CN109061186A - 一种降钙素原检测试剂盒和降钙素原检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外检测技术领域,具体涉及一种降钙素原检测试剂盒和降钙素原检测方法。本发明所提供的降钙素原检测试剂盒,包括:降钙素原抗体包被的金磁微粒,碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体,以及化学发光底物;金磁微粒为以氧化铁为核表面包覆修饰有纳米金颗粒的磁性复合微粒。本发明采用金磁微粒作为磁性固相载体,降钙素原抗体一步偶联在金磁微粒表面,包被效率高,降钙素原抗体活性稳定,提高了检测试剂盒的灵敏度。本发明采用酶促化学发光底物,发光平台期长,发光持续性更稳定,与降钙素原抗体包被的金磁微粒协同作用,整体上提高了检测试剂盒的灵敏度、稳定性和重复性。
Description
技术领域
本发明属于体外检测技术领域,具体涉及一种降钙素原检测试剂盒和降钙素原检测方法。
背景技术
降钙素原(Procalcitonin,PCT)是一种由116个氨基酸组成,分子量大约为13kDa的蛋白,是降钙素(CT)的前肽物,无降钙素样的激素活性,其分子由降钙素、钙抑肽和一个含57个氨基酸的N末端碎片组成。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度,PCT在正常人血清中PCT含量极低(<0.05mg/L),其在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、癌症发热、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时PCT浓度不增加或轻微增加,但当细菌、真菌、寄生虫严重感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时其在血浆中的水平明显升高。因而,根据PCT的测定结果可作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。
降钙素原的测定方法众多,如化学发光免疫分析法(CLIA)、放射性免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA),但都有一定的缺陷。CLIA法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术,具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便,自动化程度高等优势,近年来得到了广泛应用。检测样本中的降钙素原抗原和超顺磁性微粒上包被的降钙素原抗体及酶标记的降钙素原抗体结合物反应,形成夹心(抗体-抗原-抗体)复合物。在磁场作用下,磁微粒吸附到反应管壁,未结合的物质被清洗液洗去。在反应混合物中加入化学发光底物液,测试结果以相对发光强度(RLU)表示。检测样本中的降钙素原抗原的量和分析仪光学***检测到的相对发光强度(RLU)之间成正比。
目前国内的化学发光免疫分析市场主要以进口的封闭式全自动化学发光检测***(试剂和仪器)为主,然而国内的PCT检测试剂起步较晚,其性能与经过几年甚至几十年优化的进口试剂一直存在着差距,特别是在重复性、稳定性和灵敏度上。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种降钙素原检测试剂盒,旨在解决现有PCT检测试剂灵敏度低,重复性和稳定性差的技术问题。
本发明提供了一种降钙素原检测试剂盒,包括:降钙素原抗体包被的金磁微粒,碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体,以及化学发光底物;
所述金磁微粒为以氧化铁为核表面包覆修饰有纳米金颗粒的磁性复合微粒。
与现有技术相比,本发明的降钙素原检测试剂盒的磁性固相载体为金磁微粒,降钙素原抗体通过与金磁微粒表面的静电作用、疏水相互作用以及氨基酸残基侧链巯基与金相互作用一步偶联在金磁微粒表面,包被效率高,降钙素原抗体活性稳定,提高了检测试剂盒的灵敏度。本发明化学发光底物为酶促化学发光底物,该发光体系成熟稳定,发光平台期长,发光持续性更稳定,与降钙素原抗体包被的金磁微粒协同作用,整体上提高了检测试剂盒的灵敏度、稳定性和重复性。
本发明还提供了一种降钙素原检测方法,包括:
提供上述降钙素原检测试剂盒,将待测样本、降钙素原抗体包被的金磁微粒和碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体混匀,孵育,得到夹心复合物;
将所述夹心复合物与化学发光底物混匀,进行化学发光反应,并采用发光检测仪进行检测其发光强度,计算待测样本中降钙素原的含量。
