CN109060761A - 具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法与装置 - Google Patents
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Abstract
根据本发明的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法与装置，装置包括窄带滤光片、分束镜、第一频率调制器、第一反射镜、第二反射镜、二分之一波片、偏振分光棱镜、第二频率调制器、二向色镜、多面体棱镜、二维振镜、第一透镜单元、聚焦物镜、滤光片、第二透镜单元、光阑、光纤、光谱仪。本发明通过同时构建两束正交的线偏振光照明，利用频率调制来区分线偏振光聚焦后形成光斑的重叠情况，用多面体棱镜来实现提高多焦点扫描成像速度的目的，利用光谱仪的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的光斑的重叠区域对应的有效信号，实现提高三维空间分辨率，并通过窄带滤光片、滤光片阻挡散射光及杂散光来实现高分辨率的拉曼光谱扫描成像。
Description
技术领域
本发明属于光学技术领域，具体涉及一种具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法与装置。
背景技术
光学成像由于具有非接触、非破坏性特点，被广泛应用于生命科学、材料科学等研究领域。而光学分辨率则是光学成像***的一个重要指标，通常分辨率越高越好。光学分辨率包括横向分辨率和轴向分辨率，这两者之间会彼此限制。即横向分辨率越高、轴向分辨率越低；轴向分辨率越高，横向分辨率越低。因此，如何提高横向分辨率与轴向分辨率是研究人员持续努力的目标。如果能够同时实现高横向分辨率与高轴向分辨率则具有重要应用价值。
利用线偏振光的矢量特性在光学显微成像等领域中有重要的研究意义。例如，共焦显微镜***是物象共轭的点对点成像，聚焦的激光束在样品表面扫描，同时光电检测器件接收样品反射的荧光(或透射的荧光)，样品结构的变化使激发的荧光强度改变，因而使光电检测器的输出电流改变，经过信号处理，同步显示在计算机屏幕上。由于照射的线偏振光通过高数值孔径的透镜聚焦，产生的是面积很小的椭圆光斑。如果沿椭圆光斑短轴方向对样品扫描，根据瑞利判据，共焦显微镜扫描步长为两倍椭圆短轴距离时，光电探测器即可响应反射光强度的改变，即分辨出两点的差异，***分辨率很高。如果沿椭圆光斑长轴方向对样品扫描，且扫描步长小于两倍椭圆长轴距离时，根据瑞利判据，光电探测器将不能响应反射光强度的改变，无法分辨出两点的差异。因此***的分辨率决定于聚焦光斑长轴大小。在先技术中,参见“K.A.Serrels，E.Ramsay，R.J.Warburton and D.T.Reid，Nanoscaleoptical microscopy in the vectorial focusing regime，nature photonics，vol.2，May2008,311-314”，为了提高分辨率，在扫描长轴方向时机械的***二分之一波片改变入射线偏振光的偏振方向，但是这会降低***改变扫描方向时的扫描速率及***分辨精度，而且由于其中一束入射光多经过了一次二分之一波片，因此这两束正交偏振光的入射功率不同，从而使聚焦光束功率发生变化，会增加***误差，***稳定性不高。
拉曼光谱是指入射光经样品反射后频率发生变化而形成的光谱，不同的物质具有不同的拉曼光谱，因此拉曼光谱分析法可以用于对物质进行定性及鉴别，在各行各业都有着广泛的应用。
显微拉曼光谱仪是一种将拉曼光谱技术与显微成像技术结合在一起的高端分析仪器，通常需要不断提高拉曼光谱成像的图像横向分辨率、轴向分辨率和成像速度。拉曼光谱的图像横向分辨率和轴向分辨率就是显微镜成像***的空间横向分辨率和轴向分辨率。拉曼光谱的成像速度是指显微镜成像***逐点扫描构成一帧图像的时间。因此，高端显微拉曼光谱仪是拉曼光谱技术与共焦扫描显微成像技术的集合体。然而由于拉曼光产生的机理原因，显微成像***的物镜通常不能够采用液体浸没物镜。因为液体浸没物镜的液体(例如油)会污染被测样品，甚至液体本身也会被照明光激发出拉曼光，干扰被测样品的拉曼光。所以显微拉曼光谱仪中的显微成像***通常用干式物镜，而不能用液体浸没物镜。这就使得显微拉曼光谱仪的的图像横向分辨率和轴向分辨率不能够通过采用液体浸没物镜来提高。另外，由于被测样品激发出的拉曼光非常弱，因此光谱仪中的探测器必须曝光较长时间才能收集到足够强度的拉曼信号。这就使得显微拉曼光谱仪中显微镜成像***逐点扫描的时间较长，拉曼光谱成像速度比较慢。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种具三维高空间分辨率的高速拉曼光谱扫描成像方法与装置，通过一种有效的光学结构，同时构建两束偏振方向正交的线偏振光照明，并且利用双光束的频率调制来区分两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域与其它非重叠区域，利用多面体棱镜产生单列、等距的多焦点来实现提高多焦点扫描成像速度的目的，利用光谱仪接收信号的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域对应的有效信号，实现提高三维空间分辨率的目的，利用窄带滤光片使激光单色性更好、利用Notch滤光片阻挡激光的散射光和样品的荧光等杂散光、利用光阑进一步消除杂散光，实现具有三维高空间分辨率的高速拉曼光谱扫描成像的目的。
