定的材料或步骤，以及那些不会实质上影响所述或要求保护的方法或组合物的基本和新颖特征的那些材料或步骤。本说明书中的任何地方，方法或组合物被描述为“包含”某些步骤或特征，其还意味着包括基本上由这些步骤或特征组成和/或由那些步骤或特征组成的相同方法或组合物的实施方案。

除非另有说明，否则本文所用的术语“约”是指与给定参考值相差10％的变化量。

应注意，术语“一个”是指一个或多个，例如，“miRNA”，应理解为代表一个或多个miRNA。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

除非在本说明书中另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义，并且参考公开的文本，其为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般性的指导。

用作免疫治疗疫苗的组合物

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽或其药学上可接受的盐，所述肽具有式II：R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2(SEQID NO:4)。根据该式，R1和R2独立缺失或是Cys用于偶联另外的肽或蛋白，AA2是取代或未取代的Ile和AA10是取代或未取代的疏水残基。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。

在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽或其药学上可接受的盐，所述肽具有式III：R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2(SEQ ID NO:5)。根据该式，R1和R2独立地不存在或是Cys用于偶联另外的肽或蛋白，和AA2是疏水残基且AA10是取代或未取代的Gly、Val或Leu。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3或TIM334。

在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽或其药学上可接受的盐，所述肽具有式IV：R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2(SEQ ID NO:6)。根据该式，R1和R2独立地不存在或是Cys用于偶联另外的肽或蛋白，和AA2是取代或未取代的Ala、Ile、Met或Leu，和其中AA10是取代或未取代的Gly、Ile、Val或Leu。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2SEQ ID NO:7或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2SEQ ID NO:8或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Leu-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2SEQ ID NO:9或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Ile-R2SEQ ID NO:10或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Met-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2SEQ ID NO:11或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2SEQ ID NO:12或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Leu-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2SEQ ID NO:13或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Leu-R2SEQ ID NO:14或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含肽或其药学上可接受的盐，式I、II、III或IV的肽和T辅助肽。在一个实施方案中，所述T细胞肽被偶联或融合在基于BRAF_V600E的肽或多肽的肽的N-或C-末端。在一个实施方案中，所述T辅助肽是Ser-His-Gln-Phe-Glu-Gln-Leu-Ser-Gly-Ser-Ile-Leu-Trp-His-Ala SEQ ID NO:15。在一个实施方案中，所述T辅助肽是Glu-Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val SEQ ID NO:16。在一个实施方案中，所述T辅助肽是Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val-Lys SEQ ID NO:17。

在含有基于BRAF_V600E的肽或多肽和T辅助序列融合的组合物的另一个实施方案是BRAF_V600E中发现的跨越Th和CTL序列的序列。在一个实施方案中，这个序列跨越大约AA586至AA 606并具有下式：例如，Glu-Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10SEQ ID NO:18，AA2和AA10如上述式II、III或IV中任一个所述。

在另一个实施方案中，这个序列跨越大约AA587至AA606并具有下式，例如Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10SEQ ID NO:19，AA2和AA10如上述式II、III或IV中任一个所述。在另一个实施方案中，这个序列跨越大约AA597至AA621并具有下式：例如Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-Ser-His-Gln-Phe-Glu-Gln-Leu-Ser-Gly-Ser-Ile-Leu-Trp-Met-Ala SEQ IDNO:20，AA2和AA10如上述式II、III或IV中任一个所述。

这些序列的其他实施方案可含有修饰的氨基酸，或式I中指定位置的取代的氨基酸，或保守取代，肽的任一末端可能有间隔氨基酸，或多个Th序列侧翼的整个肽的氨基或羧基氨基酸，如上所述。编码这些序列的核酸序列也可用于这些组合物中。

