CN109010310A - 包含奥利司他与glp-1受体激动剂的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含奥利司他与GLP‑1受体激动剂的组合物及其用途。本发明提供的包含奥利司他与GLP‑1受体激动剂的组合物，包含奥利司他，以及包含GLP‑1受体激动剂与共聚物的纳米粒。本发明提供的包含奥利司他与GLP‑1受体激动剂的组合物可以实现奥利司他与GLP‑1受体激动剂的联合口服用药，生物利用度高，具有良好的抑制体重增加和减肥效果。

Description

包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物及其用途。

背景技术

奥利司他(orlistat)为由罗氏制药公司研发脂肪酶抑制剂类减肥药，商品名Xenical，上个世纪九十年代末率先在欧美上市，2001年在中国上市，并于2005年被中国食品药品监督管理局批准转为非处方药。其化学名为N-甲酰-L-亮氨酸(s)-1-[(2s,3s)-3-己基-4氧基-2-环氧丙基甲基]十二酯，也称四氢脂抑素(Tetrahydrolipstatin，THL)，是一种半合成的脂抑素衍生物，其化学结构式如下式所示：

奥利司他与胃胰脂肪酶的丝氨酸残基形成共价健，从而使酶失活，无法将食物中的甘油三酯水解成可吸收的脂肪酸，进而降低脂肪的吸收量。目前，奥利司他是国内外唯一不影响食欲、不作用于中枢神经***的化学减肥药，安全性特征优越，Bray GA于《柳叶刀》杂志发表的一篇名为Management of Obesity的文章中将奥利司他描述为“最安全”(safest)的减肥药。然而，奥利司他口服给药后仅能抑制膳食中30％的脂肪的吸收，因此前述Bray GA在相同的文章中将奥利司他的减重效果评级为“modest”(中度的)。

GLP-1，全称胰高血糖素样肽-1，是一种表达于中枢神经***的内源性多肽，其与对应的受体结合后可产生调控食欲与热量摄取的作用。GLP-1受体激动剂类药物主要作为降糖药开发并用于临床，目前已经上市的GLP-1受体激动剂类药物包括艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、阿比鲁肽(albiglutide)、度拉鲁肽(dulaglutide)、利西拉肽(lixisenatide)、司美鲁肽(semaglutide)。上述GLP-1受体激动剂类药物均在临床试验中显示出了良好的减重作用，其中利拉鲁肽用于减重的适应证已经获FDA批准。因此，如果在单一的药物制剂中实现奥利司他与GLP-1受体激动剂同时给药，则会产生至少加和的减重效果。然而，由于脂肪酶仅存在于消化道中，奥利司他只能通过口服给药，而GLP-1受体激动剂“肽”的本质，使其口服后易被消化道中胃酸与消化酶破坏而失去活性，此外消化道的多种生理屏障也构成了GLP-1受体激动剂的吸收障碍。以上均是开发同时包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的药物组合物所必需要克服的问题。

近年来，随着药物制剂技术的发展，纳米载药***开始应用于多肽类药物的口服给药。纳米载药***粒径一般为10～200nm，多肽类药物可以溶解、包裹或吸附于其中，避免受到胃酸和消化酶的破坏。纳米载药***可以通过细胞旁路或肠黏膜派伊尔氏结的M细胞吞噬途径吸收，也可直接被肠上皮细胞吸收。口服纳米载药***的设计目标是通过控制粒径大小、表面特性(电荷、亲水疏水性等)以及载体形状等，提高药物稳定性，促进药物口服吸收，从而提高药物的口服生物利用度。用于多肽类药物口服给药的纳米载药***包括纳米球/纳米囊、纳米脂质体、固体脂质纳米粒、聚合物胶束、纳米结晶、聚合物药物复合纳米粒等。

聚乳酸羟基乙酸(PLGA)是GLP-1受体激动剂类药物的纳米制剂中最常用的聚合物载体之一，其中，以PLGA作为载体的艾塞那肽注射用缓释微球已经获FDA批准上市，商品名为Bydureon。J.W.Joseph等人用PLGA作为载体制备得到的包含GLP-1的纳米制剂可以提高GLP-1的口服生物利用度(Diabetologia(2000)43:1319～1328)。

中国专利申请CN104740647A(下文称为“对比文件1”)公开了一种由艾塞那肽和带电荷辅料制成的口服微粒，其中所述的带电荷辅料是选自壳聚糖、丙烯酸树脂、海藻酸钠和聚酰胺-胺聚合物中的一种或几种。而该专利只披露了当带电荷辅料是壳聚糖时的口服纳米微粒的生物利用度，仅为15.3％。

中国专利申请CN107708667A(下文称为“对比文件2”)公开了一种包含a)治疗有效量的利拉鲁肽，b)包含亲水性部分和疏水部分的嵌段共聚物或接枝共聚物，或它们的混合物，c)至少一种亲水脂分子，和d)水性载体的长效组合物，并在其说明书中指出，所述的“接枝共聚物”包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPCTM)和甲基丙烯酸正丁酯(BMA)共聚物(PUREBRIGHT mb-37-50T与PUREBRIGHT mb-37-100T)，但该专利所述的组合物呈凝胶的形式，只供注射给药，而且未给出与MPC/BMA共聚物有关的实施例。