采用上述降钙素原检测方法检测降钙素原,操作简便,结果稳定准确。
具体实施方式
为了解决现有PCT检测试剂灵敏度低,重复性和稳定性差的技术问题。本发明实施例提供了一种降钙素原检测试剂盒,其在拥有较高的检测灵敏度的同时,还具有良好的重复性和稳定性。
本发明的一种降钙素原检测试剂盒,包括:降钙素原抗体包被的金磁微粒,碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体,以及化学发光底物;
金磁微粒为以氧化铁为核表面包覆修饰有纳米金颗粒的磁性复合微粒。
本发明的降钙素原检测试剂盒的磁性固相载体为金磁微粒,降钙素原抗体通过与金磁微粒表面的静电作用、疏水相互作用以及氨基酸残基侧链巯基与金相互作用一步偶联在金磁微粒表面,包被效率高,降钙素原抗体活性稳定,提高了检测试剂盒的检测灵敏度。本发明化学发光底物为酶促化学发光底物,该发光体系成熟稳定,发光平台期长,发光持续性更稳定,与降钙素原抗体包被的金磁微粒协同作用,整体上提高了检测试剂盒的检测灵敏度、稳定性和重复性。
在上述技术方案中,降钙素原抗体指的是降钙素原单克隆抗体或降钙素原多克隆抗体。
在本发明实施例中,在降钙素原抗体包被的金磁微粒中,降钙素原抗体与金磁微粒的重量比为(1~100):10。
当降钙素原抗体与金磁微粒的重量比过低时,金磁微粒上包被的抗体量过少,导致金磁微粒上较多的结合位点浪费,降低包被效率;当降钙素原抗体与金磁微粒的重量比过高时,过量的抗体竞争结合位点,反而降低抗体与金磁微粒的包被效率,提高本底值,降低信噪比,受到背景光的干扰较大。
在本发明实施例中,在碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体中,碱性磷酸酶与降钙素原单克隆抗体的质量比为(1~100):10,质量比过大或过小均会影响碱性磷酸酶与降钙素原单克隆抗体之间的标记效率。
在本发明实施例中,化学发光底物为APS-5((4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐)及其衍生物,或者为AMPPD(二氧杂环乙烷)及其衍生物。
APS-5和AMPPD均属于酶促化学发光底物,相较于AMPPD,APS-5具有更高的灵敏度,能够检测到少于10-19mol的AP分子;而且,发光时间短,可在极短时间内(10s)发光强度即达到峰值并在一段时间内保持稳定,因而能得到反应性高重复性好的测定结果。然而,AMPPD底物至少需15min,其发光强度才达到高峰;且APS-5反应性高,可提升检测试剂盒的检测范围,在测定高浓度样品时无需稀释;在22~35℃范围内,发光反应对温度不敏感,因而无需温度控制。
在本发明实施例中,化学发光底物APS-5或AMPPD的工作浓度优选为0.01~3ug/mL。化学发光底物的工作浓度过低时,底物反应性不达标,性能不好;化学发光底物的工作浓度过高时,底物用量较高,浪费资源,且信噪比增加。
进一步的,化学发光底物优选为APS-5。在工作时,常常将APS-5与pH6~10、0.1M~0.3M的Tris-HCl缓冲液共同配制成化学发光底物液。
在本发明实施例中,降钙素原检测试剂盒还包括:降钙素原校准品;其中,降钙素原校准品的浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL。
在本发明实施例中,碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体的制备方法为:
采用第一活化剂对降钙素原单克隆抗体进行活化处理,得到活化后的降钙素原单克隆抗体;
采用第二活化剂对碱性磷酸酶进行活化处理,即得活化后的碱性磷酸酶溶液;
将活化后的降钙素原单克隆抗体、MgCl2溶液和活化后的碱性磷酸酶溶液混合,于2~37℃反应4~16h,得到碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体;
其中,第一活化剂与降钙素原单克隆抗体的体积比为1:(10~100);第一活化剂占比过低,活化不完全;占比过高,浪费资源,且可能使抗体改性。
第二活化剂与ALP的体积比为1:(5~20);第二活化剂的占比过低,活化不完全;占比过高,浪费资源,且可能降低酶的活性。
MgCl2溶液与降钙素原单克隆抗体的体积比为1:(100~500);MgCl2占比过低,作用不够;MgCl2占比过高,浪费资源,且可能使酶标抗体活性降低。
进一步的,在对降钙素原单克隆抗体进行活化处理时,活化处理的温度为室温,处理时间优选为30min;在对碱性磷酸酶进行活化处理时,活化处理的温度为室温,处理时间优选为0~60min。活化时间过短,容易导致活化不完全;活化时间过长,可能降低酶和抗体的活性。
更进一步的,第一活化剂优选为2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液;
