CN116024186A - 一种虾青素合成酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虾青素合成酶突变体SEQ ID NO:5，与野生型虾青素合成酶SEQ ID NO:3相比，其促进虾青素合成的能力显著提升，能够用于虾青素生产菌比如红发夫酵母的改造。

Description

一种虾青素合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种虾青素合成酶突变体及其在提高微生物生产菌、尤其是红发夫酵母生产虾青素能力中的用途。

背景技术

虾青素化学名为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，是一种脂溶性酮式类胡萝卜素，它广泛存在于虾、蟹、鱼、鸟、某些藻类及真菌等生物中。虾青素具有极强的抗氧化能力，其抗氧化性是β-胡萝卜素的10倍(Antioxidant activities of astaxanthinand related carotenoids.Journal of Agricultural and Food Chemistry 2000,48(4):1150-1154)，可以清除二氧化氮、二硫化物等，也可以有效地抑制自由基引起的脂质过氧化作用。它具有多种生物活性，包括抗肿瘤作用、抗炎性和提高免疫力等功效(Antitumoractivity of astaxanthin and its mode of action.Nutrition and Cancer-aninternational journal 2000,36(1):59-65)。此外，在治疗心血管疾病、神经***疾病和糖尿病等方面，虾青素也具备潜在应用价值。近年来，虾青素在保健品、医药、化妆品、食品添加剂以及水产养殖等方面需求持续上涨，预计2025年全球市场规模达到25.7亿美元(Metabolic engineering of Escherichia coli for high-level astaxanthinproduction with high productivity.Metabolic Engineering 2018,49:105-115)。

化学合成的虾青素主要用作饲料添加剂，不能供人使用。天然虾青素可供人使用，但产量低，远不能满足市场需求，而且价格昂贵。虾、蟹等甲壳类水产品废弃物是虾青素来源之一，但原料大批量收集存在一定困难。目前，通过藻类或酵母发酵合成虾青素是国内外的研究热点，具有极好的开发前景。

红发夫酵母(Phaffia rhodozyma或者Xanthophyllomyces dendrorhous)是合成类胡萝卜素的天然宿主之一，其中虾青素的占比能够达到85％以上，被认为是重要的虾青素工业化生产的细胞工厂。但是，野生型红发夫酵母中虾青素含量低于细胞干重的1％，需要改造以提高虾青素产量。

发明内容

为了提高红发夫酵母的虾青素生产能力，发明人将来源于红发夫酵母的野生虾青素合成酶基因转入红发夫酵母中，利用随机突变及高通量筛选的方法获得了虾青素产量提高的突变菌株，研究发现是虾青素合成酶发生了突变。通过将回补实验将突变体基因转入，转化子的虾青素产量有明显提高，证实了该突变酶能够促进红发夫酵母生产虾青素。具体而言，本发明包括如下技术方案。

本发明的第一个方面提供了一种虾青素合成酶，其为选自下组的多肽：

(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:5的多肽；

(2)与SEQ ID NO:5有90％以上同源性、优选95％以上、优选96％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:5提高的多肽。

MFILVLLTGALGLAAFSWASIAFFSLYLAPRRSSLYNLQGPNHTNYFTGNFLDILSARTGEEHAKYREKYGSTLRFAGIAGAPVLNSTDPKVFNHVMKEAYDYPKPGMAARVLRIATGDGVVTAEGEAHKRHRRIMIPSLSAKAVKSMVPIFLEKGMELVDKMMEDAAEKDMAVGESAGEKKATRLETEGVDVKDWVGRATLDVMALAGFDYKSDSLQNKTNELYVAFVGLTDGFAPTLDSFKAIMWDFVPYFRTMKRRHEIPLTQGLAVSRRVGIELMEQKKQAVLGSASDQAVDKKDVQGRDILSLLVRANIAANLPESQKLSDEEVLAQISNLLFAGYETSSTVLTWMFHRLSEDKAVQDKLREKICQIDTDMPTLDELNALPYLEAFVKESLRLDPPSPYANRECLKDEDFIPLAEPVIGRDGSVINEVRITKGTMVMLPLFNINRSKFIYGEDEEEFRPERWLEDVTDSLNSIEAPYGHQASFISGPRACFGWRFAVAEMKAFSFVTLRRVQFEPIISPPEYEHITLIISRPRIVGREKEGYQMRLQVKPVE(SEQ ID NO:5)。