在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含药学上可接受的媒介或载体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含脂质体。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂。在某些实施方案中，如本文所述的组合物包含佐剂CPG或包封的PLG。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含融合或偶联在一起的相同的基于BRAF_V600E的肽或多肽的多个拷贝。在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含融合肽的多个拷贝，所述融合肽包含与T辅助肽融合或偶联的相同的基于BRAF_V600E的肽或多肽。在另一个实施方案中，这种组合物包含基于BRAF_V600E的多肽或由5至10个相同的框架内融合或通过间隔序列形成的融合体框架内。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在更进一步的实施方案中，由本文所述，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含一个或多个基于BRAF_V600E的肽或多肽或其与T辅助序列的融合体。可以将任何数量的单肽或多聚体构建体混合在一起以形成单一组合物。所述肽可以与药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂、其他任选组分或它们的一些组合配制在一起。对于在这样的组合物中使用，所选择的肽可以优选地合成产生，但也可以重组产生，如上所述。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在更进一步的实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含一个或多个本文所述的基于BRAF_V600E的肽，其与酸形成的盐形式。该化合物具有至少一个可形成盐的氨基/胺基。当该化合物中存在两个或更多个氨基时，可以制备混合盐的制剂。可以优选使用的酸包括相容的无机酸，例如盐酸和有机酸(或其盐)，更优选活生物体中存在的那些，包括但不限于草酸、葡糖醛酸、丙酮酸、乳酸、柠檬酸、异柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸和草酰乙酸。在优选的水溶液的情况下，期望的阴离子可以作为游离酸或盐，优选在水中高度溶解的盐，例如钠盐或钾盐，但也可以是锂、镁、钙或铵盐。而且，这些盐可以以无水或水合形式使用。例如，可以使用柠檬酸作为无水游离酸、一水合物游离酸、无水三钠盐或二水合物三钠盐。这些盐可以通过国际专利公开号WO 96/02269所述的方法制备，通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含核酸序列，例如DNA疫苗，其编码组合物的任何组分，该组合物含有基于BRAF_V600E的式I、II、III或IV肽，或包含两个或更多拷贝的基于BRAF_V600E的多肽或其与上述T辅助序列的融合体。在一个实施方案中，用作DNA疫苗的核酸序列可以采用携带上述编码肽的核酸序列的重组载体的形式。在另一个实施方案中，可以携带所述核酸序列，以及BRAF_V600E肽由基于质粒的***表达，其中许多是商业上可获得的或者是复制或非复制型的重组病毒载体。本文讨论的核酸序列可以使用这种载体在期望的宿主细胞中体外表达和产生，或在哺乳动物受试者体内表达和产生。在一个实施方案中，所述载体是非致病性病毒。在另一个实施方案中，所述载体是非复制型病毒。在一个实施方案中，期望的病毒载体可以是逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在另一个实施方案中，期望的载体是腺病毒载体。在另一个实施方案中，合适的载体是腺相关病毒载体。腺病毒、腺相关和慢病毒通常是优选的，因为它们活跃感染***以及静息和分化的细胞，例如干细胞、巨噬细胞和神经元。各种腺病毒、慢病毒和AAV毒株可从弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得，或者可从各种商业和机构来源获得。此外，许多这种菌株的序列可从各种数据库获得，包括例如PubMed和GenBank。

在一个实施方案中，使用慢病毒载体。有用的载体中有马传染性贫血病毒和猫以及牛免疫缺陷病毒和基于HIV的载体。各种有用的慢病毒载体，以及产生用于转导细胞和表达异源基因的这种载体的方法和操作，例如，N Manjunath等，2009Adv Drug Deliv Rev.,61(9)：732-745；Porter等，N Engl J Med.2011年8月25日；365(8)：725-33)等。

在另一个实施方案中，本文使用的所述载体是腺病毒载体。可以使用任何已知腺病毒血清型中的一个或多个的腺病毒DNA构建这种载体。参见，例如，T.Shenk等,Adenoviridae:The Viruses and their Replication"，第67章，FIELD'S VIROLOGY，第6版，B.N Fields等编辑，(Lippincott Raven Publishers,Philadelphia,1996)，第111-2112页；6,083,716，其描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组；美国专利号7,247,472；WO2005/1071093等。本领域技术人员可以容易地构建合适的腺病毒载体以携带和表达编码如本文所述的期望的BRAF_V600E和/或T辅助肽或融合肽的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本文使用的载体是腺相关病毒(AAV)载体。这种载体可以使用一个或多个已知AAV血清型的AAV DNA构建。参见，例如，美国专利号7,803,611；美国专利号7,696,179等。

在另一个实施方案中，本文使用的载体是细菌载体。在一个实施方案中，所述细菌载体是单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。参见，例如，Lauer等，Infect.Immunity，76(8)：3742-53(2008年8月)。因此，在一个实施方案中，所述细菌载体是减活或光化学灭活的。如本文所述的BRAF_V600E和/或T辅助肽或融合肽可以由所述细菌重组表达，例如通过导入细菌的质粒，或整合到细菌基因组中，即通过同源重组。

这些载体还包括允许在用所述质粒载体转染或用所述病毒载体感染的细胞中转录、翻译和/或表达所述核酸序列的常规控制成分。许多表达控制序列，包括天然的，组成型的，可诱导的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用。在一个实施方案中，根据所选择的载体选择所述启动子。在另一个实施方案中，当所述载体是慢病毒时，所述启动子是U6、H1、CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在另一个实施方案中，当载体是AAV时，所述启动子是RSV、U6或CMV启动子。在另一个实施方案中，当载体是腺病毒时，启动子是RSV、U6、CMV或H1启动子。在另一个实施方案中，当所述载体是单核细胞增生李斯特氏菌时，所述启动子是hly或actA启动子。其他常规表达控制序列包括选择标记或报告基因，其可包括编码遗传霉素、潮霉素、氨苄青霉素或嘌呤霉素抗性的序列等。所述载体的其他组分可包括复制起点。这些和其他启动子和载体成分的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的(参见例如本文引用的参考文献)。

编码用于DNA疫苗的BRAFV600E和/或T辅助序列的核酸序列使用本文提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知的技术来产生。这些技术包括cDNA的常规克隆技术，如文中所述(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY)，使用重叠寡核苷酸序列，聚合酶链反应，各种已知的Crispr-Cas方法，以及提供所需核苷酸序列的任何合适方法。

因此，在一个实施方案中，使用本文教导的信息和公开可获得的和已知的载体构建元件和技术，本领域技术人员可以构建表达编码BRAF_V600E和/或T辅助序列的所需核酸序列的病毒载体(或质粒)。由这些核酸构建体编码的BRAF_V600E和/或T辅助多肽或蛋白或融合多肽或蛋白可以在宿主细胞中体外或离体表达，或通过给予哺乳动物受试者在体内表达。或者，所述BRAF_V600E和/或T辅助多肽或蛋白或融合多肽可通过已知的化学合成方法合成产生。本领域技术人员可以选择合适的方法来产生这些BRAF_V600E和/或T辅助多肽或蛋白或融合多肽，这取决于组分、方法的效率和预期用途，例如，是否作为蛋白、核酸或以过继性T细胞给药，或以其他方式实现所需的治疗结果。