第二活化剂优选为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液。
在本发明实施例中,降钙素原抗体包被的金磁微粒的制备方法为:
将经过平衡处理的金磁微粒与PCT单克隆抗体在偶联缓冲液中振荡反应,然后进行封闭处理,得到包被有抗体的金磁微粒。
本发明实施例采用金磁微粒作为磁性固相载体,降钙素原抗体通过与金磁微粒表面的静电作用、疏水相互作用以及氨基酸残基侧链巯基与金相互作用一步偶联在金磁微粒表面,不需要共价偶联剂,包被时可以一步偶联到位,操作过程简单,时间短。
进一步的,振荡反应的温度为4~42℃,反应时间为0.5~12h。反应的温度和时间,必须在合理的范围内,否者包被效率降低,甚至导致抗体失活。
进一步的,封闭处理为:在2~42℃下封闭1~24h。
封闭的温度过低和/或时间过短,会导致封闭不完全,最终导致试剂盒非特异性吸附现象严重;封闭的温度过高,又会使抗体活性下降;封闭时间过长则又浪费资源。
进一步的,金磁微粒的粒径优选为0.1~2μm,更优选为0.5~1.2μm。当磁珠的粒径大于2μm时,磁珠比表面积减少,检测灵敏度低;当磁珠的粒径小于0.1μm时,影响磁分离效果。
基于上述降钙素原检测试剂盒,本发明还提供了一种降钙素原检测方法,包括:
将待测样本、降钙素原抗体包被的金磁微粒和碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体混匀,孵育,得到夹心复合物;
将夹心复合物和化学发光底物混匀,进行化学发光反应,并采用发光检测仪进行检测,并记录其发光强度,计算待测样品中降钙素原的含量。
在本发明实施例中,化学发光底物为AMPPD及其衍生物时,化学发光底物加热到30~50℃温育10~60s后,再与夹心复合物的混匀。
AMPPD的反应时间长,平台期短,导致检测时间较长,在一定反应时间内其灵敏度和稳定性相对于APS-5来说较差。本发明在实际研发过程中,创造性地发现对AMPPD适当加热可提高AMPPD的反应速度,反应值较高。
在本发明实施例中,化学发光底物为APS-5及其衍生物时,化学发光底物和夹心复合物的混匀在常温下进行。
APS-5在22~35℃范围内,发光反应对温度不敏感,因而无需温度控制。因而,相对于AMPPD来说,本申请采用APS-5的可操作性更强。
更进一步的,本发明的降钙素原检测方法,具体包括以下步骤:
a)采用降钙素原校准品进行曲线校正,并用第三方质控品进行质量控制,测试结果在质控范围内方可进行样本的检测;
b)取PCT标准品、质控品和待测样本分解加入三个不同的离心管底部,然后在每一离心管中加入等量的降钙素原抗体包被的金磁微粒,再在每一离心管中加入等量的碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体,盖上离心管盖,混匀,轻轻振荡试管架30s后,置37℃水浴15min;
c)将各离心管置于磁分离器上,沉淀2min,用移液器吸出上清液,再加入洗涤液重复洗涤3遍,接着加入已于45℃下温育30s的化学发光底物液,混匀10s,迅速用发光检测仪进行检测,并记录其发光强度。
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
以下实施例中所采用的金磁微粒购自陕西北美基因股份有限公司。
实施例1
本实施例提供了一种降钙素原检测试剂盒,其制备包括以下步骤:
1、降钙素原(PCT,procalcitonin)单克隆抗体包被金磁微粒
1)取金磁微粒,用0.5mL的偶联缓冲液清洗3次,以平衡金磁微粒的pH,加入含PCT单克隆抗体的偶联缓冲液0.5mL,置于摇床反应(120rpm,4℃,120min);反应完毕后,将反应液进行磁性分离,弃上清,得到包被有抗体的金磁微粒。
2)用0.5mL的偶联缓冲液清洗两次金磁微粒,再加入1mL封闭液,放入恒温培养振荡器反应(120rpm,37℃,2h),进行封闭;封闭完全后,进行磁性分离弃上清,用PBST清洗3次;最后,将金磁微粒保存在l mL PBS中,颠倒混匀,4℃保存备用。
其中,降钙素原单克隆抗体与金磁微粒的重量比为5:3。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记的降钙素原单克隆抗体溶液
1)降钙素原单克隆抗体预装在尖底试管里,加入12mg/mL的第一活化剂,混匀,在室温下放置30min,得到活化后的降钙素原单克隆抗体;
2)碱性磷酸酶(ALP)预先装在尖底试管里,再加入第二活化剂,混匀,并在室温下放置15min,即得活化后的碱性磷酸酶溶液;