本发明提供了一种具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像装置，具有这样的特征，包括窄带滤光片、分束镜、第一频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、第二频率调制器、二向色镜、多面体棱镜、二维振镜、第一透镜单元、聚焦物镜、第一滤光片、第二透镜单元、光阑、光纤、光谱仪，其中，窄带滤光片、分束镜、第一反射镜沿第一光轴线依次设置，分束镜、第一频率调制器、第二反射镜沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，第一反射镜、第一频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行，第二反射镜、偏振分光棱镜、第二频率调制器、二向色镜、多面体棱镜以及二维振镜沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置，二维振镜、第一透镜单元、聚焦物镜沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置，二向色镜、第一滤光片、第二透镜单元、光阑、光纤以及光谱仪沿与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，第一透镜单元、第二透镜单元均包括一个透镜或多个透镜的组合。
在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像装置中，其特征在于，还包括设置在第二光轴线上且位于第一频率调制器与第二反射镜之间的第三透镜单元，第三透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。
本发明提供了一种具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于,包括以下步骤：
步骤1，将窄带滤光片、分束镜、第一反射镜沿第一光轴线依次设置；
步骤2，将分束镜、第一频率调制器、第二反射镜沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；
步骤3，将第一反射镜、第一频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行；
步骤4，将第二反射镜、偏振分光棱镜、第二频率调制器、二向色镜、多面体棱镜以及二维振镜沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置；
步骤5，将二维振镜、第一透镜单元、聚焦物镜以及样品沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置；
步骤6，将二向色镜、第一滤光片、第二透镜单元、光阑、光纤以及光谱仪沿与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，其中，第一滤光片面对二向色镜的反射面；
步骤7，一束沿第一光轴线方向进行入射的第一方向入射线偏振光经过窄带滤光片、分束镜后输出两束具有第一方向线偏振光的第一光束和第二光束；
步骤8，第一光束沿第二光轴线方向经过第一频率调制器施加载频f1后输出第一载频光束，第一载频光束经第二反射镜反射沿第四光轴线方向经过偏振分光棱镜透射输出第一载频透射光束，第二光束沿第一光轴线方向经过第一反射镜反射后，沿第三光轴线方向经过第一频率调制器施加载频f2后输出第二载频光束，第二载频光束经过二分之一波片后输出第二方向线偏振光，第二方向线偏振光经过偏振分光棱镜反射后输出沿第四光轴线方向的第二载频反射光束；
步骤9，第一载频透射光束和第二载频反射光束叠加合成输出具有混合第一方向和第二方向的线偏振态载频混合光束；
步骤10，线偏振态载频混合光束经过第二频率调制器后，输出多束具有不同载频的混合载频平行光；
步骤11，多束具有不同载频的混合载频平行光经过二向色镜进入多面体棱镜后，输出多束混合载频折射光束；
步骤12，多束混合载频折射光束经过二维振镜、第一透镜单元、聚焦物镜后在样品上产生多个聚焦光斑；
步骤13，多个聚焦光斑激发样品产生荧光、拉曼光以及杂散光，形成多个与聚焦光斑对应的荧光光斑、拉曼光光斑以及杂散光光斑；
步骤14，多个拉曼光光斑、荧光光斑、以及杂散光光斑经过聚焦物镜、第一透镜单元、二维振镜、多面体棱镜、二向色镜、第一滤光片、第二透镜单元、光阑后，荧光光斑、杂散光光斑被阻挡，多个拉曼光光斑在光纤上形成一个拉曼光聚焦光斑，并被与光纤相连的光谱仪接收；
步骤15，利用频率解调算法，提取出光谱仪接收的重叠的具有载频f1、f2以及其它载频的拉曼光谱信号，并通过分析光谱仪上的拉曼光谱的强度并随着二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。
在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，第一方向线偏振光与第二方向线偏振光为正交。
另外，在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，多面体棱镜为具有底面和多个棱面的柱体，其横截面为多边形，混合载频平行光的方向与底面垂直且混合载频平行光先进入底面，聚焦光斑为一维阵列分布，聚焦光斑的数量与棱面的数量相同。
另外，在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，第一透镜单元用于光束变换，将从多面体棱镜出射的多束混合载频折射光束始终充满聚焦物镜的入瞳，实现聚焦物镜的最佳成像性能，第一透镜单元包括两个光束变换透镜或多个光束变换透镜的组合，二向色镜与第四光轴线的夹角为45度，第一滤光片为Notch滤光片。