因此，仍然有必要对MPC/BMA共聚物进行结构改造，并以之为载体，制备口服吸收效果更优的GLP-1受体激动剂的纳米制剂，从而使其更好地实现与奥利司他的同时给药。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种包含GLP-1受体激动剂的可供口服给药的纳米粒。

本发明的另一个目的是提供一种包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的口服药物组合物。

为了实现以上的目的，本发明一方面提供了一种包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒，所述共聚物的结构如式Ⅰ所示，

其中，x是选自0～19的任意一个整数，m:n为51:49～86:14；

所述GLP-1受体激动剂与共聚物的质量比为1:10～1:1；

所述共聚物的重均分子量为10800～61700。

进一步的，所述GLP-1受体激动剂选自艾塞那肽、利拉鲁肽、阿比鲁肽、度拉鲁肽、利西拉肽、司美鲁肽中的一种。

进一步的，所述的包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)取共聚物，将上述共聚物溶于分散相中，配制成共聚物浓度为50～200mg/mL的油相基质溶液，再将GLP-1受体激动剂分散于上述油相基质溶液形成油相，将所得油相在100～800rpm的转速下搅拌10～30min，使其混合均匀，得溶液A；

(2)取表面活性剂，以水为溶剂，配制成表面活性剂的质量浓度为0.5～5％的水相溶液，即溶液B；

(3)将步骤(1)所得溶液A滴加到步骤(2)所得溶液B中，溶液B的体积是溶液A的体积的4～20倍，500～2000rpm转速下搅拌10～14h，而后5000～15000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至表面活性剂被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得。

进一步的，所述步骤(1)中所述分散相选自乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种。

进一步的，所述步骤(2)中所述表面活性剂选自聚乙烯、明胶、羟丙甲基纤维素、吐温80中的一种。

本发明另一方面提供了包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物，包含奥利司他、如前所述包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒。

进一步的，所述包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物为口服固体制剂，所述口服固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂中的一种。

进一步的，所述包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物还包含稀释剂与润滑剂。

进一步的，所述稀释剂选自预胶化淀粉、淀粉、糊精、蔗糖、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇、乳糖、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钙中的一种或多种；所述润滑剂选自富马酸钠、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、石蜡、石蜡油、单硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、醋酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、聚乙二醇中的一种或多种。

本发明的再一目的在于提供上述包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物在制备防治肥胖的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)影响因素考察试验结果表明，本发明所提供的纳米粒的最小包封率均高于按对比文件1与对比文件2的方法所得到的纳米粒。

(2)本发明所提供的优选纳米粒对大鼠的口服生物利用度显著高于对比文件1中的纳米粒。

(3)本发明所提供的包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物可以实现奥利司他与GLP-1受体激动剂的联合口服用药，生物利用度高，具有良好的抑制体重增加和减肥效果。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显著，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于下文所披露的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下而获得的所有其他技术方案，都属于本发明保护的范围。

1共聚物及其制备方法与结构确证

本发明采用结构如式Ⅰ所示的共聚物作为载体，制备得到了所述的纳米粒。

其中，取代基R是选自以下基团中的一种：

式Ⅰ所示的共聚物未见于任何现有技术的记载。

1.1共聚物的制备

本发明采用如下所示的合成反应路线制备得到了式Ⅰ所示的共聚物，为了描述的方便，下文将其称为“共聚物1”，且根据R取代基的x从小到大依次编号为共聚物1a～1t。

以上反应式中，化合物2a～2t是结构如下式所示的环戊烯基脂肪酸：

其中，x是选自0～19中的任意一个整数。

化合物2a～2t是自然界中存在的，或商业可得的，或采用W.M.Stanley等人所报道的方法(Journal of the American Chemical Society,1929,51(5):1515～1518)从少两个碳的环戊烯基脂肪酸制备而得。

化合物3与化合物5均为常用的化工原料。

化合物7为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)，可以为市售产品，也可参考Ishihara K et al.(Polym J 1990；22:355–360.)与Ueda T et al.(Polym J 1992；24:1259–1269.)所披露的方法制备得到。

所述步骤a的反应试剂、条件与操作方法为：草酰氯，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺，二氯甲烷，-10℃。该反应是常规的酰化反应，其低温反应条件保证了对氨基的选择性酰化，操作可根据但不限于闻韧主编的《药物合成反应》(化学工业出版社2017年4月出版)与孙翠玲等人发表的《油酰乙醇胺类似物的合成》(厦门大学学报(自然科学版)，2007年第46卷第6期，808～812页)披露的方法进行。

所述步骤b的反应试剂、条件与操作方法为：对甲苯磺酸，对苯二酚，甲苯，回流。该反应是常规的酰化反应，其操作可根据但不限于闻韧主编的《药物合成反应》(化学工业出版社2017年4月出版)与武跃等人发表的《甲基丙烯酸十六酯的合成及结构表征》(大连民族学院学报，2004年第6卷第3期，10～13页)所披露的方法进行。