这种核酸组合物可包括具有用于直接DNA、质粒核酸或重组载体施用的合适媒介的制剂。这种媒介包括但不限于盐水、蔗糖、鱼精蛋白、聚凝胺、聚赖氨酸、聚阳离子、蛋白或亚精胺等。参见例如，国际专利公开号WO94/01139，其他药学上可接受的媒介、赋形剂和DNA组合物的典型组分任选地包括在这些组合物中。

在另一个实施方案中，提供了如上所述的组合物，其含有一个或多个基于BRAF_V600E的肽、多肽或融合物或编码其的核酸序列，包括DNA疫苗，处于药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂或其组合中。这个组合物可含有其他药学上可接受的组分，用于增强化合物渗透到细胞中和/或提高其生物利用度和增加其对体内酶降解的抗性。在一个实施方案中，这种组合物是药物组合物。另一个实施方案中的这种组合物是免疫原性的。

这些药物组合物，无论是肽或核酸组合物，也可以被配制成适合所选择的给药途径，并且可以含有药物制剂领域技术人员已知的给药途径特有的成分。非排他性的助剂列表是不会与该活性化合物发生有害反应的润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。由上述组分制备的具有适当的pH等渗性、稳定性和其他常规特征的这些药学上可接受的组合物在本领域的技术范围内。

在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的组合物包含用任何式I、II、III或IV的所述基于BRAF_V600E的肽，或包含两个或多个拷贝的所述基于BRAF_V600E的多肽或与上述T辅助序列的融合体的多肽离体预处理的重组树突细胞细胞。在另一个实施方案中，所述组合物还含有结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。在这种检查点抑制剂中有CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

在另一个实施方案中，可用于治疗黑色素瘤或其他癌症的包括修饰的T细胞，其是用上述载体之一转导或转染的T细胞，所述载体携带编码基于BRAF_V600E的肽、多肽或融合体的核酸构建体或编码它们的核酸序列。理想地，所述T细胞是原发的T细胞、CD8(细胞毒性)T细胞，或NK T细胞，或其他T细胞，所述T细胞从所述修饰的T细胞被施用的相同的哺乳动物受试者得到，或从该哺乳动物物种的另一成员获得。在一个实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的自体人T细胞或自然杀伤(NK)T细胞或来自受试者的骨髓移植匹配者。其他合适的T细胞包括从切除的肿瘤获得的T细胞、多克隆或单克隆肿瘤反应性T细胞。所述T细胞通常通过单采血液成分术(aphersis)获得，并用选择的核酸构建体转染或转导以在体内表达所述BRAF_V600E肽或与T辅助蛋白的融合体。

治疗方法

治疗或延缓或预防哺乳动物受试者中黑色素瘤发展的方法包括给有此需要的受试者，即患有黑色素瘤的受试者，施用上述任何组合物。该方法对于治疗黑色素瘤以诱导患者对抗癌症的MHC I类、HLA-A2限制性CTL应答有用。

这些方法的治疗组合物和组分可以施用于患者，优选悬浮在生物相容性溶液或药学上可接受的递送媒介中。制备所述方法的各种组分用于给药，通过悬浮或溶解于药学上或生理学上可接受的载体如等渗盐水、等渗盐溶液或对于这种给药技术人员显而易见的其他制剂中。适当的载体对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且在很大程度上取决于给药途径。已知是药学上可接受载体的和本领域技术人员公知的其他水性和非水性等渗无菌注射溶液和水性和非水性无菌悬浮液可以用于此目的。

如上所述的药物组合物可以通过任何合适的途径给药，例如皮下注射肽组合物或静脉内注射检查点抑制剂抗体和输注树突细胞。可以根据剂量、患者状况、癌症类型和阶段以及其他临床因素来选择如上所述的其他给药途径。

在另一个实施方案中，治疗或延缓或预防哺乳动物受试者中黑色素瘤发展的方法包括向所述受试者施用基于BRAF_V600E的修饰肽或其药学上可接受的盐，以及(a)T辅助肽和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子中的至少一个。

在另一个实施方案中，治疗或延缓或预防哺乳动物受试者中黑色素瘤发展的方法，包括向所述受试者施用编码基于BRAF_V600E的修饰肽的核酸序列，以及(a)编码T辅助肽的核酸序列和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子中的至少一个。

在又一个实施方案中，治疗或延缓或预防哺乳动物受试者中黑色素瘤发展的方法，包括向所述受试者施用被下述物质预处理的树突细胞：基于BRAF_V600E的修饰肽或编码所述肽的核酸序列，连同(a)T辅助肽和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子中的至少一个。在另一个实施方案中，用下述物质预处理所述树突细胞：T辅助肽、基于BRAF_V600E的修饰肽与T辅助肽的融合体，或如上所述的跨越BRAF_V600E的所述T辅助细胞和CTL肽的肽。在另一个实施方案中，用编码这些肽的核酸分子预处理或转染所述树突细胞。