3)在活化后的降钙素原单克隆抗体中加入1M的MgCl2溶液,再继续加入活化后的碱性磷酸酶溶液,于4℃反应15h,得到碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体;然后,往其中加入50%甘油并于-20℃下保存。
其中,第一活化剂选为2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液,第一活化剂为降钙素原单克隆抗体体积的1/100;
第二活化剂选为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶液,第二活化剂的体积为ALP体积的1/20;
MgCl2溶液的加入量为降钙素原单克隆抗体体积的1/500;
碱性磷酸酶与降钙素原单克隆抗体的质量比为1:1。
3、化学发光底物液的配制
1)称取Tris 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.001g和Proclin-300 0.2ml,置于1L规格的烧杯中,用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;然后,用4M HCl或4M NaOH调节pH 8.5,再定容至1000ml,用0.45um滤器过滤,得到稀释缓冲液。
2)取(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐(APS-5)作为化学发光底物,加入稀释缓冲液,配制成浓度为1ug/mL的化学发光底物液,在常温环境下使用。
4、降钙素原校准品
取降钙素原(标准级,纯度不低于90%),采用Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH7.5)将其依次稀释成浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL的降钙素原溶液。
5、10×浓缩洗涤液的配制
称取Tris 12.14g、NaCl 325.6g和5g Tween-20,置于1L容器中。用移液器将Proclin-300量取0.2ml置于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中。用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解。用4M HCL或4M NaOH调节pH 7.35~7.45,最后定容1000ml,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
6、偶联缓冲液的配制
称取2.428g Tris、2.925g NaCl和0.5g KCl,溶解于800mL超纯水中,用0.1M碳酸钾或0.1M盐酸调节pH 8.5;再加入1mL防腐剂Proclin-300,超纯水定容至1L,灭菌,待用。使用前,用超纯水10倍稀释。
7、封闭液的配制
取500mL的PBST,加入10mg的BSA,加1mL防腐剂PC300。
8、底物稀释液的配制
称量121.1g Tris置于1L烧杯中,加入约800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加入浓HCl调节pH值到8.5,最后将溶液定容至1L。
实施例2
本实施例提供了一种降钙素原检测试剂盒,其制备包括以下步骤:
1、降钙素原(PCT,procalcitonin)单克隆抗体包被金磁微粒
1)取金磁微粒,用0.5mL的偶联缓冲液清洗3次,以平衡金磁微粒的pH,加入含PCT单克隆抗体的偶联缓冲液0.5mL,置于摇床反应(120rpm,4℃,120min);反应完毕后,将反应液进行磁性分离,弃上清,得到包被有抗体的金磁微粒;
2)用0.5mL的偶联缓冲液清洗两次金磁微粒,再加入1mL封闭液,放入恒温培养振荡器反应(120rpm,4℃过夜),进行封闭;封闭完全后,进行磁性分离弃上清,用PBST清洗3次;最后,将金磁微粒保存在l mL PBS中,颠倒混匀,4℃保存备用。
其中,降钙素原单克隆抗体与金磁微粒的重量比为5:3。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记的降钙素原单克隆抗体溶液
1)降钙素原单克隆抗体预装在尖底试管里,加入12mg/mL的第一活化剂,混匀,在室温下放置30min,得到活化后的降钙素原单克隆抗体;
2)碱性磷酸酶(ALP)预先装在尖底试管里,再加入第二活化剂,混匀,并在室温下放置15min,即得活化后的碱性磷酸酶溶液;
3)在活化后的降钙素原单克隆抗体中加入1M的MgCl2溶液,再继续加入活化后的碱性磷酸酶溶液,于4℃反应16h,得到碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体;然后,往其中加入50%甘油并于-20℃下保存。