本发明的第二个方面提供了一种多核苷酸，其为编码上述多肽的基因。

优选地，编码SEQ ID NO:5的基因为SEQ ID NO:4所示的多核苷酸、或者与SEQ IDNO:4有90％以上、优选95％以上、优选96％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。

本发明的第三个方面提供了上述的多肽、或者上述的基因在促进微生物生产虾青素中的用途。

具体地，上述微生物可通过发酵生产虾青素。上述微生物是虾青素生产菌，例如是红发夫酵母。

本发明的第四个方面提供了一种虾青素生产菌，其表达上述的基因，优选其基因组中包含上述的基因。

优选地，所述虾青素生产菌是红发夫酵母。

在一种实施方式中，上述微生物是一种工程菌，即微生物宿主菌基因组中原有的虾青素合成酶编码基因被上述的基因替换；或者所述微生物宿主菌基因组中整合了上述的基因。

上述编码基因的整合可以是通过将包含该基因的质粒转化入所述微生物宿主菌中、或者直接将该基因克隆入宿主菌基因组中而实现。

其中，将上述的基因克隆入所述微生物宿主菌基因组中通过基因编辑技术实施。

上述基因编辑技术可以采用同源双交换、CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cpf1***、CRISPR-Cas相关的转座***INTEGRATE***或者CAST***、CRISPR-BEST***、MuGENT(multiplex genome editing by natural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)。

上述INTEGRATE***是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件***)；CAST***是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。

上述基因组中整合了上述虾青素合成酶基因的微生物比如红发夫酵母基因工程菌株有潜力应用于工业化生产虾青素。

在一种实施方式中，红发夫酵母发酵生产虾青素时，发酵培养基组成为：酵母浸粉5g/L、麦芽浸粉5g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、番茄粉20g/L、硫酸铵3g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钙0.5g/L、甘油1％(w/V)、硫酸锌0.5mg/L、维生素B6 100mg/L、维生素B12 10mg/L、肌醇5mg/L、消泡剂0.5‰。

可选地，补料培养基为60％葡萄糖溶液(w/V)。

上述发酵的温度可以是18-27℃，例如为21℃左右；培养基控制为pH5.0-6.5，例如大约pH5.5-6.0。

应理解，本文中在表述数值特征时，术语“大约”或者“左右”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。

红发夫酵母发酵时，可以包括种子培养基，种子培养基组成为：酵母浸粉2g/L、麦芽浸粉3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖2.5g/L，利用氨水或柠檬酸调pH值为6.0。

本发明筛选的虾青素合成酶SEQ ID NO:5是野生型虾青素合成酶SEQ ID NO:3的突变体，相较野生酶，该突变体能够使得菌株的虾青素合成水平相比野生型虾青素合成酶提高约5.5倍，能够用于促进红发夫酵母生产虾青素。

附图说明

图1是本发明构建的用于表达野生型虾青素合成酶SEQ ID NO:3的质粒pCambia1301-crtS的图谱。

图2是检测红发夫酵母生产的虾青素的HPLC图谱。

具体实施方式

虾青素合成酶酶活力直接关系到红发夫酵母的虾青素生产量，因此本发明的工作重点之一在于提升原有虾青素合成酶本身的活性。经过随机突变和高通量筛选得到的虾青素合成酶SEQ ID NO:5是来源于红发夫酵母的野生型虾青素合成酶SEQ ID NO:3(crtS，NCBI登录号KR779667.1)中五个氨基酸发生替换的突变体。这5个突变位点是第143位的谷氨酰胺突变为赖氨酸(Q143K)、第368位的谷氨酸突变为赖氨酸(E368K)、第459位的丙氨酸突变为谷氨酸(A459E)、第509位的亮氨酸突变为丝氨酸(L509S)、第524位的组氨酸突变为脯氨酸(H524P)。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指野生型的虾青素合成酶SEQ ID NO:3：

