CN110229910A - Myd88基因l265p突变检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MYD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法，涉及基因检测技术领域，试剂盒包括两对引物和两个探针；两对所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑SEQ ID No.4所示；两个所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明提供的MYD88基因L265P突变检测试剂盒可以检测MYD88外显子L265P突变，检测结果准确，使用简单、快捷，可满足突变的快速检测。相较于传统测序方法结果的符合率为100％，检测方法的灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。

Description

MYD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种MYD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法。

背景技术

髓样分化因子88(myeloid differentiation factor，MYD88)是细胞质里一种可溶性衔接蛋白，属于Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)/白介素－1受体(interleukin-1 receptor，IL-1R)家族和死亡结构域(death domain，DD)家族成员，介导大多数Toll样受体、白介素－1受体、白介素－18受体细胞信号传导。近年来在多种B细胞肿瘤中发现有功能活化的MYD88 L265P基因突变，这种突变导致下游细胞信号通路的异常激活，与肿瘤发生发展密切相关。

利用MYD88基因在临床上可对肿瘤(包括癌前病变)进行诊断，预后评估和治疗。通过检测基因突变来推测肿瘤所处的阶段和分化的程度，从而对病情和预后进行评估。随着现在医药行业的发展，已开发出针对肿瘤病变的多种阻断细胞信号通路的药物，但是在使用这些药物时需要确保该信号通路的下游信号分子没有发生激活突变，而这往往正是现在医疗行业需面对的问题。因此，急需一种快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本的MYD88基因突变检测来辅助这些药物的临床运用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种检验快且简便的、灵敏度高且特异性强的MYD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：MYD88基因L265P突变检测试剂盒，包括两对引物和两个探针；

两对所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示；

两个所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

本发明还提供了MYD88基因L265P突变检测方法，包括以下步骤：

采用上述的MYD88基因L265P突变检测试剂盒中配置PCR反应体系，将配置好的PCR反应体系放在荧光PCR扩增仪中，进行检测；

荧光PCR扩增反应条件：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环，后30个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

本发明的有益效果在于：本发明提供的MYD88基因L265P突变检测试剂盒可以检测MYD88外显子L265P突变，检测时间仅需90分钟，检测结果准确，使用简单、快捷，可满足突变的快速检测。相较于传统测序方法结果的符合率为100％，本发明提供的MYD88基因L265P突变检测方法，其灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，相对于现有的试剂盒，不仅可用于检测新鲜组织样品DNA，还可用于检测来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的短片段DNA，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。

附图说明

图1所示为本发明具体实施方式的MYD88基因L265P突变阴性对照样品检测曲线图；

图2所示为本发明具体实施方式的MYD88基因L265P突变的样品检测曲线图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：以人类MYD88基因L265P的L265P突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地检测MYD88基因L265P突变。

请参照图1至图2所示，本发明的本发明的一种MYD88基因L265P突变检测试剂盒，包括两对引物和两个探针；

两对所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示；

两个所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

表1

	引物名称	序列(5’→3’)	碱基数
				SEQ ID No.1	M-M-F	GTGCCCATCAGAAGCGT	17
SEQ ID No.2	M-M-R	AAGGCGAGTCCAGAACC	17
				SEQ ID No.3	E-4-F	GACTCTGAAGATGTACCTATGGTCC	25
SEQ ID No.4	E-4-R	CTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCTGT	24
					探针名称
SEQ ID No.5	M-P-C-FAM	FAM-CACTGTCTGCGACTACACCA-BHQ	20
				SEQ ID No.6	E-4-P-VIC	FAM-TGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTA-BHQ	24

本发明还提供了一种MYD88基因L265P突变检测方法，包括以下步骤：

采用上述的MYD88基因L265P突变检测试剂盒中配置PCR反应体系，将配置好的PCR反应体系放在荧光PCR扩增仪中，进行检测；

荧光PCR扩增反应条件：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环，后30个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的MYD88基因L265P突变检测试剂盒可以检测MYD88外显子L265P突变，检测时间仅需90分钟，检测结果准确，使用简单、快捷，可满足突变的快速检测。相较于传统测序方法结果的符合率为100％，本发明提供的MYD88基因L265P突变检测方法，其灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，不仅可用于检测新鲜组织样品DNA，还可用于检测来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的短片段DNA，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。

进一步的，所述荧光报告基团为：FAM，所述淬灭基团为：BHQ。

进一步的，上述MYD88基因L265P突变检测试剂盒中，还包括1×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP和MgCl₂。