另外，在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，当多面体棱镜为具有底面和多个棱面的锥棱镜，棱镜的底面与混合载频平行光方向垂直，聚焦光斑为二维阵列分布，聚焦光斑的数量与棱面的数量相同。
另外，在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，还包括设置在第二光轴线上且位于第一频率调制器与第二反射镜的用于提高轴向分辨率的第三透镜单元。
另外，在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，第三透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合，用于将第一载频光束的聚焦平面与第二载频光束的聚焦平面分开一定距离。
另外，在本发明提供的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，利用频率解调算法，提取出光谱仪接收的重叠的具有载频f1、f2以及其它载频的拉曼光谱信号，并通过分析光谱仪上的拉曼光谱的强度并随着二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号，从而重构出反映样品信息的三维图像。
发明的作用与效果
本发明的具有三维高空间分辨率的高速拉曼光谱扫描成像方法与装置，通过一种有效的光学结构，同时构建两束偏振方向正交的线偏振光照明，并且利用双光束的频率调制来区分两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域与其它非重叠区域，利用多面体棱镜产生单列、等距的多焦点来实现提高多焦点扫描成像速度的目的，利用光谱仪接收信号的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域对应的有效信号，实现提高三维空间分辨率的目的，利用窄带滤光片使激光单色性更好、利用Notch滤光片阻挡激光的散射光和样品的荧光等杂散光、利用光阑进一步消除杂散光，实现具有三维高空间分辨率的高速拉曼光谱扫描成像的目的。
另外，也可以在帧速和单帧图像像素数不变的情况下，提高每个点的曝光时间，增加拉曼信号强度。理论上，相比于传统的单点扫描拉曼光谱成像，对于相同帧速和像素数的一帧图像，N个聚焦光斑的多点扫描成像可以使每个点的曝光时间增加N倍，从而使拉曼信号强度增加N倍。也可以在单帧图像像素数和每个点曝光时间不变的情况下，提高帧速。可以在帧速和每个点曝光时间不变的情况下，提高单帧图像的像素数。理论上，相比于传统的单点扫描拉曼光谱成像，对于相同像素的一帧图像和相同的每个点曝光时间，N个聚焦光斑的多点扫描拉曼光谱成像的成像速度可以提高N倍；对于帧速和每个点曝光时间相同的情况，一帧图像的像素数可以提高N倍。例如，可以将当前行业中单点激光共聚焦扫描拉曼光谱成像的典型参数512*512像素/帧、帧速1帧/10分钟，提高为512*512像素/帧、帧速N帧/10分钟,或者为512*512N像素/帧、帧速1帧/10分钟。
附图说明
图1是本发明的实施例中利用双光束线偏振光的矢量特性与频率调制来提高横向分辨率的原理示意图；
图2是本发明的实施例中利用双光束的频率调制来提高轴向分辨率的原理示意图；
图3是本发明的实施例中基于双光束频率调制的三维高分辨率高速拉曼光谱扫描成像示意图；以及
图4是本发明的实施例中扫描样品时提高分辨率同时提高成像速度的示意图；
图5是本发明的实施例二中三棱镜的光束示意图；
图6是本发明的实施例二中样品上的聚焦光斑分布示意图；
图7是本发明的实施例三中棱镜剖面及聚焦光斑分布示意图；
图8是本发明的实施例四中棱镜剖面及聚焦光斑分布示意图；
图9是本发明的实施例五中棱镜剖面及聚焦光斑分布示意图；以及
图10是本发明的实施例六中立体棱镜及聚焦光斑分布示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法与装置作具体阐述。
实施例一
如果光学***采用线偏振相干光照明，对于高数值孔径光学***，其聚焦平面上的聚焦光斑分布显著受照明光的偏振特性影响。如图1所示，如果采用y方向线偏振相干光照明，其聚焦平面上的聚焦光斑为椭圆形分布，且椭圆的短轴与线偏振光的方向(此时为y方向)垂直，即此时椭圆的短轴方向沿x方向。如果采用x方向线偏振相干光照明，则聚焦平面上的椭圆聚焦光斑的短轴方向沿y方向。光学***横向分辨率决定于聚焦光斑的尺寸。显然，如果采用y方向线偏振相干光照明，则光学***x方向具有更高的横向分辨率；如果采用x方向线偏振相干光照明，则光学***y方向具有更高的横向分辨率。显然，如果能够同时利用y方向线偏振光和x方向线偏振光照明，根据叠加原理，则聚焦平面上的聚焦光斑分布为图1中右图所示，显然其阴影区域同时在x方向和y方向具有更小的尺寸部分，如果用阴影区域作为有效聚焦光斑，则能够在x方向和y方向显著提高横向分辨率。不过，此时图1中右图所示非阴影区域也会恶化横向分辨率。为了解决这个问题，我们将y方向线偏振相干光照明施加频率为f1的载频(称为照明光1z)，x方向线偏振相干光照明施加频率为f2的载频(称为照明光2z)，那么图1中右图所示阴影区域光斑的载频为f1+f2，其它非阴影区域的载频分别为f1和f2。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的拉曼光信号也存在载频f1+f2，通过频率解调算法，则可以提取出载频f1+f2的拉曼光信号。从而达到提高横向分辨率的目的。