MFILVLLTGALGLAAFSWASIAFFSLYLAPRRSSLYNLQGPNHTNYFTGNFLDILSARTGEEHAKYREKYGSTLRFAGIAGAPVLNSTDPKVFNHVMKEAYDYPKPGMAARVLRIATGDGVVTAEGEAHKRHRRIMIPSLSAQAVKSMVPIFLEKGMELVDKMMEDAAEKDMAVGESAGEKKATRLETEGVDVKDWVGRATLDVMALAGFDYKSDSLQNKTNELYVAFVGLTDGFAPTLDSFKAIMWDFVPYFRTMKRRHEIPLTQGLAVSRRVGIELMEQKKQAVLGSASDQAVDKKDVQGRDILSLLVRANIAANLPESQKLSDEEVLAQISNLLFAGYETSSTVLTWMFHRLSEDKAVQDKLREEICQIDTDMPTLDELNALPYLEAFVKESLRLDPPSPYANRECLKDEDFIPLAEPVIGRDGSVINEVRITKGTMVMLPLFNINRSKFIYGEDAEEFRPERWLEDVTDSLNSIEAPYGHQASFISGPRACFGWRFAVAEMKAFLFVTLRRVQFEPIISHPEYEHITLIISRPRIVGREKEGYQMRLQVKPVE(SEQ ID NO:3)。

类似地，术语“虾青素合成酶突变体”、“突变虾青素合成酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指虾青素合成酶SEQ ID NO:5。

有时为了表述方便起见，本文中可以将野生酶SEQ ID NO:3与其突变体SEQ IDNO:5统称为“虾青素合成酶”。

上述虾青素合成酶突变体SEQ ID NO:5在产虾青素的红发夫酵母中进行过表达后，使得红发夫酵母生产虾青素的能力提高了5.5倍。

可以预期，虾青素合成酶突变体SEQ ID NO:5还可以用于其他产虾青素的菌株来提高工程菌的虾青素生物合成水平。

容易理解，为了在不同的宿主菌中表达外源的虾青素合成酶，可以对该酶的表达基因进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常显示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以使用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

例如，为了在红发夫酵母中表达虾青素合成酶，经密码子优化的野生虾青素合成酶SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:2；虾青素合成酶突变体SEQ ID NO:5的编码基因可以是SEQ ID NO:4。

上述基因序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中分别包含了一定数量的内含子。可选地，本领域技术人员可以根据结构明确的野生虾青素合成酶的氨基酸序列SEQ IDNO:3和虾青素合成酶突变体的氨基酸序列SEQ ID NO:5，采用计算机软件设计出核苷酸序列内不包括内含子的编码基因或者表达盒。对于不同的宿主微生物种类，可以有密码子优化的编码基因序列。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

YPD培养基：蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖5g/L，pH6.0。(YPD固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

虾青素提取方法：

取0.5～2mL红发夫酵母发酵液加入到50mL离心管中，12,000rpm条件下离心5min，倒掉上清获得酵母湿菌泥，放置于80℃的烘箱15h烘干水分。准确称量菌体重量，加入5mlDMSO萃取菌体中的类胡萝卜素，使用漩涡混合器充分混合后将离心管放置在恒温水浴锅中，浸提时间20min，浸提温度40℃。浸提结束后，在12,000rpm条件下离心5min，收集上清。向浸提残渣中再次加入5mL DMSO，漩涡震荡混匀后放置在水浴锅中进行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃。浸提结束漩涡混匀后在12,000rpm条件下离心5min，收集上清。混合两次浸提上清液，在12,000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质备用。

虾青素含量的检测方法：

HPLC检测条件：YMC Carotenoid C30反相色谱柱(类胡萝卜素分析柱)；流动相A为含有90％体积分数的甲醇-水溶液，流动相B为甲基叔丁基醚；流动相A：流动相B＝9：1走基线；进样后，0～15min，流动相A：流动相B从9:1线性渐变为2:8，15～30min，流动相A：流动相B从2:8线性渐变为9:1；流速0.5mL/min；检测波长为450nm。

图2显示了检测的虾青素的HPLC图谱。

实施例1：构建表达野生虾青素合成酶基因的质粒

来源于红发夫酵母的野生虾青素合成酶基因(crtS，NCBI登录号KR779667.1的961～4126bp)受到三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(gpd)调控，其中三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，野生虾青素合成酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:2(包括内含子)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并克隆到质粒pUC57的EcoRI、BamHI位点，获得质粒pUC-crtS，对应的野生虾青素合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