治疗或预防黑色素瘤发展的方法包括给哺乳动物受试者(优选是人)施用有效量的本文所述的药物组合物。根据化合物的半衰期、黑色素瘤的特性和/或阶段、患者的年龄、体重、性别、综合身体状况等，选择每个有效剂量中存在的蛋白、肽或核酸序列的量。诱导针对黑色素瘤细胞的有效CTL应答而没有显著不良副作用所需的活性成分的量根据所用的药物组合物和任选存在的其他成分而变化。通常，对于含有蛋白/肽或融合蛋白的组合物，每个剂量包含约5μg肽/kg患者体重至约10mg/kg。通常，有用的治疗剂量为1至5mg肽/kg体重。有用剂量的另一个实施方案可以是约500μg/kg肽。在一个实施方案中，所述组合物以从25(包括25)至250微摩尔的肽或编码肽的核酸序列的浓度施用。

在一个实施方案中，所述基于BRAF_V600E的肽、多肽、与T辅助肽的融合体或编码它们的核酸序列的合适浓度的剂量是以至少1,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490到至少约500μM施用。类似地，列出的任何两个数字之间的间插浓度包括在术语“合适的浓度”中。本领域技术人员也可以考虑其他剂量范围。例如，肽的剂量可以类似于针对其他肽癌疗法所讨论的剂量。

如果组合物作为抗体或其他蛋白施用，则剂量可以为0.01mg至100mg蛋白之间的单位剂量(相当于约12.5μg/kg体重)。如果任何组合物以裸DNA形式施用，则剂量可以为每毫升(mL)无菌溶液约50μg至约1mg DNA。如果组合物作为病毒中的DNA疫苗施用，则有效治疗的成人或兽医剂量的病毒载体通常在约100μL至约100mL的载体中，含浓度为约1×10⁶至约1×10¹⁵个微粒，约1×10¹¹至1×10¹³个微粒，或约1×10⁹至1×10¹²个病毒微粒。可以基于所使用的特定抗体或小分子的已知毒性来调整检查点抑制剂的剂量。

在一个实施方案中，所选组合物以单剂量施用。在另一个实施方案中，组合物初始剂量之后可任选地重复给予由主治医师选择的持续时间。在一个实施方案中，施用一至三次加强剂量。剂量频率还可以取决于上面确定的因素，并且可以在每天1至6个剂量的范围内持续约3天至最多不超过约1周。所述组合物也可以连续输注给药约3-5天，输注的具体剂量取决于化合物的半衰期。该化合物也可以掺入化疗方案中，包括重复的给药周期。合适的给药方法将由主治医师选择。

在另一个实施方案中，所述肽或核酸组合物和检查点抑制剂通过肌肉内、腹膜内、静脉内、肿瘤内、口服或结内给药全身独立给药。在更进一步的实施方案中，在用所述组合物治疗之前、期间或之后，用其他抗癌疗法治疗受试者。例如，可以在施用所述组合物之前用化学疗法治疗受试者。

在另一个实施方案中，包括将免疫治疗组合物与预处理的树突细胞共同施用的该方法还可包括以抗体或小分子的形式施用检查点抑制剂。

在本文所述的一个实施方案中，基本上同时施用免疫治疗的基于的BRAF_V600E的肽、多肽或融合组合物和T辅助肽，或编码它们的核酸组合物，或用它们预处理的树突细胞。在另一个实施方案中，这些免疫治疗组合物和T辅助序列，任选地与检查点抑制剂，通过相同或不同的给药途径顺序施用。选择的给药途径取决于组合物的性质。例如，如果所述检查点抑制剂是小化学分子，则这些分子可以以这些药物的其他药物用途所已知和可接受的剂量口服给药。该方法的其他组合物或组分以如上所述的不同途径施用。

在这些方法的更进一步的方面，受试者在用其他抗癌疗法治疗之前、期间或之后可以用上述组合物或组合物的单个组分和方法治疗用。这种治疗可与用所述基于BRAF_V600E的肽或核酸组合物或树突细胞组合物同时进行，或用任何这些组分重叠治疗。在一个实施方案中，所述方法包括在施用免疫治疗组合物、T辅助序列和/或检查点抑制剂抗体或小分子模拟物之前用化学疗法治疗受试者。在另一个实施方案中，该方法还包括在施用上述方法的组分之前耗尽淋巴细胞的受试者并任选地手术切除肿瘤。

其他剂量在本文引用的参考文献中进行了教导，并且本领域技术人员可以根据治疗方案、患者的身体状况、待***的类型和阶段以及部位，以及考虑用于治疗患者的其他辅助化学疗法来容易地调整。

提供以下实施例仅用于说明的目的，并且本发明决不应被解释为限于这些实施例，而应解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

实施例1：T辅助序列

使用计算机算法筛选BRAF_V600E突变的上游和下游的氨基酸序列的T辅助序列(Th)，其与HLA-DR等位基因结合。表I说明了许多测试序列。

表1：预测与HLA-A2结合的人修饰的BRAF_V600E肽

¹FI-(MFI_肽/MFI_w/o肽)-1

如下测定许多这样的肽：用合成肽(25μM)：肽8SEQ ID NO:15、肽9SEQ ID NO:16和肽10SEQ ID NO:17对粘附单核细胞(5×10⁴/孔)脉冲8小时。在孵育结束时，除去过量的肽并将单核细胞与标记为WM35、WM3457和3451的三个黑色素瘤患者的(1×10⁵)个PBMC的样品之一培养5天。