其中,第一活化剂选为2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液,第一活化剂为降钙素原单克隆抗体体积的1/100;
第二活化剂选为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶液,第二活化剂的体积为ALP体积的1/20;
MgCl2溶液的加入量为降钙素原单克隆抗体体积的1/500;
碱性磷酸酶与降钙素原单克隆抗体的质量比为1:2。
3、化学发光底物液的配制
1)称取Tris 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml,置于1L规格的烧杯中,用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;然后,用4M HCl或4M NaOH调节pH 9.5,再定容至1000ml,用0.45um滤器过滤,得到稀释缓冲液。
2)取二氧杂环乙烷(AMPPD)作为化学发光底物,加入稀释缓冲液,配置成浓度为2ug/mL的化学发光底物液,在加热环境(37~42℃)中使用。
步骤4至步骤8与实施例1基本一致。
对比例1
本对比例提供了一种降钙素原检测试剂盒,其制备包括以下步骤:
1、PCT单克隆抗体包被磁微粒
1)将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ul DMSO中,取2mg PCT单克隆抗体溶于pH 9.5的0.1mol/L CB缓冲液中至总体积为1ml,得到抗体溶液。
2)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1)的抗体溶液中,室温静置90min,然后将溶液加入到Centricon-10浓缩管中,再放入到高速冷冻离心机中浓缩至体积为0.5ml。
3)取10mg磁微粒,加入5ml规格的反应杯中,经磁铁吸附后去上清,再用pH9.5、0.1mol/L CB清洗3次。将磁珠加入到步骤2)中浓缩后的抗体溶液中,混匀,室温反应4h,保持混匀状态。之后,加入1mol/L的Tris溶液,37℃静置15min,得到PCT单克隆抗体包被的磁微粒。
其中,Tris的加样量为1mg抗体加0.15ml Tris。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记的降钙素原单克隆抗体溶液
3、取APS-5作为化学发光底物,加入稀释缓冲液,配制浓度为1ug/mL的化学发光底物液。
4、配制浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL的降钙素原溶液。
对比例2
本对比例提供了一种降钙素原检测试剂盒,其制备包括以下步骤:
1、PCT单克隆抗体包被磁微粒
步骤与对比例1基本相同,此处不再一一赘述。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记的降钙素原单克隆抗体溶液
3、AMPPD作为化学发光底物,配制浓度为2ug/mL的化学发光底物液。在常温环境下使用。
4、配制浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL的降钙素原溶液。
对比例3
本对比例提供了一种降钙素原检测试剂盒,其制备包括以下步骤:
1、PCT单克隆抗体包被金磁微粒
步骤与实施例1基本相同,此处不再一一赘述。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记的降钙素原单克隆抗体溶液
3、AMPPD作为化学发光底物,配制浓度为2ug/mL的化学发光底物液。在常温环境下使用。
4、配制浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL的降钙素原溶液。
采用发光检测仪,分别对本发明实施例1和对比例1~3的降钙素原检测试剂盒进行测定,检测其灵敏度、稳定性和重复性,具体实验过程和实验结果如下:
1)灵敏度
取浓度为零的降钙素原校准品为检测样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值作为相对发光值,计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD。根据检测样本与相邻浓度的降钙素校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD的RLU值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为灵敏度(最低检测限)。
2)重复性