以质粒pUC-crtS为模板，利用PCR技术扩增获得含有gpd启动子-crtS基因的DNA片段CRTS。设计如下引物对：

正向引物CRTS-5：

5’-CAGCTATGACCATGATTACCAAGTCGAGGGAACCCGAG-3’，

反向引物CRTS-3：

5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCTACCATGGTCAAGAGTCCCC-3’。

以质粒pCambia1301为模板，利用PCR扩增获得pCambia1301质粒骨架。设计如下引物对：

Cambia-5：5’-GGCACTGGCCGTCGTTTTAC-3’，

Cambia-3：5’-GTAATCATGGTCATAGCTGTTTC-3’。

利用宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)的

GXL DNA聚合酶试剂盒进行PCR扩增。反应体系：5×Buffer缓冲液10μL、dNTP Mixture 10mM、正向引物和反向引物各1μL、模板0.5μL、DNA聚合酶2μL，加ddH₂O补至50μL。

PCR扩增条件：95℃变性5min；(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.2min)共10循环；(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.2min)共20循环；72℃延伸7min。

向PCR反应体系中直接加入1μL限制性内切酶DpnI消化甲基化模板。对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。利用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒，使线性化DNA(CRTS片段和pCambia1301质粒骨架)两段同源的序列重组后成环，构建出表达野生虾青素合成酶的质粒pCambia1301-crtS，如图1所示。

实施例2：构建表达野生虾青素合成酶的质粒

制备红发夫酵母感受态：挑取红发夫酵母菌株CBS 6938(购自CBS(Centrares)荷兰微生物菌种保藏中心)单菌落于20mL液体YPD培养基中，在21℃、180rpm条件下孵育48h，再取5mL菌液接种到100ml YPD液体培养基中，21℃、180rpm培养至OD600为1.2左右。然后在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，用40mL含有25mM的二硫苏糖醇的磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.0)重悬，在25℃条件下热处理15min。用40mL冰冷的蔗糖缓冲液STM(270mM蔗糖，10mM Tris-HCl，1mM MgCl₂，pH7.5)洗涤菌体2次，最后用0.1mL的STM缓冲液重悬细胞，放置于-80℃冰箱备用。

将实施例1中构建的质粒pCambia1301-crtS转化至红发夫酵母菌株CBS 6938，具体操作步骤：将5μL的质粒pCambia1301-crtS与0.1mL感受态细胞悬液混合置于冰冷的电转杯中。调节电转仪参数为1000Ω，800V，25μF，电击后迅速加入0.5mL冰冷的YPD培养液，在21℃孵育3h后涂布含有抗生素的YPD平板上，21℃孵育48h。

通过上述转化方法获得表达野生虾青素合成酶SEQ ID NO:3的菌株CBS-1。

实施例3：第1轮到第3轮易错PCR法构建随机突变点库

以质粒pUC-crtS为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。

设计如下引物对TB-5/TB-3：

正向引物TB-5：5’-ATGTTCATCTTGGTCTTGCTCACAG-3’，

反向引物TB-3：5’-TCATTCGACCGGCTTGACCTGCAAA-3’。

以质粒pUC-crtS为模板，进行PCR扩增，获得约3.2kb的虾青素合成酶突变体DNA序列。

50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pUC-crtS)模板，50pmol一对引物TB-5和TB-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(Takara)。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。

对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pCambia1301-crtS为模板，以约3.2kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plusDNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化红发夫酵母菌株CBS 6938中，涂布于YPD固体平板(培养基中额外添加终浓度为100mg/L紫罗酮用于降低本底虾青素的合成水平)，得到超过2500个克隆的随机突变库。

检测随机突变库中各个菌株的虾青素含量，选择虾青素含量明显提升的菌株，提取质粒，并委托苏州金唯智公司进行核酸测序，将虾青素合成酶相关片段与SEQ ID NO:2进行比对，确定虾青素合成酶的氨基酸突变位点。选择虾青素含量最高的菌株对应的虾青素合成酶突变体作为下一轮随机突变体库建库的模板，进行3轮。

实施例4：第1轮到第3轮随机突变点文库的高通量反应筛选

挑取颜色较红的生长旺盛的单菌落至96深孔板(每孔含有400μL的液体YPD培养基，培养基中含G418抗生素浓度为100μg/mL)，在21℃、400rpm条件下孵育48h后，从每孔中取出80μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有320μL的液体YPD培养基，培养基中含番茄粉20g/L，G418抗生素浓度为100μg/mL)，在21℃、400rpm条件下孵育48h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加入300μL的DMSO萃取菌体中的类胡萝卜素，浸提时间20min，浸提温度40℃。浸提结束后，在12,000rpm条件下离心5min，收集上清。向每孔的浸提残渣中再次加入300μL的DMSO进行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃。浸提结束12,000rpm条件下离心5min，收集上清。混合两次浸提上清液，在12,000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质备用。筛选结果参见表1。