所述步骤c的反应试剂、条件与操作方法为：偶氮二异丁腈(AIBN)，甲醇/四氢呋喃(MeOH/THF)。该步骤操作可根据Kazuhiko Ishihara et al.发表的Preparation ofPhospholipid Polymers and Their Properties as Polymer Hydrogel Membranes.(Polymer Journal，Volume 22，Issue 5，355～360)所披露的方法进行，并根据该文献披露的方法对制备得到的共聚物1进行结构确证。具体的，取定量的化合物6a～6t、化合物7与AIBN，加入定量的甲醇/四氢呋喃(1:4)混合溶剂，配制成化合物6a～6t的质量浓度(wt％)为20％的溶液，而且AIBN的质量是化合物6a～6t与化合物7总质量的1％。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16h后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至***中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，即得对应的共聚物1a～1t。

具体地，上述步骤c中化合物6a～6t与化合物7的投料比确认方法为：以1：1作为化合物6与化合物7的最低摩尔投料比，并以所得共聚物在水中的溶解度≥50mg/mL为指标，结果如表2所示。

1.2共聚物1的结构确证

(1)¹H-NMR

本发明采用¹H-NMR(400Hz，CDCl₃)，对前述每一步反应的原料与产物进行了结构确证，并通过比较产品与原料¹H-NMR图谱数据的异同，来断定反应的发生。

需要指出的是，化合物6a～6t与化合物7以不同的摩尔比进行投料所得的不同m:n比的共聚物1的¹H-NMR图各特征峰的δ值并无显著差异(±0.05ppm之间)，只是各特征峰的相对峰面积会因为m:n的不同而存在差异，也是下文所述m:n比计算方法的依据，因此，在表1中仅给出了最大摩尔投料比所制备得到的共聚物的δ值。

表1共聚物1a～1t的¹H-NMR图谱特征

(2)共聚物1结构式中m:n比的计算

本发明通过计算共聚物1的¹H-NMR图谱中-N+(CH3)3氢的特征峰的峰面积占总氢峰面积的比例，计算了共聚物1结构中的m:n比。共聚物结构中的m:n比随着化合物6与化合物7的摩尔投料比的增加而增加，这是本领域技术人员所公知的常识，因此，本发明只计算了化合物6与化合物7以最小与最大摩尔投料比进行反应时所得共聚物1结构中的m:n比，结果如表2所示。

(3)共聚物1的分子量测定

本发明采用本领域技术人员所熟知的GPC/ALC 150C型凝胶色谱仪，在25℃下，以四氢呋喃为溶剂，以聚苯乙烯作为对照，测定了化合物6a～6t与化合物7以1:1～6:4的摩尔比投料反应所得共聚物1的重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)，并以下式计算分子量分布(D)，结果如表2所示。

表2共聚物1a～1t的m:n比与分子量测定

2.GLP-1受体激动剂

本发明所述的GLP-1受体激动剂是艾塞那肽、利拉鲁肽、阿比鲁肽、度拉鲁肽、利西拉肽、司美鲁肽中的一种，均具有多肽的结构特征。

3.包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒的制备与影响因素考察

3.1制备方法

本发明提供了包含所述GLP-1受体激动剂与共聚物1a～1t的纳米粒，所述纳米粒采用本领域技术人员所熟知的乳化-溶剂挥发法进行制备，其制备方法如下所述：

(1)取定量的共聚物(共聚物结构中的m:n设为“影响因素Ⅰ”)，将上述共聚物溶于分散相中，配制成共聚物浓度为50～200mg/mL(影响因素Ⅱ)的油相基质溶液，再将定量的所述的GLP-1受体激动剂分散于上述油相基质溶液形成油相，其中，所述GLP-1受体激动剂与共聚物1的质量比为1:10～1:1(影响因素Ⅲ)，将所得油相在100～800rpm(影响因素Ⅳ)的转速下搅拌10～30min(影响因素Ⅴ)，使其混合均匀，得溶液A；

(2)取定量的表面活性剂，以水为溶剂，配制成表面活性剂的质量浓度为0.5～5％(影响因素Ⅵ)的水相溶液，即溶液B；

(3)将步骤(1)所得溶液A滴加到步骤(2)所得溶液B中，溶液B的体积是溶液A的体积的4～20倍(影响因素Ⅶ)，500～2000rpm转速(影响因素Ⅷ)下搅拌10～14h(影响因素Ⅸ)，而后5000～15000rpm转速(影响因素Ⅹ)下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至表面活性剂被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得。

其中，所述步骤(1)中所述分散相选自乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种；所述步骤(2)中所述表面活性剂选自聚乙烯、明胶、羟丙甲基纤维素、吐温80中的一种。

3.2影响因素考察

本发明采用正交因素试验依次考察了上述制备方法中各可变的参数(影响因素Ⅰ～Ⅹ)对纳米粒包封率的影响。

其中，所述的包封率采用本领域技术人员所熟知的方法进行测定。具体的，取5～6mg纳米粒，溶于定量的二甲基亚砜中，过滤，而后对滤液进行HPLC分析，计算游离态的GLP-1受体激动剂含量，并根据以下的公式计算包封率。