用浓度为0.5(±0.1)ng/mL的重复性参考品进行检测,检测10次,计算10次测量结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M×100%得出变异系数CV,记录0.5ng/mL处的CV。
3)检测范围
参考市面上口碑最好的罗氏诊断PCT试剂的参考范围,在其基础上进行增减,得到对比例试剂盒的检测范围和本发明试剂盒的检测范围。
4)稳定性考核
准备足够量的本发明试剂和对比例试剂,置于37℃避光保存,在第10天取出,与未进行考核的同批试剂对同一检测样本进行测试,结果计算活性改变率。
表1为检测结果,本发明检测试剂盒的最低检测限低至0.01ng/ml,灵敏度高;而且,本发明检测试剂盒在37℃避光保存10天后,活性改变率仅为-8.1%,稳定性优异。对比例1和实施例1的区别仅在于磁微粒的不同,然而其灵敏度高至0.05ng/ml,检测范围只有0-200ng/ml,且其活性改变率高达-18.4%,说明本发明降钙素原检测试剂盒采用金磁微粒作为磁性固相载体,在提高灵敏度的同时,还提高了检测试剂盒的检测范围和稳定性。对比例2和对比例3的区别也仅在于磁微粒的不同,对比例3采用金磁微粒作为磁性固相载体,其灵敏度、重复性和稳定性均明显优于对比例2。
实施例2和对比例3的区别仅在于:实施例2在使用化学发光底物AMPPD时,是在加热环境(30~50℃)后使用。说明本发明通过在使用AMPPD作为发光底物时对其进行适当加热,可加快其反应速度,提高反应性,改善试剂盒的重复性。
表1
实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
灵敏度 | 0.01ng/ml | 0.02ng/ml | 0.05ng/ml | 0.05ng/ml | 0.02ng/ml |
重复性 | 2.4% | 3.8% | 7.4% | 12.4% | 4.9% |
检测范围 | 0-500ng/ml | 0-400ng/ml | 0-200ng/ml | 0-200ng/ml | 0-300ng/ml |
稳定性 | -8.2% | -8.1% | -18.4% | -31% | -26.1% |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种降钙素原检测试剂盒,其特征在于,包括:降钙素原抗体包被的金磁微粒,碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体,以及化学发光底物;
所述金磁微粒为以氧化铁为核表面包覆修饰有纳米金颗粒的磁性复合微粒。
2.根据权利要求1所述的降钙素原检测试剂盒,其特征在于,在所述降钙素原抗体包被的金磁微粒中,所述降钙素原抗体与所述金磁微粒的质量比为(1~100):10。
3.根据权利要求1所述的降钙素原检测试剂盒,其特征在于,在所述碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体中,所述碱性磷酸酶与所述降钙素原抗体的质量比为(1~100):10。
4.根据权利要求1所述的降钙素原检测试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物为APS-5及其衍生物,或者为AMPPD及其衍生物。
5.根据权利要求1至4任一项所述的降钙素原检测试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物的工作浓度为0.01~3μg/mL。
6.根据权利要求1至4任一项所述的降钙素原检测试剂盒,其特征在于,还包括:降钙素原校准品;
所述降钙素原校准品的浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL。
7.根据权利要求1至4任一项所述的降钙素原检测试剂盒,其特征在于,所述金磁微粒的粒径为0.1~2μm。
8.一种降钙素原检测方法,其特征在于,包括:
提供权利要求1至7任一项所述的降钙素原检测试剂盒,将待测样本、降钙素原抗体包被的金磁微粒和碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体混匀,孵育,得到夹心复合物;
将所述夹心复合物与化学发光底物混匀,进行化学发光反应,并采用发光检测仪进行检测其发光强度,计算待测样本中降钙素原的含量。
9.根据权利要求8所述的降钙素原检测方法,其特征在于,所述化学发光底物为AMPPD及其衍生物时,将所述化学发光底物加热至30~50℃,然后与所述夹心复合物混匀。
10.根据权利要求8所述的降钙素原检测方法,其特征在于,所述化学发光底物为APS-5及其衍生物时,所述化学发光底物和夹心复合物的混匀在常温下进行。
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