进一步的，所述Taq酶的工作浓度为5U，dNTP的工作浓度为10mM，MgCl₂的工作浓度为25mM。

进一步的，所述引物和探针的工作浓度为50mM。

实施例1：

MYD88基因L265P突变检测试剂盒，包含表2所示的成分；

表2

序号	成分	浓度	数量
				1	1×PCR缓冲液	1×	1
2	MgCl<sub>2</sub>	25mM	1
				3	dNTPs	10mM	1
4	M-M-F	50μM	1
				5	M-M-R	50mM	1
6	M-P-C-FAM	50mM	1
				7	E-4-F	50mM	1
8	E-4-R	50mM	1
				9	E-4-P-VIC	50mM	1
10	Taq酶	5U	1
				11	H<sub>2</sub>O	纯化水	1

其中，所述M-M-F、M-M-R、M-P-C-FAM、E-4-F、E-4-R和E-4-P-VIC的核苷酸序列见表1所示。

实施例2：

1)样本选择

取45份健康的无偿献血者全血样品、45份临床淋巴瘤样品(包括新鲜组织、石蜡切片)，实验用细胞系3株和1个质粒，分别为H460(MYD88基因野生型)和L265P突变质粒，以野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以L265P突变质粒为阳性对照模板，以纯水为阴性对照。

2)样品处理和模板提取

样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。

新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。

蜡块样品切成5-8μm切片，取5片，或取已经制成的5-8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。

全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。

3)反应体系配置

利用实施例1所提供的试剂盒，配置表3所示的反应体系；

表3

序号	物料	物料浓度	用量(μL)
				1	1×PCR缓冲液	1×	10
2	MgCl<sub>2</sub>	25mM	8
				3	dNTPs	10mM	5
4	M-M-F	50μM	2
				5	M-M-R	50mM	0.1
6	M-P-C-FAM	50mM	0.1
				7	E-4-F	50mM	0.1
8	E-4-R	50mM	0.1
				9	E-4-P-VIC	50mM	0.1
10	Taq酶	5U	0.5
				11	H<sub>2</sub>O	纯化水	19
12	DNA模板	2ng/ul	5
				13	总体积	-	50

其中，引物和探针的核苷酸序列如表1所示。

4)检测

按上述反应体系配制并上机检测，荧光PCR扩增反应条件：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环。

采用Mx3000P实时荧光PCR扩增仪(StrataGene公司)后30个循环退火阶段检测FAM和HEX或ROX荧光信号，一次可以检测92份样品(包括阴、阳性对照)。其中，也可使用Mx3005P荧光PCR扩增仪或ABI 7500荧光PCR扩增仪。

5)结果判断

根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct>18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性。

前述45份健康献血者全血样品以及细胞系H460(MYD88基因野生型)和L265P突变质粒经本发明的体系检测，只有L265P突变质粒有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。

6)灵敏度分析

将突变型L265P突变质粒从10的4次方连续10倍梯度稀释，分别为10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。

7)选择性能力分析

固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将L265P突变质粒DNA和野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。

A:50％即为10的3次方L265P突变细胞DNA。

B:30％取A液60μL后混入40μL 10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

C:20％取A液40μL后混入60μL 10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

D:15％取B液50μL后混入50μL10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

E:10％取C液50μL后混入50μL 10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

F:5％取E液50μL后混入50μL10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

G:1％取F液20μL后混入80μL 10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

H:0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

I:0.1％取H液20μL后混入80μL 10的3次方L265P突变细胞DNA，震荡混均。

结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为1％。

7)重复性试验

每个反应分别加入突变L858R质粒DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。

实施例3：

收集手术切除的淋巴瘤样本，全血和血浆样本以及胸水样本共45例，其中30组织样品，5例血浆，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。

使用实施例2的步骤1)-步骤5)对上述样本进行检测，同时对上述45例样本进行DNA测序。

对于MYD88基因的L265P突变，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：45例样品中有12例发生L265P的L265P突变，33例均为野生型。

综上所述，本发明提供的MYD88基因L265P突变检测试剂盒可以检测MYD88外显子L265P突变，检测时间仅需90分钟，检测结果准确，使用简单、快捷，可满足突变的快速检测。相较于传统测序方法结果的符合率为100％，本发明提供的MYD88基因L265P突变检测方法，其灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，不仅可用于检测新鲜组织样品DNA，还可用于检测来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的短片段DNA，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心）

<120> MYD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcccatca gaagcgt 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggcgagtc cagaacc 17

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gactctgaag atgtacctat ggtcc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttcttgcta agtcctgagc ctgt 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cactgtctgc gactacacca 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtgatttgc cttctagaac agta 24

Claims (5)

1.MYD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，包括两对引物和两个探针；

两对所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示；

两个所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的MYD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为：FAM，所述淬灭基团为：BHQ。

3.根据权利要求1所述的MYD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，还包括1×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP和MgCl₂。

4.根据权利要求1所述的MYD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，所述引物和探针的工作浓度为50mM。

5.一种MYD88基因L265P突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用权利要求1-4所述的MYD88基因L265P突变检测试剂盒配置PCR反应体系，将配置好的PCR反应体系放在荧光PCR扩增仪中，进行检测；

荧光PCR扩增反应条件：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环，后30个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。