如前所述的HPLC测定方法为：色谱柱：反相C18柱(250×4.6mm，粒径5μm)；检测器：UV，254nm；进样量：20μL；流动相：正辛基磷酸/乙腈/甲醇(3/4/3，V/V/V，pH5.5)；流速：1.0mL。该HPLC方法还适用于纳米粒体外缓释作用的试验。

本发明所述的正交因素试验具体操作步骤如下所述：

首先，将采用乙醇作为分散相，采用聚乙烯作为表面活性剂，并将影响因素Ⅰ～Ⅹ固定为表3所示的Q2值，计算采用不同的GLP-1受体激动剂与共聚物1a～1t时所制备得到的纳米粒的包封率。结果发现，共聚物1a～1t的种类，即结构中的x大小，对纳米粒的包封率有着显著的影响，如表4所示。

表3各影响因素接受考察的数值

表4共聚物种类对纳米粒包封率的影响

作为对比的，本发明按照对比文件1中实施例2所披露的方法，制备得到了包含艾塞那肽与丙烯酸树脂的纳米粒，并对其包封率进行了测定，结果为12.7％。

此外作为对比的，本发明采用对比文件2中所披露的PUREBRIGHT mb-37-50T与PUREBRIGHT mb-37-100T作为载体，乙醇作为分散相，聚乙烯作为表面活性剂，并将如前所述的影响因素Ⅱ～Ⅹ固定为表3所示的Q2值，采用如前所述的制备方法，制备得到了对比纳米粒。其包封率如表5所示。

表5对比纳米粒的包封率

可以看出，表4中各GLP-1受体激动剂纳米粒的最小包封率，均高于表5中对应的对比纳米粒的包封率。

本发明接下来考察了如前所述的分散相与表面活性剂的种类对纳米粒的包封率的影响。具体的，采用表4中所示各GLP-1受体激动剂纳米粒最大包封率所对应的共聚物1a～1t，并将影响因素Ⅰ～Ⅹ固定为表3所示的Q2值，采用不同的分散相与表面活性剂制备纳米，并测定所得纳米粒的包封率，结果如表6所示。

表6分散相与表面活性剂的种类对纳米粒包封率的影响

在确立了本发明所述各种GLP-1受体激动剂·共聚物1·分散相·表面活性剂的最佳搭配之后，本发明然后依次考察了影响因素Ⅰ～Ⅹ对纳米粒包封率的影响，具体的，将GLP-1受体激动剂、共聚物1、分散相与表面活性剂固定为表4、6所述的最大值所对应的数值，待考察的因素取表3所示的L、Q1、Q2、Q3与U值(其中，影响因素Ⅰ只取L、Q2与U值)，已考察的影响因素取其已确定的最佳值，未考察的因素取表3所示的Q2值，按照如前所示的方法制备纳米微粒，并测定所得纳米粒的包封率，确定影响因素的最佳值，结果如表7所示。

表7影响因素Ⅰ～Ⅹ对纳米粒包封率的影响

本发明还测定的影响因素考察中制备得到的纳米粒的平均粒径，为509±286nm(14nm～998nm)。

4.口服药物组合物

在提供了包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒的基础上，本发明进一步提供了包含奥利司他与所述纳米粒的口服药物组合物。所述的口服药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂，且均可通过本领域技术人员所熟知的方法制备而得。

具体的，本发明所述的颗粒剂的制备方法优选为将奥利司他、如前所述包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒、稀释剂以及润滑剂混合后，进行制粒，即得所述的颗粒剂。其中，所述的制粒方法为本领域技术人员所熟知的技术手段，本发明对此没有特殊限制。

本发明所述的胶囊剂的制备方法优选为将奥利司他、如前所述包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒、稀释剂以及润滑剂混合后，灌装胶囊，即得所述的胶囊剂。其中，所述的胶囊灌装方法为本领域技术人员所熟知的技术手段，本发明对此没有特殊限制。

本发明所述的片剂的制备方法优选为将奥利司他、如前所述包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒、稀释剂以及润滑剂混合后，进行压片，即得所述的片剂。本发明所述的压片方法为本领域技术人员所熟知的技术手段，本发明对此没有特殊限制。

其中，如前所述的稀释剂是选自预胶化淀粉、淀粉、糊精、蔗糖、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇、乳糖、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钙中的一种或多种。如前所述的润滑剂是选自富马酸钠、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、石蜡、石蜡油、单硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、醋酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、聚乙二醇中的一种或多种。

本发明所述的口服药物组合物中奥利司他、如前所述包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒、稀释剂与润滑剂的用量可采用本领域技术人员熟知的技术手段进行确定。

实施例1化合物4k的制备与结构确证

制备：取0.252g化合物2k(1mmol)，溶于5mL二氯甲烷中，-10℃下搅拌5分钟后，向其中缓缓滴加0.087mL草酰氯(1mmol)的5mL二氯甲烷溶液，20分钟内滴完，再滴加一滴N,N-二甲基甲酰胺，-10℃下继续搅拌2h，得溶液A；另取0.063mL氨基乙醇(1.05mmol)，溶于5mL二氯甲烷中，再向其中滴加0.276mL三乙胺(2mmol)，-10℃下搅拌均匀，得溶液B。将溶液A缓缓滴加到溶液B中，-10℃下继续搅拌2h。反应液用10mL 10％碳酸钠溶液洗涤，水层用二氯甲烷萃取(3×5mL)，有机层用10mL饱和食盐水洗涤。合并前述所有的有机相后用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，粗产品用快速硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:1，V/V)纯化，得0.251g白色固体，产率85.1％。

