CN109053663A - 从甜叶菊中提取木犀草素和异甘草素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从甜叶菊叶中提取木犀草素和异甘草素的方法，具体步骤包括如下：对甜叶菊叶采用醇回流提取，过滤，滤液浓缩，加***萃取，萃取液浓缩上硅胶柱纯化，结晶，加醇溶解后脱色，再结晶得异甘草素纯品；下层液体加醇溶解，过滤，滤液上硅胶柱，醇洗脱液浓缩，结晶得木犀草素纯品。采用甜叶菊叶同时提取得到高纯度的木犀草素和异甘草素，大大提高了甜叶菊叶的利用率，提高了附加值；同时降低了木犀草素和异甘草素的生产成本，节省了甜叶菊叶资源；通过面包酵母发酵转化与自溶处理，有利提高了木犀草素和异甘草素以及甜叶菊糖苷的产率。

Description

从甜叶菊中提取木犀草素和异甘草素的方法
所属技术领域
本发明涉及利用甜叶菊提取分离木犀草素和异甘草素的方法，属于天然产物化学的技术领域。
背景技术
甜叶菊，原产于南美巴拉圭，几个世纪以来一直被当地居民作为甜味饮料饮用，是一种小型多年生菊科斯台维亚属植物，宿根性、须根型、多年生、短日照、草本植物。1970年日本从巴西引进甜叶菊，开始驯化、栽培、制备出糖苷，同时进行毒理、食品检测等试验，并首先开发利用甜叶菊产品—甜叶菊糖苷；我国于1976年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。
甜叶菊叶片中的甜味成分统称为甜菊糖苷，为一类四环二萜类衍生物，包含但不限于甜菊苷，莱鲍迪苷A、B、C、D、F，并以小浓度存在甜叶菊的叶子中。其甜度约为蔗糖的300倍，研究表明，甜菊糖苷具有高甜度、低热量、无明显毒副作用的特点，可抑制高血糖、高血压，并由消炎、抗肿瘤、止泻利尿以及协助免疫调节的作用。
异甘草素化学名称为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯。它是非黄酮类的多酚化合物，分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.25，为白色针状晶体，易溶于***、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、乙酯等有机溶剂，在波长365nm的紫外光照射下能产生荧光，并能和三氯化铁-铁***起显色反应。pH>10时，稳定性较差，异甘草素无味、白色晶体(甲醇)；难溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有机溶剂。熔点253-255℃，261℃即升华。
公开号为CN102295668A的中国专利介绍了一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：a.提取和除杂：甜叶菊干燥叶加纯水于浸提，过滤后得提取液；在提取液中加入FeSO4·H2O后用Ca(OH)2调节pH到pH在8～9，搅拌，静置后过滤得浅黄色除杂提取液；b.浓缩分离：除杂提取液用ADS-7大孔吸附树脂进行纯化，除杂提取液减压浓缩至1/3体积后上样，吸附饱和的树脂先用纯水进行冲洗除杂，然后60％的乙醇进行洗脱，收集60％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品；c.纯化：甜菊糖苷粗品用正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相展开，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液；将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA。
公开号为CN105418703A的中国专利介绍了一种从甜叶菊中提取纯化甜菊糖甙的方法，首先将甜叶菊，将其用清水冲洗干净，置于无水乙醇中浸泡，碾磨，烘干后，将其与***按直至混合均匀，进行离心分离，取离心液，将下层沉淀再次进行二次离心分离，收集上层清液，并与第一次的离心液合并；将碳酸钙粉末与上述合并的离心液进行搅拌混合后进行加热处理，自然冷却，与氢氧化钠溶液混合后，再用盐酸溶液调节其pH，加入硫酸铝，对其搅拌后，进行萃取，再利用大孔吸附即可。
