CN109001349A - 一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法 - Google Patents

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Abstract

一种液质法检测β‑***类残留的快速前处理方法，其特征在于包括以下步骤：S1.提取：待测组织样品检测采用内标法，乙腈水振荡超声提取β‑***类兽药残留；S2.净化：提取后上清液过固相萃取柱净化，洗脱液氮吹干，复溶后供上机检测。本发明提供的技术方案较现有技术而言具有较大进步，主要体现在：本发明提供的技术方案较现有技术而言具有较大进步，主要体现在：快速简单，一般前处理一个样品的时间仅仅需要1个小时，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是内标回收结果稳定。

Description

一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及畜产品中β-***残留的检测方法，具体涉及利用乙腈水对待测样品进行快速前处理的方法。
背景技术
近几年，随着农产品质量安全事件频发，令人们神经紧绷，农产品质量安全问题已成为社会高度关注的四大问题之一。β-***类药物实际上是对禁用药物的统称，俗称“瘦肉精”，常用的包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等十几种物质，目前，主要是添加到饲料中，促进动物蛋白质的合成，加速脂肪的转化和分解，提高瘦肉率。而一旦沉积在肌肉中被人摄入以后，会产生心跳过快、四肢肌肉颤动、头晕乏力等神经中枢中毒症状，严重可导致死亡，对人类健康构成了极大地威胁。
目前国内外已有很多关于动物源性食品中兽药残留检测的分析研究，检测兽药残留仪器主要是速测仪、色谱仪、色谱质谱联用仪。能够比较准确定性定量检测仪器主要是色谱仪和色谱质谱联用仪。在前处理技术方面，与蔬菜中农药残留分析相比，由于肌肉组织基质比较复杂，相对快速简单地前处理方法在兽药残留检测中应用很有限。目前较为常见的方法是：
1.取待测组织样品，加入内标后加入乙腈-异丙醇混合溶液；
2.依次涡旋混合、振荡、离心后取清液待处理。
之后进行净化的方法大同小异，但该类方法存在以下明显的缺点：
1.耗时长，由于酶解时间较长，因此前处理时长要4个小时左右；
2.省略酶解步骤的话，对莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等苯酚型结构的药物影响较大，内标回收不稳定。
针对上述问题，我们需要作出一些改进。
发明内容
为解决现有方法检测时间长、内标回收不稳定的问题，本发明提供了一种耗时短、内标回收稳定的液质法检测β-***类残留的快速前处理方法。
本发明的具体技术方案是：
一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.提取：待测组织样品检测采用内标法，乙腈水振荡超声提取β-***类兽药残留；
S2.净化：提取后上清液过固相萃取柱净化，洗脱液氮吹干，复溶后供上机检测。
优选地，所述S1中乙腈水体积比为80％，含0.3％乙酸。
优选地，所述S1中待测组织样品的质量(单位：g)与乙腈水体积(mL)之间的数值比例为1:3。
优选地，所述S1中涡旋的时间设定为30秒。
优选地，所述S1中水平振荡的时间设定为10分钟。
优选地，所述S1中超声提取的时间设定为5分钟。
优选地，所述S1中离心的时间设定为5分钟，转速设定为8000r/min。
本发明提供的技术方案较现有技术而言具有较大进步，主要体现在：
快速简单，一般前处理一个样品的时间仅仅需要1个小时，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是内标回收结果稳定。
具体实施方式
以下结合现有技术及实施例对本发明所揭示的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法作进一步阐释。
1.现有技术采用的前处理方法。
现有技术(内标法)准确称取2.00g(±0.02g)均匀猪肝(或牛肉)试样，加入适量内标，再加入6.00mL乙腈-异丙醇混合溶液(4:1，v/v)，涡旋混匀后，振荡10min，10000r/min离心5min，取全部上清液于55℃下氮吹至近干。加入0.2mol/L乙酸铵缓冲液(pH＝5.2)2mL，充分溶解，再加入40μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，55℃条件下避光水浴振荡2h左右。取出后至室温，加甲醇4mL，涡旋混匀，肌肉组织8000r/min离心5min，上清液备用；肝脏组织8000r/min离心5min，上清液转移至新的离心管，加3mL正己烷，涡旋后，8000r/min离心5min，取全部下清待净化备用；固相萃取小柱依次用甲醇、2％甲酸溶液各5mL活化，取全部备用液过柱，再依次用2％甲酸溶液、甲醇各5mL淋洗抽干，最后用5％氨水甲醇溶液5mL洗脱；洗脱液于50℃下氮吹干，用0.5mL甲醇-0.1％甲酸溶液(1:9，v/v)复溶，涡旋混匀，过0.22μm有机系微孔滤膜，供上机待测。
2.本发明采用的技术方案。
准确称取2.00g(±0.02g)均匀猪肝(或牛肉)试样，加入适量内标，再加入6.00mL80％乙腈水(含0.3％乙酸)，涡旋30s，中速水平振荡10min，超声提取5min，8000r/min离心5min，取全部上清液待净化，以下净化过程同现有技术。
现有技术采用的方案和本发明采用的方案均是在以下条件下进行：
1.色谱条件
色谱柱：C18柱(Rapid Resolution HD 2.1×10 0mm，1.8-Micron)；流动相：A相为0.1％(v/v，下同)甲酸水(含5mM的乙酸铵)，B相为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序：0—4.0min，从80％A变为60％A，4.0—4.5min，从60％A变为10％A，4.5—6.0min，保持10％A；6.0—6.10min从10％A变为80％A，6.10—10.00min，保持80％A；流速：0.4ml/min；进样量：1.0μL；时间：10min；柱温：30℃。