结构确证：

化合物2k：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.068(1H，dd)，5.600(1H，m)，2.844(1H，m)，2.309～2.245(2H，m)，2.188(2H，t)，1.964(1H，m)，1.741(1H，m)，1.569(2H，m)，1.341～1.234(16H，m)。

化合物4k：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.062(1H，dd)，5.616(1H，m)，3.477(2H，t)，3.227(2H，t)，2.831(1H，m)，2.342～2.246(2H，m)，2.107～1.943(3H，m)，1.748(1H，m)，1.530(2H，m)，1.298～1.244(16H，m)。

实施例2化合物6k的制备与结构确证

制备：取0.296g化合物4k(1mmol)、10mL甲苯、0.125g对甲苯磺酸与0.038g对苯二酚，混合后置于配备有分水器的三颈烧瓶中，加热搅拌至固体全部溶解，再向所得混合体系中加入0.130g甲基丙烯酸(1.5mmol)。继续加热升温至回流温度，水与甲苯共沸，同时被蒸出。待分水器中的水量与理论值相当时(约0.018g)，减压蒸馏除去未反应的甲基丙烯酸与甲苯。将烧瓶中的粗酯冷却至室温，加入适量石油醚完全溶解，用包含5％碳酸钠与1％氢氧化钠的碱液中和洗涤至微碱性，除去少量的甲苯和甲基丙烯酸、对甲苯磺酸与对苯二酚，再用蒸馏水洗至中性，后用无水氯化钙干燥，过滤后蒸出石油醚，得0.318g灰白色固体，产率87.5％。

结构确证：

化合物6k：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.503(1H，s)，6.429(1H，s)，6.221(1H，dd)，5.601(1H，m)，4.560(2H，t)，3.306(2H，t)，2.820(1H，m)，2.35(1H，m)，2.216(1H，m)，2.117(2H，t)，1.986～1.980(4H，m，1.985处有呈强吸收的单峰)，1.733(1H，m)，1.506(2H，m)，1.319～1.312(4H，m)，1.289～1.245(12H，m)。

实施例3 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物7，MPC)的制备与结构确证

制备：

(1)取20g HEMA与15.6mg三乙胺，置于500mL三颈瓶中，再加入200mL无水四氢呋喃溶解上述固体。将所得溶液降温至-20℃后搅拌下滴21.9g COP的100mL无水四氢呋喃溶液，1h滴加完毕，再于-20℃～-30℃下反应3h，过滤除去析出的氯化三乙铵固体，所得滤液减压蒸馏。向蒸馏后的残留物中加入50mL无水***，过滤除去析出的少量氯化三乙铵，滤液减压蒸馏，即得呈无色液体状的中间体OPEMA 32.6g。

(2)取5.0g OPEMA溶于30mL无水乙腈中后置于200mL玻璃耐压瓶中，降温至-20℃后向其中迅速加入2mL无水三甲胺。密封耐压瓶，升温至60℃反应16h后，降温至-20℃，氩气氛下过滤析出的白色固体，而后减压干燥，即得MPC(化合物7，3.1g)。

结构确证：化合物7：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.102(1H，s)，5.608(1H，s)，4.263(4H，m)，4.051(2H，t，J＝6.1)，3.757(2H，t，J＝6.1)，3.322(9H，s)，1.902(3H，s)，与文献报道相一致。

实施例4共聚物1k(m:n＝76:24)的制备

取3.61g化合物6k(0.01mol)、0.99g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物7，MPC，3.33mmol)与0.046g AIBN，加定量甲醇/四氢呋喃(1/4，v/v)的混合溶剂，配制成化合物6b的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16h后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至正庚烷中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体4.08g。

实施例5化合物4m的制备与结构确证

制备：取0.280g化合物2m(1mmol)，溶于5mL二氯甲烷中，-10℃下搅拌5min后，向其中缓缓滴加0.087mL草酰氯(1mmol)的5mL二氯甲烷溶液，20min内滴完，再滴加一滴N,N-二甲基甲酰胺，-10℃下继续搅拌2h，得溶液A；另取0.063mL氨基乙醇(1.05mmol)，溶于5mL二氯甲烷中，再向其中滴加0.276mL三乙胺(2mmol)，-10℃下搅拌均匀，得溶液B。将溶液A缓缓滴加入溶液B中，-10℃下继续搅拌2h。反应液用10mL 10％碳酸钠溶液洗涤，水层用二氯甲烷萃取(3×5mL)，有机层用10mL饱和食盐水洗涤。合并前述所有的有机相后用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，粗产品用快速硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:1，V/V)纯化，得0.255g白色固体，产率78.9％。