公开号为CN106146574A的中国专利介绍了一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括：将甜叶菊叶冲洗后置于无水乙醇中浸泡，干燥、粉碎、过筛得到甜叶菊叶粉；将甜叶菊叶粉、水、复合酶混合均匀，调节pH值后微波加热，保温浸泡后升温，超声后得到提取液和滤渣；将滤渣与***搅拌均匀后离心分离，将上层清液与提取液合并得到总提取液；将三氯化铁溶液、氢氧化钙溶液、聚丙烯酰胺溶液和总提取液混合均匀得到混合液，将混合液与硫酸铝溶液混合均匀，调节pH后超临界萃取得到萃取液；将萃取液通过大孔树脂吸附，经洗脱、减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；将甜菊糖苷粗品加入水中，超声后加入凹凸棒土，调整pH值后静置、离心、浓缩、干燥。
公开号为CN106046075A的中国专利介绍了一种甜叶菊叶中甜菊糖苷的提取方法，包括：将甜叶菊叶冲洗、浸泡、烘干、粉碎、过筛得到甜叶菊叶粉；将甜叶菊叶粉与水混合后加入复合酶，调节pH值后微波加热提取，然后超声、过滤得到提取液和滤渣；将滤渣与***混合后离心分离得到总提取液；将三氯化铁溶液、氢氧化钙溶液和总提取液混合，加热、保温、冷却后与氢氧化钠溶液混合，调节pH值后与硫酸铝溶液混合，搅拌后超临界萃取得到萃取液；将萃取液通过AB-8型大孔树脂进行吸附，经洗脱、蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；将甜菊糖苷粗品加入水中，超声溶解后加入活性氧化铝吸附，然后过滤、洗涤、沉淀、合并滤液及洗涤液、浓缩、干燥。
公开号为CN105294790A的中国专利介绍了一种从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法，包括以下步骤：(1)将甜叶菊原料粉碎后浸泡于水中，加入纤维素酶制剂进行酶解；(2)加热浸提，离心，过滤，得甜叶菊加酶浸提液；(3)将甜叶菊加酶浸提液水浴加热，加入无机盐絮凝剂，搅拌，絮凝处理，离心，过滤，得甜叶菊除杂液；(4)将甜叶菊除杂液过大孔吸附树脂柱进行脱色吸附，洗脱液洗脱，纳滤，浓缩，得甜叶菊浓缩液；(5)将甜叶菊浓缩液上硅胶层析柱，洗脱，收集各馏分，浓缩和干燥，得多种高纯度的甜叶菊糖苷产品。
综上所述，木犀草素和异甘草素均具有较强的药理作用，在医药学领域的应用前景广阔。目前甜叶菊叶未得到综合开发利用，探索从甜叶菊叶中同时提取木犀草素和异甘草素意义非凡。
发明内容
目前公开的文献资料仅研究从甜叶菊叶中提取活性成份木犀草素和甜叶菊糖苷，但未对其他活性成分进行综合利用。针对甜叶菊叶的活性成分未综合开发利用问题，本发明提供一种操作简单、工艺合理、快速同时提取木犀草素和异甘草素的生产工艺。
本发明采用的技术方案包括：对甜叶菊叶采用醇回流提取，过滤，滤液浓缩，加***萃取，萃取液浓缩上硅胶柱纯化，结晶，加醇溶解后脱色，再结晶得异甘草素纯品；下层液体加醇溶解，过滤，滤液上硅胶柱，醇洗脱液浓缩，结晶得木犀草素纯品。
因此，本发明提供一种从甜叶菊叶中提取木犀草素和异甘草素的方法，具体步骤包括如下：
(1)将甜叶菊叶粉碎至80目～120目，加入70～85％乙醇溶液回流提取2次，每次100～150min，过滤，合并滤液，滤液A和滤渣A，其中乙醇溶液的体积L与甜叶菊叶重量kg比为2～5：1。
(2)将滤渣A加入水，再加入糖化酶至终浓度达到100U/L以上，酶解60～120min，再加入4～10％面包酵母粉在25℃～30℃处理20～36h，加入乙醇至终浓度达到40～50％(体积比)在45℃～60℃处理60～120min，过滤得滤液B和滤渣B，其中加入水的体积L与甜叶菊叶重量kg比为2～4：5。
(3)将滤渣B加入60～80％乙醇溶液回流提取100～150min，过滤，得滤液C和滤渣C，再将滤液A、滤液B和滤液C合并后在55℃～65℃减压浓缩，得浸膏A，其中乙醇溶液的体积L与甜叶菊叶重量kg比为2～4：1。
(4)将浸膏A加入冷水,再加两倍到四倍体积的***萃取50～150min，得***液和下层液体，其中加入冷水的体积L与浸膏A重量kg比为1～3：1。
(5)将***液浓缩至原有体积的1/15～1/25，上硅胶层析柱(200～300目)，用5～8BV的80～90％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至原有体积的1/10～1/15，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。
(6)粗结晶加80～90％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置50～150min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，得异甘草素纯品。