通过标准³HTdR掺入测定法测定增殖反应，结果在图1中显示。数据表示为平均cpm(一式三份测定)加上³HTdR掺入的SD(柱)。在每个样品中，在该测定中所测定的肽8或肽9获得与对照相比显著(p<0.01)差异的值。因此，显示T辅助肽在黑色素瘤患者PBMC中诱导增殖反应。

实施例2：细胞毒性T细胞的诱导

用T辅助合成肽(25μM)单独或与亲和力修饰的基于BRAF_V600E的肽(即序列LMTEKSRWSG的CTL肽；SEQ ID NO:25)组合对粘附单核细胞(5×10⁴/孔)脉冲8小时。如实施例1中所述开始细胞培养，和在7天结束时收获T细胞并用荧光缀合的抗CD4或抗CD8抗体染色，并通过标准FACS试验分析T细胞结合。

如图2所示，在Th肽和基于BRAF_V600E的CTL肽都存在下，Th肽诱导富集的CD8CTL。

实施例3：诱导更有效的CTL

如实施例1和2中所述开始T细胞培养。7天后，收获生长的淋巴细胞培养物并用序列EDLTVKIGDFGLATV SEQ ID NO:16的Th肽9、SEQ ID NO:25的基于BRAF_V600E的肽、或两者，和20U/ml的天然人IL-2再刺激。每7天重复这个过程直至第56天收获淋巴细胞时并在标准51Cr释放试验中测试针对HLA-A2+自体WM35(V600E+)或HLA-A2+匹配的同种异体WM3456(V600E-)黑色素瘤细胞的细胞溶解活性。在试验中所用各种效应细胞(T细胞)与肿瘤靶标比率为12.5:1或25:1或50:1。

如图3所示，T辅助和基于BRAF_V600E的CTL肽的组合比单独的Th或CTL肽诱导更有效的CTL。

实施例4：已建立的肿瘤的复原

在已建立的肿瘤模型中，C57Bl/6(4-6周龄；n＝5；雄性)小鼠接受皮下注射小鼠黑色素瘤细胞系(YUMM 1.7；1×10⁵)。7天后，建立肿瘤。在作为佐剂的CpG(30μg)存在下，小鼠接受基于BRAF_V600E的肽SEQ ID NO:25免疫(50μg，皮内，每7天)。小鼠还单独或组合地接受抗PD1抗体(通过腹膜内注射250μg，每5-6天)。

图4以平均肿瘤体积和SEM显示肿瘤生长测量值。将结果与接受对照HIV肽和抗PD1抗体的小鼠进行比较。肽免疫和抗PD1抗体疗法的组合显示出对肿瘤生长的显著抑制(p<0.05)。与同种型对照抗体治疗相比，单独的抗PD1抗体在肿瘤抑制中无效。图4证明用基于BRAF_V600E的CTL肽免疫和用检查点抑制剂(即抗PD1抗体)治疗相组合，在已建立的肿瘤模型中对小鼠黑色素瘤(YUMM1.7)细胞的生长具有显著作用，并诱导已建立的肿瘤的复原。

表2(序列表自由文本)

为数字标识符<223>下包含自由文本的序列提供以下信息。

每个专利，专利申请，包括美国临时专利申请号62/296,705，和出版物，包括NCBI序列，序列表和在整个公开内容中引用并在下面列出的网站，通过引用整体明确地并入本文。本说明书中引用的所有可公开获得的文献和公共数据库以及公众可获得的DNA和核酸序列通过引用并入本文。权利要求和序列表通过引用并入本文。虽然已经参考具体实施例公开了本发明，但是显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方案和变型。所附权利要求包括这些实施方案和等同变型。

序列表

<110> 威斯达解剖学与生物学研究所

<120> 用于治疗黑色素瘤的方法和组合物

<130> WST163PCT

<150> 62/296705

<151> 2016-02-18

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 766

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly

20 25 30

Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp

35 40 45

Asn Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu

50 55 60

Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu

85 90 95

Gln Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu

115 120 125

Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val

130 135 140

Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe

145 150 155 160

Leu Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr

165 170 175

Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro

180 185 190

Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile

195 200 205

Gly Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val

210 215 220

Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys

225 230 235 240

Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe

245 250 255

Gln Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys

260 265 270

Ser Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu

275 280 285

Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu

290 295 300

Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala

305 310 315 320

Pro Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro

325 330 335

Ser Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp

340 345 350

His Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn

355 360 365

Val His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg

370 375 380

Asp Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala

385 390 395 400

Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu

405 410 415

Gln Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser

420 425 430

Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp

435 440 445

Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly

450 455 460

Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val

465 470 475 480

Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gln Gln Leu Gln

485 490 495

Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn

500 505 510

Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ala Ile Val

515 520 525

Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile

530 535 540

Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr

545 550 555 560

Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp

565 570 575

Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile

580 585 590

Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His

595 600 605

Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val

610 615 620

Ile Arg Met Gln Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr

625 630 635 640

Ala Phe Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gln Leu Pro Tyr

645 650 655

Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly

660 665 670

Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala

675 680 685

Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg

690 695 700

Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser

705 710 715 720

Leu Pro Lys Ile His Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala

725 730 735

Gly Phe Gln Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys

740 745 750

Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His

755 760 765

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 2

Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa缺失, Ser, Gly或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是取代的或未取代的Ala, Leu, Met, Val, Pro或 Gly