结构确证：

化合物2m：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.251(1H，dd)，5.582(1H，m)，2.839(1H,m)，2.332(1H，m)，2.234～2.218(3H，m)，1.969(1H，m)，1.705(1H，m)，1.518(2H，m)，1.331～1.248(20H，m)

化合物4m：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.247(1H，dd)，5.571(1H，m)，3.493(2H，t)，3.205(2H，t)，2.827(1H，m)，2.309～2.236(2H，m)，2.135(2H，t)，1.958(1H，m)，1.709(1H，m)，1.553(2H，t)，1.288～1.267(20H，m)。

实施例6化合物6m的制备与结构确证

制备：取0.324g化合物4m(1mmol)、10mL甲苯、0.126g对甲苯磺酸与0.036g对苯二酚，混合后置于配备有分水器的三颈烧瓶中，加热搅拌至固体全部溶解，再向所得的混合体系中加入0.129g甲基丙烯酸(1.5mmol)。继续加热升温至回流温度，水与甲苯共沸，同时被蒸出。待分水器中的水量与理论值相当时(约0.018g)，减压蒸馏除去未反应的甲基丙烯酸与甲苯。将烧瓶中的粗酯冷却至室温，加入适量石油醚完全溶解，用包含5％碳酸钠与1％氢氧化钠的碱液中和洗涤至微碱性，除去少量的甲苯和甲基丙烯酸、对甲苯磺酸与对苯二酚，再用蒸馏水洗至中性，后用无水氯化钙干燥，过滤后蒸出石油醚，得灰0.371g白色固体粉末，产率93.1％。

结构确证：

化合物6m：¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：6.472(1H，s)，6.418(1H，s)，6.204(1H，dd)，5.601(1H，m)，4.564(2H，t)，3.296(2H，t)，2.825(1H，m)，2.305～2.259(2H，m)，2.150(2H，t)，1.999(3H，s)，1.959(1H，m)，1.700(1H，m)，1.531(2H，m)，1.316～1.227(20H，m)。

实施例7共聚物1m(m:n＝76:24)的制备

取3.91g化合物6m(0.01mol)、0.99g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(化合物7，MPC，3.33mmol)与0.049g AIBN，加定量甲醇/四氢呋喃(1：4，v/v)的混合溶剂，配制成化合物6m的质量浓度(wt％)为20％的溶液。将所得溶液移至聚合反应管中后，向溶液中通入氩气以除去溶液中的氧气。密封反应管，并在60℃下震荡16h后冷却，以中止聚合反应。将反应液倾倒至***中，过滤收集析出的固体，真空下干燥，得固体4.25g。

实施例8包含艾塞那肽与共聚物1k(m:n＝76:24)的纳米粒(编号为“纳米粒_EXE”)的制备

取1g实施例4制备得到的共聚物1k，将其溶于二氯甲烷中，配制成共聚物1k浓度为125mg/mL的油相基质溶液，取0.18g艾塞那肽分散于上述基质溶液形成油相。将所得的油相在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A。取定量的羟丙甲基纤维素，以水为溶剂，配制成羟丙甲基纤维素的浓度为(w/w)2.75％的水相溶液，即溶液B。将溶液A滴加到溶液B中，其中，溶液B的体积是溶液A体积的12倍，1250rpm转速下搅拌12h。而后1000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至羟丙甲基纤维素被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得目标纳米粒。

实施例9包含利拉鲁肽与共聚物1m(m:n＝76:24)的纳米粒(编号为“纳米粒_LIR”)的制备

取1g实施例7制备得到的共聚物1m，将其溶于乙醇中，配制成共聚物1m浓度为125mg/mL的油相基质溶液，取0.18g利拉鲁肽分散于上述基质溶液形成油相。将所得的油相在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A。取定量的聚乙烯，以水为溶剂，配制成聚乙烯为(w/w)2.75％的水相溶液，即溶液B。将溶液A滴加到溶液B中，其中，溶液B的体积是溶液A体积的12倍，1250rpm转速下搅拌12h。而后1000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至聚乙烯被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得目标纳米粒。

实施例10包含阿比鲁肽与共聚物1k(m:n＝76:24)的纳米粒(编号为“纳米粒_ALB”)的制备

取1g实施例4制备得到的共聚物1k，将其溶于二氯甲烷中，配制成共聚物1k浓度为125mg/mL的油相基质溶液，取0.18g阿比鲁肽分散于上述基质溶液形成油相。将所得的油相在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A。取定量的吐温80，以水为溶剂，配制成吐温80的浓度为(w/w)2.75％的水相溶液，即溶液B。将溶液A滴加到溶液B中，其中，溶液B的体积是溶液A体积的12倍，1250rpm转速下搅拌12h。而后1000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至吐温80被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得目标纳米粒。

实施例11包含度拉鲁肽与共聚物1k(m:n＝76:24)的纳米粒(编号为“纳米粒_DUL”)的制备

取1g实施例4制备得到的共聚物1k，将其溶于二氯甲烷中，配制成共聚物1k浓度为125mg/mL的油相基质溶液，取0.18g度拉鲁肽分散于上述基质溶液形成油相。将所得的油相在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A。取定量的吐温80，以水为溶剂，配制成吐温80的浓度为(w/w)2.75％的水相溶液，即溶液B。将溶液A滴加到溶液B中，其中，溶液B的体积是溶液A体积的12倍，1250rpm转速下搅拌12h。而后1000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至吐温80被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得目标纳米粒。