(7)将步骤(4)中的下层液体过滤，得滤液D和滤渣D，滤渣D用80～90％乙醇溶液溶解，上硅胶柱(200～300目)，先用5～8BV柱体积的水进行洗脱，得洗脱液Ⅱ，再用5～8BV的80～90％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅲ；
(8)将洗脱液Ⅲ在50℃～60℃减压浓缩至原有体积的1/5～1/10，结晶，过滤，得木犀草素纯品。
(9)将滤液D进行浓缩后上硅胶层析柱，用15～20BV柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液Ⅳ，再与洗脱液Ⅱ合并，在55℃～65℃减压浓缩和干燥，得甜叶菊糖苷产品。
上述步骤中乙醇溶液是指乙醇与水的混合液，70％乙醇溶液是指70mL乙醇加入30ml水进行混合即可。
上述糖化酶直接从市场购买即可，酶活性达到1000U/g以上。
所述步骤(2)中加入面包酵母粉的量kg与甜叶菊叶重量kg比为4～10：100。
所述过滤为陶瓷膜过滤1次，膜孔孔径大小为0.22μm；BV是指倍柱体积。
所述步骤(6)加入乙醇溶液的体积L/粗结晶重量kg比为3～15:1；活性炭的量按重量kg/粗结晶重量kg比为0.5～2:1；
所述步骤(7)加入乙醇溶液的体积L/滤渣D重量kg比为3～10:1。
技术效果
1、通过采用甜叶菊叶同时提取得到高纯度的木犀草素和异甘草素，大大提高了甜叶菊叶的利用率，提高了附加值；同时降低了木犀草素和异甘草素的生产成本，节省了甜叶菊叶资源。
2、本发明原料采用乙醇回流提取，同时获得木犀草素和异甘草素醇提物，又提高了提取率，同时缩短了提取时间，又大大节省了能耗。
3、通过面包酵母发酵转化与自溶处理，有利提高了木犀草素和异甘草素以及甜叶菊糖苷的产率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
粉碎甜叶菊叶，过100目筛，称取100kg，加入80％乙醇溶液300L回流提取2次，每次120min，过滤，合并滤液，滤液A和滤渣A。将滤渣A加入50L水，再加入糖化酶至200U/L酶解100min，再加入8kg面包酵母粉在28℃处理24h，加入乙醇至终浓度达到45％，在50℃处理100min，过滤得滤液B和滤渣B。将滤渣B加入75％乙醇溶液250L回流提取120min，过滤，得滤液C和滤渣C，再将滤液A、滤液B和滤液C合并后在55℃减压浓缩，得16.53kg浸膏A。将浸膏A加入20L冷水,再加60L***萃取100min，得***液和下层液体。将***液浓缩至3L，上250目硅胶层析柱，用6BV的80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至2L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加85％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置80min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，得915g异甘草素纯品。将下层液体过滤，得滤液D和1.83kg滤渣D，滤渣D用85％乙醇溶液5L溶解，上200目硅胶柱，先用8BV柱体积的水进行洗脱，得洗脱液Ⅱ，再用5BV的80％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅲ；将洗脱液Ⅲ在55℃减压浓缩至2L，结晶，过滤，得1.42kg木犀草素纯品。将滤液D进行浓缩后上硅胶层析柱，用20BV柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液Ⅳ，再与洗脱液Ⅱ合并，在55℃减压浓缩和干燥，得11.84kg甜叶菊糖苷产品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.91％，异甘草素的纯度为98.46％，甜叶菊糖苷的纯度为96.17％。
对照实施例1