正如在图1中，我们将y方向线偏振相干光照明施加频率为f1的载频(称为照明光1z)，x方向线偏振相干光照明施加频率为f2的载频(称为照明光2z)，同时在照明光1z中增加一个透镜，微调其聚焦平面，使照明光1z的聚焦平面与照明光2z的聚焦平面分开一定距离，则如图2所示，照明光1z的聚焦光斑(虚线区域)与照明光2z的聚焦光斑在轴向(z轴)方向分开一定距离，图中阴影区域光斑的载频为f1+f2，其它非阴影区域的载频分别为f1和f2。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的拉曼光信号也存在载频f1+f2，通过频率解调算法，则可以提取出载频f1+f2的拉曼光信号。从而达到提高轴向分辨率的目的。
如图3所示，图3所在的平面为yz面，x轴垂直于yz面。具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像装置包括分束镜1、频率调制器2、透镜单元3、反射镜4，反射镜5、二分之一波片6，偏振分光棱镜7、频率调制器8、二向色镜9、多面体棱镜10、二维振镜11、透镜12、透镜13、聚焦物镜14、Notch滤光片16、透镜单元17、光阑18、光纤19、光谱仪20、窄带滤光片21。
其中，透镜单元3、透镜单元17均为一个透镜或多个透镜的组合。多面体棱镜10为柱体棱镜，其横截面为具有底边和多条棱边的多边形，多面体棱镜的作用是产生多束与光轴(y轴)有一定夹角的平行光束。
本实施例中，光束变换透镜单元包括透镜12、透镜13，透镜单元3、16均为单透镜，多面体棱镜为图5所示的三棱镜10，光束g的方向与底边垂直且光束g先进入底边，聚焦光斑的数量与棱边的数量相同。
如图3所示，窄带滤光片21、分束镜1、反射镜5沿第一光轴线依次设置，分束镜1、频率调制器2、透镜3、反射镜4沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，反射镜5、频率调制器2、二分之一波片6以及偏振分光棱镜7沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行，反射镜4、偏振分光棱镜7、频率调制器8、二向色镜9、多面体棱镜10、以及二维振镜11沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置，二维振镜11、透镜12、透镜13、聚焦物镜14、样品15沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置，二向色镜9、Notch滤光片16、透镜单元17、光阑18、光纤19以及光谱仪20沿与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置,Notch滤光片16面对二向色镜9的反射面。
一束y方向的线偏振光经过分束镜1后分成光束Ⅰ和光束Ⅱ两束偏振光。实施例中，入射的线偏振光为激光，y方向线偏振光光束Ⅰ经过频率调制器2后被施加了载频f1，经过第二透镜3聚焦、第二反射镜4反射，经过偏振分光棱镜7透射后输出第一载频透射光束，y方向线偏振光光束Ⅱ经过反射镜5反射后被频率调制器2施加了载频f2，光束Ⅱ经过二分之一波片6后变为x方向线偏振光，经过偏振分光棱镜7反射后与第一载频透射光束叠加合成输出具有混合第一方向和第二方向的线偏振态载频混合光束，该混合载频光束经过频率调制器8后，输出多束具有不同载频的混合载频平行光；实施例中，多面体棱镜10为三棱镜，该混合载频光束通过频率调制器8后输出具有载频f3和f4的混合载频平行光，该混合载频平行光经过二向色镜9进入多面体棱镜10后，输出多束混合载频折射光束；多束混合载频折射光束经过二维振镜11、透镜12、透镜13、聚焦物镜14后聚焦到样品15上。入射激光最终通过聚焦物镜14聚焦的样品15上时会同时激发出荧光和拉曼光。荧光是一种弹性散射，拉曼光是一种非弹性散射。荧光信号强度远远强于拉曼光(大约是100万倍)。拉曼光是一种非常弱的信号。激光共聚焦显微镜探测的是荧光信号，而显微拉曼光谱仪则是探测拉曼信号。因此显微拉曼光谱仪通常就是在共焦显微镜中添加合适的滤光片来滤除荧光，通过拉曼光，使拉曼光进入光谱仪形成拉曼光谱。光谱仪替换了共焦显微镜的探测器。另外，入射激光通过聚焦物镜14聚焦的样品15上散射回来的光可以看作三种，即荧光、拉曼光，以及成像***中各个元器件表面、机械器件表面对激光散射导致的杂散光。这三种光中拉曼光远远弱于其它两种光。因此必须使用合适的滤光片和光阑等光机结构来阻挡荧光和入射激光的杂散光。
根据光路传输的可逆原则，多束混合载频折射光束通过聚焦物镜14后在样品15上产生的具有不同调制频率的聚焦光斑激发样品15上的荧光、拉曼光以及杂散光，形成多个与聚焦光斑对应的荧光光斑、拉曼光光斑以及杂散光光斑；多个拉曼光光斑、荧光光斑、以及杂散光光斑经过聚焦物镜14、透镜13、透镜12、、二维振镜11、多面体棱镜10、二向色镜9、Notch滤光片16、透镜单元17、光阑18后，荧光光斑、杂散光光斑被阻挡，多个拉曼光光斑在光纤19上形成一个拉曼光聚焦光斑，并被与光纤19相连的光谱仪20接收；利用频率解调算法，提取出光谱仪20接收的重叠的具有载频f1、f2以及其它载频的拉曼光聚焦光斑信号，并通过分析光谱仪20上的拉曼光聚焦光斑的强度并随着二维振镜11的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号，从而重构出反映样品15信息的二维图像。
频率调制器2用于对光束Ⅰ和光束Ⅱ分别施加不同的载频。频率调制器2可以是液晶斩波器、机械斩波器，或者其它能够给入射光束实时频率调制的方案。