<220>

<221> SITE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是取代的或未取代的Thr或Ser

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是取代的或未取代的Lys, Arg或His

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是取代的或未取代的Ser或Thr

<220>

<221> SITE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是取代的或未取代的Arg, Lys或His

<220>

<221> SITE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是取代的或未取代的Thr, Val, Leu或Ser

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa缺失或是取代的或未取代的Gly, Pro或 Leu

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa缺失或是Cys, Ser或Gly

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)..(4)

<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (5)..(5)

<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (7)..(7)

<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (9)..(9)

<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (11)..(11)

<223> The 'Xaa' at location 11 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 3

Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是Ser, Gly, Cys或缺失

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是取代的或未取代的Ile

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是取代的或未取代的Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是Ser, Gly, Cys或缺失

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)..(4)

<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 4

Xaa Xaa Leu Xaa Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是取代的或未取代的Gly, Val或Leu

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失或是Cys, Gly或Ser

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)..(4)

<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 5

Xaa Xaa Leu Xaa Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失或是Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是取代的或未取代的Ala, Ile, Met或Leu,

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是取代的或未取代的Gly, Ile, Val或Leu.

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)..(4)

<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 6

Xaa Xaa Leu Xaa Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 7

Xaa Xaa Leu Ile Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Xaa Xaa

1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 8

Xaa Xaa Leu Ile Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Val Xaa Xaa

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<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

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<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 9

Xaa Xaa Leu Leu Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Val Xaa Xaa

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<210> 10

<211> 14

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

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<223> 合成肽

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<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

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<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 10

Xaa Xaa Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Ile Xaa Xaa

1 5 10

<210> 11

<211> 14

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

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<223> 合成肽

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<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 11

Xaa Xaa Leu Met Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Xaa Xaa

1 5 10

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

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<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 12

Xaa Xaa Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Val Xaa Xaa

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 13

Xaa Xaa Leu Leu Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Xaa Xaa

1 5 10

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

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<223> 合成肽

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<221> SITE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是缺失, Gly, Ser或Cys

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 14

Xaa Xaa Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Leu Xaa Xaa

1 5 10

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 15

Ser His Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp His Ala

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys

1 5 10 15

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa是取代的或未取代的Ala, Ile, Met, Leu, Gly, Val, Pro, Phe或Trp

<220>

<221> SITE

<222> (21)..(21)

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (21)..(21)

<223> The 'Xaa' at location 21 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 18

Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Xaa Thr Glu Lys

1 5 10 15

Ser Arg Trp Ser Xaa

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (20)..(20)

<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 19

Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Xaa Thr Glu Lys Ser

1 5 10 15

Arg Trp Ser Xaa

20

<210> 20

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (2)..(2)

<220>

<221> SITE

<222> (10)..(10)

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (10)..(10)

<223> The 'Xaa' at location 10 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 20

Leu Xaa Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Xaa Ser His Asp Gln Phe Glu

1 5 10 15

Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala

20 25

<210> 21

<211> 2403

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 21

atggcggcgc tgagcggtgg cggtggtggc ggcgcggagc cgggccaggc tctgttcaac 60

ggggacatgg agcccgaggc cggcgccggc gccggcgccg cggcctcttc ggctgcggac 120

cctgccattc cggaggaggt gtggaatatc aaacaaatga ttaagttgac acaggaacat 180

atagaggccc tattggacaa atttggtggg gagcataatc caccatcaat atatctggag 240

gcctatgaag aatacaccag caagctagat gcactccaac aaagagaaca acagttattg 300

gaatctctgg ggaacggaac tgatttttct gtttctagct ctgcatcaat ggataccgtt 360

acatcttctt cctcttctag cctttcagtg ctaccttcat ctctttcagt ttttcaaaat 420

cccacagatg tggcacggag caaccccaag tcaccacaaa aacctatcgt tagagtcttc 480

ctgcccaaca aacagaggac agtggtacct gcaaggtgtg gagttacagt ccgagacagt 540

ctaaagaaag cactgatgat gagaggtcta atcccagagt gctgtgctgt ttacagaatt 600

caggatggag agaagaaacc aattggttgg gacactgata tttcctggct tactggagaa 660

gaattgcatg tggaagtgtt ggagaatgtt ccacttacaa cacacaactt tgtacgaaaa 720

acgtttttca ccttagcatt ttgtgacttt tgtcgaaagc tgcttttcca gggtttccgc 780

tgtcaaacat gtggttataa atttcaccag cgttgtagta cagaagttcc actgatgtgt 840

gttaattatg accaacttga tttgctgttt gtctccaagt tctttgaaca ccacccaata 900

ccacaggaag aggcgtcctt agcagagact gccctaacat ctggatcatc cccttccgca 960

cccgcctcgg actctattgg gccccaaatt ctcaccagtc cgtctccttc aaaatccatt 1020

ccaattccac agcccttccg accagcagat gaagatcatc gaaatcaatt tgggcaacga 1080

gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat ataaacacaa tagaacctgt caatattgat 1140