粉碎甜叶菊叶，过100目筛，称取100kg，加入80％乙醇溶液300L回流提取2次，每次120min，过滤，合并滤液，滤液A和滤渣A。将滤渣A加入50L水，加入8kg面包酵母粉在28℃处理24h，加入乙醇至终浓度达到45％，在50℃处理100min，过滤得滤液B和滤渣B。将滤渣B加入75％乙醇溶液250L回流提取120min，过滤，得滤液C和滤渣C，再将滤液A、滤液B和滤液C合并后在55℃减压浓缩，得13.28kg浸膏A。将浸膏A加入20L冷水,再加60L***萃取100min，得***液和下层液体。将***液浓缩至3L，上250目硅胶层析柱，用6BV的80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至2L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加85％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置80min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，得846g异甘草素纯品。将下层液体过滤，得滤液D和1.56kg滤渣D，滤渣D用85％乙醇溶液5L溶解，上200目硅胶柱，先用8BV柱体积的水进行洗脱，得洗脱液Ⅱ，再用5BV的80％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅲ；将洗脱液Ⅲ在55℃减压浓缩至2L，结晶，过滤，得1.15kg木犀草素纯品。将滤液D进行浓缩后上硅胶层析柱，用20BV柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液Ⅳ，再与洗脱液Ⅱ合并，在55℃减压浓缩和干燥，得9.93kg甜叶菊糖苷产品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.66％，异甘草素的纯度为98.27％，甜叶菊糖苷的纯度为95.73％。
对照实施例2
粉碎甜叶菊叶，过100目筛，称取100kg，加入80％乙醇溶液300L回流提取2次，每次120min，过滤，合并滤液，滤液A和滤渣A。将滤渣A加入50L水，再加入糖化酶至200U/L酶解100min，加入乙醇至终浓度达到45％，在50℃处理100min，过滤得滤液B和滤渣B。将滤渣B加入75％乙醇溶液250L回流提取120min，过滤，得滤液C和滤渣C，再将滤液A、滤液B和滤液C合并后在55℃减压浓缩，得17.85kg浸膏A。将浸膏A加入20L冷水,再加60L***萃取100min，得***液和下层液体。将***液浓缩至3L，上250目硅胶层析柱，用6BV的80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至2L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加85％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置80min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，得787g异甘草素纯品。将下层液体过滤，得滤液D和1.41kg滤渣D，滤渣D用85％乙醇溶液5L溶解，上200目硅胶柱，先用8BV柱体积的水进行洗脱，得洗脱液Ⅱ，再用5BV的80％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅲ；将洗脱液Ⅲ在55℃减压浓缩至2L，结晶，过滤，得1.05kg木犀草素纯品。将滤液D进行浓缩后上硅胶层析柱，用20BV柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液Ⅳ，再与洗脱液Ⅱ合并，在55℃减压浓缩和干燥，得10.96kg甜叶菊糖苷产品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.48％，异甘草素的纯度为97.36％，甜叶菊糖苷的纯度为95.31％。
实施例2
粉碎甜叶菊叶，过100目筛，称取200kg，加入85％乙醇溶液500L回流提取2次，每次100min，过滤，合并滤液，滤液A和滤渣A。将滤渣A加入100L水，再加入糖化酶至350U/L酶解80min，再加入15kg面包酵母粉在28℃处理30h，加入乙醇至终浓度达到45％，在50℃处理100min，过滤得滤液B和滤渣B。将滤渣B加入75％乙醇溶液500L回流提取120min，过滤，得滤液C和滤渣C，再将滤液A、滤液B和滤液C合并后在55℃减压浓缩，得35.21kg浸膏A。将浸膏A加入40L冷水,再加100L***萃取100min，得***液和下层液体。