表1、突变菌株及虾青素合成酶突变体筛选结果

备注：“+”代表虾青素含量相对各自出发菌株大于0％小于等于50％；“++”代表虾青素含量相对各自出发菌株大于50％小于等于100％；“+++”代表虾青素含量相对各自出发菌株大于100％小于等于150％；“++++”代表虾青素含量相对各自出发菌株大于150％。

经过三轮筛选，表达突变体crtS-13的突变菌株CBS-13的虾青素产量相比表达野生虾青素合成酶SEQ ID NO:3的菌株CBS-1有了显著提高。基因测序证实突变体crtS-13基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，相对于野生虾青素合成酶crtS发生了(Q143K、E368K、A459E、L509S、H524P)突变。

实施例5：回补实验验证突变体crtS-13的功能

按照实施例1的方法构建表达突变体crtS-13基因的质粒pCambia1301-crtS-13，不同之处是用核苷酸序列SEQ ID NO:4替换核苷酸序列SEQ ID NO:2。

按照实施例2的方法将质粒pCambia1301-crtS-13转化红发夫酵母菌株CBS 6938，构建出红发夫酵母基因工程菌，编号SHBL0413。

将保藏的红发夫酵母SHBL0413甘油菌涂布于固体YPD培养基平板，在21℃倒置孵育48h。挑取单菌落转接于500mL的种子培养基进行培养，装液量为100mL，在21℃、180rpm条件下孵育48h，使OD_600nm值达到6以上。将2瓶种子液以体积比10％v/v的接种量接种于含有发酵培养基的5L生物反应器中，发酵培养基的装液量为1.8L，控制pH值为5.5(利用氨水、柠檬酸控制pH值)，温度为21℃，葡萄糖浓度为5～10g/L，DO为50％以上。发酵168h后，取样2mL发酵液加入到50mL离心管中，12,000rpm条件下离心5min，倒掉上清获得酵母湿菌泥，放置于80℃的烘箱15h烘干水分。准确称量菌体重量，加入5mL DMSO萃取菌体中的类胡萝卜素，使用漩涡混合器充分混合后将离心管放置在恒温水浴锅中，浸提时间20min，浸提温度40℃。浸提结束后，在12,000rpm条件下离心5min，收集上清。向浸提残渣中再次加入5mL DMSO，漩涡震荡混匀后放置在水浴锅中进行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃。浸提结束漩涡混匀后在12,000rpm条件下离心5min，收集上清。混合两次浸提上清液，在12,000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质，进行HPLC检测。结果显示，菌株SHBL0413的虾青素占细胞干重的0.437％(如图2所示)，而同等发酵条件下菌株CBS-1中虾青素占细胞干重仅有0.079％。

该实验结果表明，本发明筛选得到的虾青素合成酶突变体SEQ ID NO:5有效促进了红发夫酵母生产虾青素，能够用于虾青素生产菌的基因改造，具有开发应用前景。

Claims (10)

1.一种虾青素合成酶，其为选自下组的多肽：

(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:5的多肽；

(2)与SEQ ID NO:5有90％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:5提高的多肽。

2.编码如权利要求1所述虾青素合成酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码SEQ ID NO:5的基因为SEQ ID NO:4所示的多核苷酸、或者与SEQ ID NO:4有90％以上同源性的多核苷酸。

4.如权利要求1所述的虾青素合成酶、或者如权利要求2-3中任一项所述的基因在促进微生物生产虾青素中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述微生物是红发夫酵母。

6.一种虾青素生产菌，其特征在于，基因组中包含如权利要求2或3所述的基因。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物宿主菌是红发夫酵母。

8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述微生物宿主菌基因组中原有的虾青素合成酶编码基因被如权利要求2或3所述的基因替换；或者所述微生物宿主菌基因组中整合如权利要求2或3所述的基因。

9.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述基因的整合是指通过将包含该基因的质粒转化入所述微生物宿主菌中、或者直接将该基因克隆入宿主菌基因组中而实现。

10.如权利要求6-9中任一项所述微生物在生产虾青素中的用途。

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