gacttgatta gagaccaagg atttcgtggt gatggaggat caaccacagg tttgtctgct 1200

accccccctg cctcattacc tggctcacta actaacgtga aagccttaca gaaatctcca 1260

ggacctcagc gagaaaggaa gtcatcttca tcctcagaag acaggaatcg aatgaaaaca 1320

cttggtagac gggactcgag tgatgattgg gagattcctg atgggcagat tacagtggga 1380

caaagaattg gatctggatc atttggaaca gtctacaagg gaaagtggca tggtgatgtg 1440

gcagtgaaaa tgttgaatgt gacagcacct acacctcagc agttacaagc cttcaaaaat 1500

gaagtaggag tactcaggaa aacacgacat gtgaatatcc tactcttcat gggctattcc 1560

acaaagccac aactggctat tgttacccag tggtgtgagg gctccagctt gtatcaccat 1620

ctccatatca ttgagaccaa atttgagatg atcaaactta tagatattgc acgacagact 1680

gcacagggca tggattactt acacgccaag tcaatcatcc acagagacct caagagtaat 1740

aatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct agctacagag 1800

aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg 1860

gcaccagaag tcatcagaat gcaagataaa aatccataca gctttcagtc agatgtatat 1920

gcatttggaa ttgttctgta tgaattgatg actggacagt taccttattc aaacatcaac 1980

aacagggacc agataatttt tatggtggga cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag 2040

gtacggagta actgtccaaa agccatgaag agattaatgg cagagtgcct caaaaagaaa 2100

agagatgaga gaccactctt tccccaaatt ctcgcctcta ttgagctgct ggcccgctca 2160

ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcatcagaa ccctccttga atcgggctgg tttccaaaca 2220

gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat 2280

ggtgcgtttc ctgtccacgg aaagggcgaa ttcgttttcg agtctagagg gcccttcgaa 2340

caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat atgcataccg gtcatcatca ccatcaccat 2400

tga 2403

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 22

Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser

1 5

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 23

Leu Ile Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 24

Leu Met Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 25

Leu Leu Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 26

Leu Leu Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Val

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 27

Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Ile

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 28

Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Leu

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 29

Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Val

1 5 10

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 30

Ser Glu Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu

1 5 10

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 31

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

<210> 32

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 32

Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro

20 25

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 33

Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg

1 5 10 15

Trp Ser Gly Ser

20

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221> SITE

<222> ()..()

<223> 合成肽

<400> 34

Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp

1 5 10 15

Ser Gly Ser

Claims

1.一种包含肽或其药学上可接受的盐的组合物，所述肽具有下式

(a)R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2 SEQ ID NO：4，其中R1和R2独立缺失或是Ser、Gly或Cys用于偶联另外的肽或蛋白，其中AA2是取代或未取代的Ile且AA10是疏水残基；或

(b)R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2 SEQ ID NO：5，其中R1和R2独立缺失或是Ser、Gly或Cys用于偶联另外的肽或蛋白，其中AA2是疏水残基且AA10是取代或未取代的Gly、Val或Leu；或

(c)R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2 SEQ ID NO：6，其中R1和R2独立缺失或是Ser、Gly或Cys用于偶联另外的肽或蛋白，并且其中AA2是取代或未取代的Ile、Ala、Met或Leu，并且其中AA10是取代或未取代的Gly、Ile、Val或Leu。

2.根据权利要求1所述的组合物，还包含药学上可接受的媒介或载体。

3.根据权利要求1中(a)的组合物，其中AA10是取代或未取代的Gly、Val或Leu。

4.根据权利要求1中(b)的组合物，其中AA2是取代或未取代的Ile、Ala、Met或Leu。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽是

R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:7)；

R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:33)；

R1-Leu-Leu-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:9)；

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Ile-R2(SEQ ID NO:10)；

Rl-Leu-Met-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:11)；或

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:12)。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述式中的一个或多个所述氨基酸选自：D-氨基酸；氨基酸结构中含有α-碳的取代的氨基酸；氨基酸结构中含有β-碳的氨基酸；酰胺取代的氨基酸；被直链、支链、环或杂环C1-12烷基，直链、支链、环或杂环C1-12烷酰基取代的氨基酸。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述R1或R2是Cys。

8.根据权利要求1所述的组合物，还包含T辅助肽。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述T细胞肽偶联或融合在(a)、(b)或(c)的所述肽的N-或C-末端。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述T辅助肽是

(a)Ser-His-Gln-Phe-Glu-Gln-Leu-Ser-Gly-Ser-Ile-Leu-Trp-His-Ala SEQ ID NO:15；

(b)Glu-Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val SEQ ID NO:16；或

(c)Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val-Lys SEQ ID NO:17。

11.根据权利要求1所述的组合物，还包含融合或偶联在一起的相同所述肽(a)、(b)或(c)的多个拷贝。

12.根据权利要求9所述的组合物，还包含融合肽的多个拷贝，所述融合肽包含与T辅助肽融合或偶联的所述肽(a)、(b)或(c)。

13.根据权利要求11的所述组合物，包含由相同所述肽(a)、(b)或(c)的5至10个拷贝形成的多肽，所述肽在框架内或通过间隔序列融合。

14.根据权利要求12的所述组合物，包含由相同所述融合肽的5至10个拷贝形成的多肽，每个融合肽在框架内或通过间隔序列融合。

15.根据权利要求1所述的组合物，还包含脂质体。

16.根据权利要求1所述的组合物，还包含佐剂。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述佐剂是CPG或包封的PLG。