透镜单元3可以为单透镜，也可以为透镜组，其作用是使光束Ⅰ的聚焦面与光束Ⅱ的聚焦面在轴向分离一定的距离，在轴向形成类似图2的两个聚焦光斑。照明光1z的聚焦光斑(虚线区域)与照明光2z的聚焦光斑在轴向(z轴)方向分开一定距离，图中阴影区域光斑的载频为f1+f2，其它非阴影区域的载频分别为f1和f2。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的拉曼光信号也存在载频f1+f2，通过频率解调算法，则可以提取出载频f1+f2的拉曼光信号。从而达到提高轴向分辨率的目的。
二分之一波片6的作用是使光束Ⅱ的线偏振态相对于光束Ⅰ的线偏振态方向旋转90°，从而使二分之一波片6的出射光束Ⅱ的线偏振态与光束Ⅰ的线偏振态方向正交。因此光束Ⅰ与光束Ⅱ经过偏振棱镜7后就相当于合成了一束光，该光束具有两个正交的线偏振态，光束Ⅰ与光束Ⅱ均为线偏振光，实施例中，光束Ⅰ的线偏振态与光束Ⅱ的线偏振态正交，且光束Ⅰ与光束Ⅱ是同时产生的，这两者的聚焦光斑同时聚焦的样品上。
频率调制器8用于对线偏振态载频混合光束施加不同的载频，实施例中为f3和f4。
二向色镜9放在多面体棱镜10与频率调制器8之间，用于将返回的拉曼光信号反射至透镜17后聚焦耦合进入光纤19，并且经过光纤19进入光谱仪20，在光谱仪中的探测器上形成拉曼光谱；实施例中，二向色镜9与第四光轴线的夹角为45度。
二维振镜11由两个一维振镜通过机械方式固定为正交布置方式，一维振镜可以为检流计振镜或者共振振镜，如Cambridge Technology公司Galvanometer Optical Scanner6230H，与CRS 8kHz Resonant Scanner。
透镜12、透镜13组成一个光束变换透镜组，其作用是起光束变换作用，使三棱镜10出射的两束斜入射平行光始终充满聚焦物镜14的入瞳，实现聚焦物镜14的最佳成像性能。在实际应用中，透镜12、透镜13组成的第一透镜单元并不一定由图3示意图所示的两个透镜组成，可以为更多个透镜组成，来实现光束变换的作用。
Notch滤光片16是一种基于体布拉格光栅原理的高通滤光片，用于阻挡成像***中激光的散射光和样品15上的荧光等杂散光。
光阑18可以是一个光阑，也可以是多个光阑组成的多级光阑。由于拉曼信号非常弱，远远小于样品15上散射的荧光和由于成像***中各个元器件表面、机械器件表面对激光散射导致的杂散光，所以需要利光阑18来阻挡各种杂散光，使杂散光不能够进入光谱仪20，从而使微弱的拉曼光能够被光谱仪20探测。
窄带滤光片21是拉曼光谱仪中的必备光学元件，用于对入射激光滤波，使激光具有更好的单色性，提高拉曼光谱的分辨率。
实施例中，透镜单元3、透镜单元15均为单透镜，频率调制器2采用液晶斩波器，二维振镜11中的两个一维振镜均采用共振振镜。
通过合适选择透镜3的光学参数，透镜3可以使光束Ⅰ的聚焦平面与光束Ⅱ的聚焦平面分开一定距离，在轴向(z轴方向)形成图2所示的聚焦光斑。由于带有载频f1的光束Ⅰ是y方向线偏振，带有载频f2的光束Ⅱ是x方向线偏振，所以光束Ⅰ与光束Ⅱ在样品15上聚焦成的横向聚焦光斑如图1右图所示。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的荧光信号也存在载频f1+f2，荧光信号经过聚焦物镜14、透镜12、透镜11、二维振镜11、二向色镜9反射，再通过透镜18聚焦到光纤19上，并被与光纤19相连的光谱仪20接收。通过频率解调算法，则可以提取出光谱仪20接收的载频f1+f2以及其它载频的拉曼光聚焦光斑信号。因此，带有载频f1的y方向线偏振光束Ⅰ与带有载频f2的x方向线偏振光束Ⅱ在样品15上的三维方向(横向与轴向)形成的有效聚焦光斑(载频为f1+f2的阴影区域光斑)显著小于未采用本发明专利时的聚焦光斑，从而能够显著提高三维分辨率(横向和轴向)。
通过分析光谱仪20的拉曼光光谱强度随着二维振镜11的扫描变化，同时利用频率解调算法，就可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号如图4中局部放大图D，从而重构出如图4所示的反映样品信息的三维图像(假设扫描n行n列个点)，同时利用多面体棱镜在聚焦物镜的聚焦面上产生阵列聚焦光斑，实现多点同时扫描成像，显著提高了激光共聚焦扫描拉曼光谱成像的帧速，达到高速成像的目的。
一种基于多面体棱镜及光束调频高分辨率高速成像装置方法，包括以下步骤：
步骤1，将窄带滤光片21、分束镜1、第一反射镜5沿第一光轴线依次设置；
步骤2，将分束镜1、频率调制器2、透镜单元3、反射镜4沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；
步骤3，将反射镜5、频率调制器2、二分之一波片6以及偏振分光棱镜7沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行；
步骤4，将反射镜4、偏振分光棱镜7、频率调制器8、二向色镜9、多面体棱镜10以及二维振镜11沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置；
步骤5，将二维振镜11、透镜12、透镜13、聚焦物镜14以及样品15沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置；
步骤6，二向色镜9、Notch滤光片16、透镜单元17、光阑18、光纤19以及光谱仪20沿与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，其中，Notch滤光片16面对二向色镜9的反射面；
步骤7，一束沿第一光轴线方向进行入射的第一方向入射线偏振光经过分束镜1后输出两束具有第一方向线偏振光的第一光束和第二光束；
步骤8，第一光束沿第二光轴线方向经过频率调制器2施加载频f1后输出第一载频光束，第一载频光束经反射镜4反射沿第四光轴线方向经过偏振分光棱镜7透射输出第一载频透射光束，