2.质谱条件
电离模式：电喷雾正离子(ESI+)；毛细管电压：40kV；离子源温度：350℃；干燥气流速：11L/min，雾化器压力：45psi；采集方式：多反应监测扫描模式(MRM)；增加电压(+)：200V。
表1：7种β-***及同位素内标的保留时间、定量离子对、定性离子对、锥孔电压和碰撞能量
表2：猪肝基质7种β-***的加标回收情况
备注：猪肝基质中均未检测出上述兽药；同位素内标浓度均为5μg/kg。
表3：牛肉基质7种7种β-***的加标回收情况
备注：牛肉基质中均未检测出上述兽药；同位素内标浓度均为5μg/kg。
现有技术采用的方案与本发明采用的方案得出的结果与分析
现有技术：
从表2可以看出，在猪肝中添加七种β-***类药物，在低浓度(0.5μg/kg)时加标回收率在84.63-118.59％，RSD在6.71-12.75％；在中等浓度水平时(1μg/kg)加标回收率在78.56-112.17％，RSD在1.70-10.15％；在高浓度水平时(2μg/kg)加标回收率在76.32-106.80％，RSD在1.57-8.26％。从表3可以看出，现有技术在牛肉中加标回收情况，在低浓度(0.5μg/kg)时加标回收率在100.03-119.05％，RSD在7.58-14.15％；在中等浓度水平时(1μg/kg)加标回收率在80.49-102.77％，RSD在2.18-8.35％；在高浓度水平时(2μg/kg)加标回收率在81.92-105.33％，RSD在2.14-11.53％。
本发明：
从表2可以看出，本发明在猪肝中添加七种β-***类药物，在低浓度(0.5μg/kg)时加标回收率在87.64-117.00％，RSD在3.48-12.73％；在中等浓度水平时(1μg/kg)加标回收率在80.23-96.89％，RSD在1.82-9.83％；在高浓度水平时(2μg/kg)加标回收率在91.58-109.25％，RSD在2.37-12.12％。从表3可以看出，本发明在牛肉中加标回收情况，在低浓度(0.5μg/kg)时加标回收率在98.54-116.63％，RSD在7.88-12.22％；在中等浓度水平时(1μg/kg)加标回收率在96.07-108.25％，RSD在0.85-7.31％；在高浓度水平时(2μg/kg)加标回收率在91.14-109.52％，RSD在3.15-11.26％。
现有技术与本发明之间的结果对比：
QuEChERS法自2003年由Anastassiades等提出以来，广泛的应用于农兽药残留检测分析，但是在动物源性食品检测中应用较少。QuEChERS法步骤相对简单，也比较深得检测人员的青睐。根据江苏省畜产品例行监测β-***类判定值为1μg/kg，笔者从0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg三个浓度梯度设计试验，采用在空白猪肝和牛肉样品中添加药物计算回收率来评价前处理效果，由表2和表3可以看出，检测β-***类残留的两种前处理方法的回收率均比较稳定，在76.32-119.05％的范围内，且RSD均在15％之内，且七种药物标准曲线在0.625-20μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，均符合检测技术方法要求。但是现有技术前处理一个样品需要花费时间在4h左右，主要是因为酶解时间比较长，笔者也尝试过乙腈-异丙醇混合溶液(4:1，v/v)提取，省略酶解步骤的前处理，但是结果不是特别理想，尤其是对莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等苯酚型结构的药物影响较大，加标回收结果不是很满意。本发明采用酸化的乙腈水经过振荡超声充分提取，用固相填料进行萃取净化，快速简洁，一般前处理一个样品需要花费1h左右，与现有技术相比，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是，两种前处理方法加标回收结果均比较稳定，且结果比较接近，均比较满意。
以上实施例是对本发明的具体实施方式的说明，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。

Claims (7)

1.一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.提取：待测组织样品检测采用内标法，乙腈水振荡超声提取β-***类兽药残留；
S2.净化：提取后上清液过固相萃取柱净化，洗脱液氮吹干，复溶后供上机检测。
2.根据权利要求1所述的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于：所述S1中乙腈水体积比为80％，含0.3％乙酸。
3.根据权利要求1所述的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于：所述S1中待测组织样品的质量(单位：g)与乙腈水体积(mL)之间的数值比例为1:3。
4.根据权利要求1所述的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于：所述S1中涡旋的时间设定为30秒。
5.根据权利要求1所述的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于：所述S1中水平振荡的时间设定为10分钟。
6.根据权利要求1所述的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于：所述S1中超声提取的时间设定为5分钟。
7.根据权利要求1所述的一种液质法检测β-***类残留的快速前处理方法，其特征在于：所述S1中离心的时间设定为5分钟，转速设定为8000r/min。
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