实施例12包含利西拉肽与共聚物1m(m:n＝76:24)的纳米粒(编号为“纳米粒_LIX”)的制备

取1g实施例7制备得到的共聚物1m，将其溶于三氯甲烷中，配制成共聚物1m浓度为125mg/mL的油相基质溶液，取0.18g利西拉肽分散于上述基质溶液形成油相。将所得的油相在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A。取定量的明胶，以水为溶剂，配制成明胶的浓度为(w/w)2.75％的水相溶液，即溶液B。将溶液A滴加到溶液B中，其中，溶液B的体积是溶液A体积的12倍，1250rpm转速下搅拌12h。而后1000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至明胶被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得目标纳米粒。

实施例13包含司美鲁肽与共聚物1m(m:n＝76:24)的纳米粒(编号为“纳米粒_SEM”)的制备

取1g实施例7制备得到的共聚物1m，将其溶于乙醇中，配制成共聚物1m浓度为125mg/mL的油相基质溶液，取0.18g司美鲁肽分散于上述基质溶液形成油相。将所得油相在450rpm的转速下搅拌20min，使其混合均匀，得溶液A。取定量的聚乙烯，以水为溶剂，配制成聚乙烯的浓度为(w/w)2.75％的水相溶液，即溶液B。将溶液A滴加到溶液B中，其中，溶液B的体积是溶液A的12倍，1250rpm转速下搅拌12h。而后1000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至聚乙烯被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得目标纳米粒。

实施例14包含奥利司他与纳米粒_EXE的颗粒剂的制备

取120g奥利司他、实施例8制备得到的纳米粒_EXE(含18mg艾塞那肽)、90g预胶化淀粉、0.6g硬脂酸镁，混合后制粒，分装成1000袋，即得。

实施例15包含奥利司他与纳米粒_LIR的颗粒剂的制备

取120g奥利司他、实施例9制备得到的纳米粒_LIR(含2.6g利拉鲁肽)、85克糊精、0.8g单硬脂酯甘油酯，混合后制粒，分装成1000袋，即得。

实施例16包含奥利司他与纳米粒_ALB的胶囊剂的制备

取120g奥利司他、实施例10制备得到的纳米粒_ALB(含76g阿比鲁肽)、95g微晶纤维素、0.6g单棕榈酸甘油酯，混合后灌装成1000粒胶囊，即得。

实施例17包含奥利司他与纳米粒_DUL的胶囊剂的制备

取120g奥利司他、实施例11制备得到的纳米粒_DUL(含2.2g度拉鲁肽)、85g山梨醇、0.6g月桂醇硫酸镁，混合后灌装成1000粒胶囊，即得。

实施例18包含奥利司他与纳米粒_LIX的片剂的制备

取120g奥利司他、实施例12制备得到纳米粒_LIX(含28mg利西拉肽)、96g甘露醇、0.8g月桂醇硫酸钠，混合后压成1000片，即得。

实施例19包含奥利司他与纳米粒_SEM的片剂的制备

取120g奥利司他、实施例13制备得到的纳米粒_SEM(含1.5g司美鲁肽)、90g乳糖、0.8g聚乙二醇，混合后压成1000片，即得。

试验例一、包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒口服给药后在大鼠体内的生物利用度研究

1、试验药物：实施例8制备的纳米粒_EXE，按照对比文件1实施例2所披露的方法制备得到的纳米粒(对比纳米粒)，所有纳米粒均在临用前用饮用水配制成依GLP-1受体激动剂计浓度为10μg/mL的溶液；艾塞那肽，用注射用水配制成浓度为5μg/mL的注射用溶液。

2、试验动物：SD大鼠，12只，雌雄各半，体重200±20g。

3、试验方法：

将SD大鼠随机分为三组，每组平均4只，雌雄各半，均可自由进食与饮水。

两组大鼠分别用本发明纳米粒_EXE、对比纳米粒一次性灌胃给药，剂量均为300μg/kg；另一组大鼠用艾塞那肽注射液皮下注射给药，剂量为50μg/mL。每只大鼠均在灌胃给药0、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、30h、48h与75h后经由尾静脉取血，每只每次200μL。所有血浆样品均加入肝素用于抗凝，而后立即在4℃与3000×g转速下离心5min，并用艾塞那肽EIA试剂盒对样品中的艾塞那肽进行定量分析，再根据下式计算纳米粒口服后的相对生物利用度。