第二光束沿第一光轴线方向经过反射镜5反射后，沿第三光轴线方向经过频率调制器2施加载频f2后输出第二载频光束，第二载频光束经过二分之一波片6后输出第二方向线偏振光，第二方向线偏振光经过偏振分光棱镜7反射后输出沿第四光轴线方向的第二载频反射光束；
步骤9，第一载频透射光束和第二载频反射光束叠加合成输出具有混合第一方向和第二方向的线偏振态载频混合光束；
步骤10，线偏振态载频混合光束经过频率调制器8后，输出多束具有不同载频的混合载频平行光；
步骤11，多束具有不同载频的混合载频平行光经过二向色镜9进入多面体棱镜10后，输出多束混合载频折射光束；
步骤12，多束混合载频折射光束经过二维振镜11、透镜12、透镜13、聚焦物镜14后在样品15上产生多个聚焦光斑；
步骤13，多个聚焦光斑激发样品15产生荧光、拉曼光以及杂散光，并形成多个与聚焦光斑对应的荧光光斑、拉曼光光斑以及杂散光光斑；
步骤14，多个拉曼光光斑、荧光光斑、以及杂散光光斑经过聚焦物镜14、透镜13、透镜12、二维振镜11、多面体棱镜10、二向色镜9、Notch滤光片16、透镜单元17、光阑18后，荧光光斑、杂散光光斑被阻挡，多个拉曼光光斑在光纤19上形成一个拉曼光聚焦光斑，并被与光纤19相连的光谱仪20接收；
步骤15，利用频率解调算法，提取出光谱仪20接收的重叠的具有载频f1、f2以及其它载频的拉曼光谱信号，并通过分析光谱仪20上的拉曼光谱的强度并随着二维振镜11的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号，从而重构出反映样品15信息的三维图像。
实施例二
如图5所示，入射光g，折射光为g1、g2，如果三棱镜8的两个棱面m1和m2与底面的夹角分别为θ1和θ2，三棱镜9的折射率为n，则可以得到棱面m1的折射光g1与第一光轴线(z轴)夹角为θ1′＝asin(nsinθ1-θ1),如图6所示，聚焦光斑A到第五光轴线(x轴)的距离h1＝fsin[asin(nsinθ1-θ1)]，其中f是聚焦物镜2的焦距。同理，聚焦光斑B到第五光轴线的距离h2＝fsin[asin(nsinθ2-θ2)]。因此，可以通过三棱镜的折射率为n、棱面m1、m2与z轴的夹角，以及聚焦透镜13的焦距f可以精确控制聚焦光斑的位置。如果平面m1与m2关于第一光轴线不对称，则聚焦光斑A与聚焦光斑B的强度不同。聚焦光斑A与聚焦光斑B的强度决定于棱面m1、m2的面积与整个入射光束截面积之比。
实施例三
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图7中左面所示的多面体棱镜。该多面体棱镜为四面柱体棱镜，具有底面和三个棱面，三个棱面沿第一光轴线对称设置。
本实施例中聚焦光斑分布为：在样品15上形成如图7中右面的三个在xy平面上沿着y轴排列的聚焦光斑。如果棱面与光束g垂直且沿第一光轴线对称设置，经过该棱面得到的聚焦光斑在坐标轴的原点上。
进一步地，假设共焦扫描成像最终要得到一辐n行n列的图像，利用本实施例的多面体棱镜产生3个点的列分布焦点，则只需扫描n/3行，成像速度可以比现有的单焦点成像速度提高3倍。
实施例四
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图8中左面所示的多面体棱镜。该多面体棱镜为五面柱体棱镜，具有底面和四个棱面，四个棱面沿第一光轴线对称设置。
本实施例中聚焦光斑分布为：在样品15上形成如图8中右面的四个在xy平面上沿着y轴排列的聚焦光斑。
进一步地，假设共焦扫描成像最终要得到一幅n行n列的图像，利用本实施例的多面体棱镜产生四个点的列分布焦点，则只需扫描n/4行，成像速度可以比现有的单焦点成像速度提高4倍。
实施例五
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图9中左面所示的多面体棱镜。该多面体棱镜为六面柱体棱镜，具有底面和五个棱面，五个棱面沿第一光轴线对称设置。
本实施例中聚焦光斑分布为：在样品15上形成如图9中右面的五个在xy平面上沿着y轴排列的聚焦光斑。
进一步地，假设共焦扫描成像最终要得到一幅n行n列的图像，利用本实施例的多面体棱镜产生五个点的列分布焦点，则只需扫描n/5行，成像速度可以比现有的单焦点成像速度提高5倍。
实施例六
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图10中左面所示的多面体棱镜。该多面体棱镜为锥棱镜，具有底面和四个棱面，四个棱面沿轴线y旋转设置，则产生关于z轴旋转分布的二维阵列的聚焦光斑。
本实施例中聚焦光斑分布为：在样品15上形成如图10中右面的四个在xy平面上沿着x、y轴均布排列的聚焦光斑。
如果多面体棱镜的面沿着两个维度进行变化，得到二维阵列的聚焦光斑。
实施例的作用与效果
本实施例的具三维高空间分辨率的高速拉曼光谱扫描成像装置，通过一种有效的光学结构，同时构建两束偏振方向正交的线偏振光照明，并且利用双光束的频率调制来区分两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域与其它非重叠区域，利用多面体棱镜产生单列、等距的多焦点来实现提高多焦点扫描成像速度的目的，利用光谱仪接收信号的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域对应的有效信号，实现提高三维空间分辨率的目的，利用窄带滤光片使激光单色性更好、利用Notch滤光片阻挡激光的散射光和样品的荧光等杂散光、利用光阑进一步消除杂散光，实现具有三维高空间分辨率的高速拉曼光谱扫描成像的目的。