18.一种组合物，包含编码以下的核酸序列：

(a)R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2 SEQ ID NO:4，其中R1和R2独立缺失或是Ser、Gly或Cys用于偶联另外的肽或蛋白，并且其中AA2是取代或未取代的Ile且AA10是疏水残基；或

(b)R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2 SEQ ID NO:5，其中R1和R2独立缺失或是Ser、Gly或Cys用于偶联另外的肽或蛋白，并且其中AA2是疏水残基且AA10是取代或未取代的Gly、Val或Leu；

(c)R1-Leu-AA2-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-AA10-R2 SEQ ID NO:6，其中R1和R2独立缺失或是Ser、Gly或Cys用于偶联另外的肽或蛋白，并且其中AA2是取代或未取代的Ile、Ala、Met或Leu，且其中AA10是取代或未取代的Gly、Ile、Val或Leu；

(d)编码融合肽的肽或多肽，所述融合肽包含在N-或C-末端与T细胞肽融合的(a)、(b)或(c)的所述肽；或

(e)编码融合肽的肽或多肽，所述融合肽包含(a)、(b)、(c)或(d)的相同所述肽的至少两个拷贝。

19.根据权利要求18所述的组合物，还包含药学上可接受的媒介或载体。

20.根据权利要求18中(a)的组合物，其中AA10是取代或未取代的Gly、Val或Leu。

21.根据权利要求18中(b)的组合物，其中AA2是取代或未取代的Ile、Ala、Met或Leu。

22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述编码的肽(a)或(b)是

R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:7)；

R1-Leu-Ile-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:8)；

R1-Leu-Leu-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:9)；

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Ile-R2(SEQ ID NO:10)；

Rl-Leu-Met-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Gly-R2(SEQ ID NO:11)；或

R1-Leu-Ala-Thr-Glu-Lys-Ser-Arg-Trp-Ser-Val-R2(SEQ ID NO:12)。

23.根据权利要求18所述的组合物，其中所述R1或R2是Cys。

24.根据权利要求18所述的组合物，还包含编码T辅助肽的核酸序列。

25.根据权利要求18或24所述的组合物，其中所述T辅助肽是

(a)Ser-His-Gln-Phe-Glu-Gln-Leu-Ser-Gly-Ser-Ile-Leu-Trp-His-Ala SEQ ID NO:15；

(c)Asp-Leu-Thr-Val-Lys-Ile-Gly-Asp-Phe-Gly-Leu-Ala-Thr-Val-Lys SEQ ID NO:17。

26.根据权利要求18中(e)的组合物，其中所述核酸序列编码由5至10个相同的所述肽或融合肽通过间隔序列形成的多肽。

27.根据权利要求1所述的组合物，还包含结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的分子。

28.根据权利要求18所述的组合物，还包含结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂的分子，或编码所述抑制剂或分子的核酸序列。

29.根据权利要求27至28中任一项所述的组合物，其中所述检查点抑制剂是CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、OX40、CD27、CD40L、CD40、TIM3或TIM334。

30.一种用于治疗或延缓或预防哺乳动物受试者中黑色素瘤的发展的组合物，包含以下中的任何一个：

(a)基于BRAF_V600E的修饰肽或其药学上可接受的盐，和以下的至少一个：(a)T辅助肽和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子；

(b)编码基于BRAF_V600E的修饰肽的核酸序列，和以下的至少一个：(a)编码T辅助肽的核酸序列和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子；

(c)用下述物质预处理的树突细胞：基于BRAF_V600E的修饰肽或编码所述肽的核酸序列，以及以下的至少一个：(a)T辅助肽和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子；或

(d)权利要求1至29中任一项的组合物。

31.一种治疗或延缓或预防哺乳动物受试者中黑色素瘤发展的方法，包括以下中的任何一个：

(a)向所述受试者施用基于BRAF_V600E的修饰肽或其药学上可接受的盐，和以下的至少一个：(a)T辅助肽和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子；

(b)向所述受试者施用编码基于BRAF_V600E的修饰肽的核酸序列，和以下的至少一个：(a)编码T辅助肽的核酸序列和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子；

(c)向所述受试者施用用下述物质预处理的树突细胞：基于BRAF_V600E的修饰肽或编码所述肽的核酸序列，以及以下的至少一个：(a)T辅助肽和(b)结合检查点抑制剂的抗体或模拟检查点抑制剂功能的合成小分子；或

(d)向所述受试者施用权利要求1至29中任一项的任何组合物；

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述组合物以单剂量施用。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述组合物以自25微摩尔，包括25微摩尔，至250微摩尔的浓度的所述肽或编码权利要求1的肽的核酸序列施用。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物和检查点抑制剂通过肌肉内、腹膜内、静脉内、瘤内、口服或结内给药全身独立施用。

35.根据权利要求33所述的方法，还包括在用所述组合物治疗之前、期间或之后，用其他抗癌疗法治疗所述受试者，或在施用所述组合物之前用化学疗法治疗所述受试者。

36.一种组合物，包含用权利要求1至29中任一项的组合物离体预处理的重组树突细胞。