4、试验结果：

经计算，本发明实施例8制备的纳米粒_EXE的相对生物利用度显著高于对比文件1实施例2制备的纳米粒(63.5％Vs.16.9％)。

试验例二、包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物对营养性肥胖大鼠的减肥作用研究

1、试验动物：选取70只雄性清洁级SD大鼠，体重约80g，由中山大学实验动物中心提供。

2、试验用饲料：普通饲料和营养型饲料均由中山大学实验动物中心提供，两种饲料的组成如表8所示。

3、试验药物：实施例16制得的包含奥利司他与纳米粒_ALB的胶囊剂(组合物A组)、实施例17制得的包含奥利司他与纳米粒_DUL的胶囊剂(组合物B组)，奥利司他胶囊(奥利司他组，规格为120mg，中山万汉制药有限公司生产)，所有胶囊剂均在临用前取其内容物，并用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成3g/L(依奥利司他计)的灌胃液，按60mg/kg/d的剂量(依奥利司他计)灌胃。另取实施例10制备得到的纳米粒_ALB(纳米粒A组)与实施例11制备得到的纳米粒_DUL(纳米粒B组)，以0.5％羧甲基纤维素钠溶液为溶剂配成浓度分别为1.9g/L(依阿比鲁肽计)与0.055g/L(依度拉鲁肽计)的灌胃液，分别按38mg/kg/d(依阿比鲁肽计)与1.1mg/kg/d(依度拉鲁肽计)的剂量灌胃。

4、试验方法：

4.1造模、分组及给药

依据《中药药效学研究与评价》中肥胖症药效学研究与评价方法，采用预防肥胖模型法。将试验动物按体重随机分为7组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、奥利司他组、纳米粒A组、纳米粒B组、组合物A组、组合物B组。

各组动物于每天上午9时给空白对照组喂普通饲料，模型对照组和实验组喂营养型饲料，晚上7时取走食物，每天定量给食(以多数动物吃完为原则每日调整饲料给予量)。实验组在上午9时和下午3时分2次按10mL·kg^-1用对应药物溶于0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃，空白对照组和模型对照组灌胃等体积0.5％CMC-Na溶液，连续7周。

5、试验结果：

试验结果如表9所示。

表8：普通饲料和营养型饲料的组成

表9：试验前后各组大鼠体重变化情况比较

由表9可以看出，试验后，模型对照组大鼠的体重明显高于空白对照组，这说明营养性肥胖症大鼠造模成功。与模型对照组相比，纳米粒A组、纳米粒B组大鼠的体重及增重变化较明显，这说明，纳米粒_ALB、纳米粒_DUL有减轻大鼠体重的作用，同时也说明本发明以共聚物为载体制得的包含GLP-1受体激动剂的可供口服给药的纳米粒对大鼠的口服生物利用度高，具有良好的抑制体重增加和减肥效果。与模型对照组相比，奥利司他组、组合物A组、组合物B组大鼠的体重及增重变化较明显，这说明，奥利司他及包含奥利司他与纳米粒_ALB的胶囊剂、包含奥利司他与纳米粒_DUL的胶囊剂具有较好的抑制体重增加和减肥效果。与奥利司他组、纳米粒A组、纳米粒B组相比，组合物A组、组合物B具有更好的抑制体重增加和减肥效果。由此可见，本发明中，包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒与奥利司他配合使用后，两者起到了协同增效的作用。

Claims (10)

1.一种包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒，其特征在于，所述共聚物的结构如式Ⅰ所示，

其中，x是选自0～19的任意一个整数，m:n为51:49～86:14；

所述GLP-1受体激动剂与共聚物的质量比为1:10～1:1；

所述共聚物的重均分子量为10800～61700。

2.如权利要求1所述的包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒，其特征在于，所述GLP-1受体激动剂选自艾塞那肽、利拉鲁肽、阿比鲁肽、度拉鲁肽、利西拉肽、司美鲁肽中的一种。

3.如权利要求1所述的包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取共聚物，将上述共聚物溶于分散相中，配制成共聚物浓度为50～200mg/mL的油相基质溶液，再将GLP-1受体激动剂分散于上述油相基质溶液形成油相，将所得油相在100～800rpm的转速下搅拌10～30min，使其混合均匀，得溶液A；

(2)取表面活性剂，以水为溶剂，配制成表面活性剂的质量浓度为0.5～5％的水相溶液，即溶液B；

(3)将步骤(1)所得溶液A滴加到步骤(2)所得溶液B中，溶液B的体积是溶液A的体积的4～20倍，500～2000rpm转速下搅拌10～14h，而后5000～15000rpm转速下高速离心，收集所得的纳米粒，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至表面活性剂被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得。

4.如权利要求3所述的包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述分散相选自乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种。

5.如权利要求3所述的包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述表面活性剂选自聚乙烯、明胶、羟丙甲基纤维素、吐温80中的一种。

6.一种包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物，其特征在于，包含奥利司他和权利要求1所述的包含GLP-1受体激动剂与共聚物的纳米粒。

7.如权利要求6所述的包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物，其特征在于，还包含稀释剂与润滑剂。

8.如权利要求7所述的包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物，其特征在于，所述稀释剂选自预胶化淀粉、淀粉、糊精、蔗糖、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇、乳糖、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钙中的一种或多种；所述润滑剂选自富马酸钠、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、石蜡、石蜡油、单硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、醋酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、聚乙二醇中的一种或多种。

9.如权利要求6所述的包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物，其特征在于，所述组合物为口服固体制剂，所述口服固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂中的一种。

10.如权利要求6-9任一项所述的包含奥利司他与GLP-1受体激动剂的组合物在制备防治肥胖的药物中的用途。