进一步地，实施例中还包括设置在第二光轴线上且位于频率调制器与第二反射镜的用于提高轴向分辨率的第三透镜单元。其作用是使光束Ⅰ的聚焦面与光束Ⅱ的聚焦面在轴向分离一定的距离，在轴向形成两个聚焦光斑，提高轴向分辨率。从而实现提高三维分辨率的目的。
进一步地，当多面体棱镜为三棱镜时，如果利用三棱镜产生2个点的列分布焦点，则只需扫描n/2行，成像速度可以比现有的成像速度提高1倍。
进一步地，当多面体棱镜为四棱镜时，如果利用四棱镜产生3个点的列分布焦点，则只需扫描n/3行，成像速度可以比现有的成像速度提高3倍。
进一步地，也可以在帧速和单帧图像像素数不变的情况下，提高每个点的曝光时间，增加拉曼信号强度。理论上，相比于传统的单点扫描拉曼光谱成像，对于相同帧速和像素数的一帧图像，N个聚焦光斑的多点扫描成像可以使每个点的曝光时间增加N倍，从而使拉曼信号强度增加N倍。也可以在单帧图像像素数和每个点曝光时间不变的情况下，提高帧速。可以在帧速和每个点曝光时间不变的情况下，提高单帧图像的像素数。理论上，相比于传统的单点扫描拉曼光谱成像，对于相同像素的一帧图像和相同的每个点曝光时间，N个聚焦光斑的多点扫描拉曼光谱成像的成像速度可以提高N倍；对于帧速和每个点曝光时间相同的情况，一帧图像的像素数可以提高N倍。例如，可以将当前行业中单点激光共聚焦扫描拉曼光谱成像的典型参数512*512像素/帧、帧速1帧/10分钟，提高为512*512像素/帧、帧速N帧/10分钟,或者为512*512N像素/帧、帧速1帧/10分钟。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像装置，其特征在于，包括：窄带滤光片、分束镜、第一频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、第二频率调制器、二向色镜、多面体棱镜、二维振镜、第一透镜单元、聚焦物镜、第一滤光片、第二透镜单元、光阑、光纤、光谱仪，
其中，所述窄带滤光片、所述分束镜、所述第一反射镜沿第一光轴线依次设置，
所述分束镜、所述第一频率调制器、所述第二反射镜沿与所述第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，
所述第一反射镜、所述第一频率调制器、所述二分之一波片以及所述偏振分光棱镜沿与所述第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，所述第三光轴线与所述第二光轴线平行，
所述第二反射镜、所述偏振分光棱镜、所述第二频率调制器、所述二向色镜、所述多面体棱镜以及所述二维振镜沿与所述第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置，
所述二维振镜、所述第一透镜单元、所述聚焦物镜沿与所述第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置，
所述二向色镜、所述第一滤光片、所述第二透镜单元、所述光阑、所述光纤以及所述光谱仪沿与所述第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，
所述第一透镜单元、所述第二透镜单元均包括一个透镜或多个透镜的组合。
2.根据权利要求1所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像装置，其特征在于，还包括：
设置在所述第二光轴线上且位于所述第一频率调制器与所述第二反射镜之间的第三透镜单元，
所述第三透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。
3.一种具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，利用权利要求1所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像装置，其特征在于,包括以下步骤：
步骤1，将所述窄带滤光片、所述分束镜、所述第一反射镜沿第一光轴线依次设置；
步骤2，将所述分束镜、所述第一频率调制器、所述第二反射镜沿与所述第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；
步骤3，将所述第一反射镜、所述第一频率调制器、所述二分之一波片以及所述偏振分光棱镜沿与所述第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，所述第三光轴线与所述第二光轴线平行；
步骤4，将所述第二反射镜、所述偏振分光棱镜、第二频率调制器、所述二向色镜、所述多面体棱镜以及所述二维振镜沿与所述第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置；
步骤5，将所述二维振镜、所述第一透镜单元、所述聚焦物镜以及样品沿与所述第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置；
步骤6，将所述二向色镜、所述第一滤光片、所述第二透镜单元、所述光阑、所述光纤以及所述光谱仪沿与所述第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，其中，所述第一滤光片面对所述二向色镜的反射面；
步骤7，一束沿所述第一光轴线方向进行入射的第一方向入射线偏振光经过所述窄带滤光片、所述分束镜后输出两束具有第一方向线偏振光的第一光束和第二光束；
步骤8，所述第一光束沿所述第二光轴线方向经过所述第一频率调制器施加载频f1后输出第一载频光束，所述第一载频光束经所述第二反射镜反射沿所述第四光轴线方向经过所述偏振分光棱镜透射输出第一载频透射光束，