将***液浓缩至5L，上250目硅胶层析柱，用6BV的80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至3L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加85％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置100min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，得2.12kg异甘草素纯品。将下层液体过滤，得滤液D和4.06kg滤渣D，滤渣D用85％乙醇溶液10L溶解，上200目硅胶柱，先用8BV柱体积的水进行洗脱，得洗脱液Ⅱ，再用5BV的80％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅲ；将洗脱液Ⅲ在55℃减压浓缩至4L，结晶，过滤，得3.01kg木犀草素纯品。将滤液D进行浓缩后上硅胶层析柱，用20BV柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液Ⅳ，再与洗脱液Ⅱ合并，在55℃减压浓缩和干燥，得23.38kg甜叶菊糖苷产品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为99.11％，异甘草素的纯度为98.79％。

Claims (5)

1.一种从甜叶菊叶中提取木犀草素和异甘草素的方法，具体步骤包括如下：
(1)将甜叶菊叶粉碎至80目～120目，加入70～85％乙醇溶液回流提取2次，每次100～150min，过滤，合并滤液，滤液A和滤渣A，其中乙醇溶液的体积L与甜叶菊叶重量kg比为2～5：1；
(2)将滤渣A加入水，再加入糖化酶至终浓度达到100U/L以上，酶解60～120min，再加入4～10％面包酵母粉在25℃～30℃处理20～36h，加入乙醇至终浓度达到40～50％在45℃～60℃处理60～120min，过滤得滤液B和滤渣B，其中加入水的体积L与甜叶菊叶重量kg比为2～4：5；
(3)将滤渣B加入60～80％乙醇溶液回流提取100～150min，过滤，得滤液C和滤渣C，再将滤液A、滤液B和滤液C合并后在55℃～65℃减压浓缩，得浸膏A，其中乙醇溶液的体积L与甜叶菊叶重量kg比为2～4：1；
(4)将浸膏A加入冷水,再加两倍到四倍体积的***萃取50～150min，得***液和下层液体，其中加入冷水的体积L与浸膏A重量kg比为1～3：1；
(5)将***液浓缩至原有体积的1/15～1/25，上硅胶层析柱，用5～8BV的80～90％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至原有体积的1/10～1/15，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶；
(6)粗结晶加80～90％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置50～150min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，得异甘草素纯品；
(7)将步骤(4)中的下层液体过滤，得滤液D和滤渣D，滤渣D用80～90％乙醇溶液溶解，上硅胶柱，先用5～8BV柱体积的水进行洗脱，得洗脱液Ⅱ，再用5～8BV的80～90％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅲ；
(8)将洗脱液Ⅲ在50℃～60℃减压浓缩至原有体积的1/5～1/10，结晶，过滤，得木犀草素纯品；
(9)将滤液D进行浓缩后上硅胶层析柱，用15～20BV柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液Ⅳ，再与洗脱液Ⅱ合并，在55℃～65℃减压浓缩和干燥，得甜叶菊糖苷产品。
2.权利要求1方法，其中所述步骤(2)中加入面包酵母粉的量kg与甜叶菊叶重量kg比为4～10：100。
3.权利要求1方法，其中所述过滤为陶瓷膜过滤1次，膜孔孔径大小为0.22μm；BV是指倍柱体积。
4.权利要求1方法，其中所述步骤(6)加入乙醇溶液的体积L/粗结晶重量kg比为3～15:1；活性炭的量按重量kg/粗结晶重量kg比为0.5～2:1。
5.权利要求1方法，其中所述步骤(7)加入乙醇溶液的体积L/滤渣D重量kg比为3～10:1。
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