所述第二光束沿所述第一光轴线方向经过所述第一反射镜反射后，沿所述第三光轴线方向经过所述第一频率调制器施加载频f2后输出第二载频光束，所述第二载频光束经过所述二分之一波片后输出第二方向线偏振光，所述第二方向线偏振光经过所述偏振分光棱镜反射后输出沿所述第四光轴线方向的第二载频反射光束；
步骤9，所述第一载频透射光束和所述第二载频反射光束叠加合成输出具有混合第一方向和第二方向的线偏振态载频混合光束；
步骤10，所述线偏振态载频混合光束经过所述第二频率调制器后，输出多束具有不同载频的混合载频平行光；
步骤11，多束具有不同载频的所述混合载频平行光经过所述二向色镜进入所述多面体棱镜后，输出多束混合载频折射光束；
步骤12，多束所述混合载频折射光束经过所述二维振镜、所述第一透镜单元、所述聚焦物镜后在所述样品上产生多个聚焦光斑；
步骤13，所述多个聚焦光斑激发所述样品产生荧光、拉曼光以及杂散光，并形成多个与所述聚焦光斑对应的荧光光斑、拉曼光光斑以及杂散光光斑；
步骤14，多个所述拉曼光光斑、所述荧光光斑、以及所述杂散光光斑经过所述聚焦物镜、所述第一透镜单元、所述二维振镜、所述多面体棱镜、所述二向色镜、所述第一滤光片、所述第二透镜单元、所述光阑后，所述荧光光斑、所述杂散光光斑被阻挡，多个所述拉曼光光斑在所述光纤上形成一个拉曼光聚焦光斑，并被与所述光纤相连的所述光谱仪接收；
步骤15，利用频率解调算法，提取出所述光谱仪接收的重叠的具有载频f1、f2以及其它载频的所述拉曼光谱信号，并通过分析所述光谱仪上的所述拉曼光谱的强度并随着所述二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。
4.根据权利要求3所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，所述第一方向线偏振光与所述第二方向线偏振光为正交。
5.根据权利要求3所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，所述多面体棱镜为具有底面和多个棱面的柱体，其横截面为多边形，所述混合载频平行光的方向与所述底面垂直且所述混合载频平行光先进入所述底面，所述聚焦光斑为一维阵列分布，所述聚焦光斑的数量与所述棱面的数量相同。
6.根据权利要求3所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，所述第一透镜单元用于光束变换，将从所述多面体棱镜出射的多束所述混合载频折射光束始终充满所述聚焦物镜的入瞳，实现所述聚焦物镜的最佳成像性能，
所述第一透镜单元包括两个光束变换透镜或多个光束变换透镜的组合，
所述二向色镜与所述第四光轴线的夹角为45度，
所述第一滤光片为Notch滤光片。
7.根据权利要求3所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，当所述多面体棱镜为具有底面和多个棱面的锥棱镜，所述棱镜的底面与所述混合载频平行光方向垂直，所述聚焦光斑为二维阵列分布，所述聚焦光斑的数量与所述棱面的数量相同。
8.根据权利要求3所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，所述步骤2中，还包括设置在所述第二光轴线上且位于所述第一频率调制器与所述第二反射镜的用于提高轴向分辨率的第三透镜单元。
9.根据权利要求8所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，所述第三透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合，用于将所述第一载频光束的聚焦平面与所述第二载频光束的聚焦平面分开一定距离。
10.根据权利要求8或9所述的具有三维高空间分辨率高速拉曼光谱扫描成像方法，其特征在于：
其中，利用频率解调算法，提取出所述光谱仪接收的重叠的具有载频f1、f2以及其它载频的所述拉曼光谱信号，并通过分析所述光谱仪上的所述拉曼光谱的强度并随着所述二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的拉曼光信号，从而重构出反映样品信息的三维图像。
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Effective date of registration: 20220429 Address after: 430000 R & D building / unit 1, modern service base, Science Park, Huazhong University of science and technology, No. 13-1, University Park Road, Wuhan East Lake New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province, 215-28, floors 2-3, floors 5-15 Patentee after: Wuhan Feipu Photoelectric Technology Co.,Ltd. Address before: No. 412, floor 4, building 66, No. 14, Huayuan North Road, Haidian District, Beijing 100094 Patentee before: Beijing Qinghu Information Technology Co.,Ltd. |
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