CN109001333A

CN109001333A - 液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法

Info

Publication number: CN109001333A
Application number: CN201811045710.0A
Authority: CN
Inventors: 严忠雍; 张小军; 陈思; 方益
Original assignee: Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Current assignee: Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明属于毒素检测技术领域。本发明公开了一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，从提取试剂、固相萃取柱、上样液、洗脱液四个方面优化前处理步骤，建立了贝类中短裸甲藻毒素的高效液相色谱‑串联质谱检测方法。本发明中的前处理方法简单，灵敏度高，稳定性好，适用于贝类中3种短裸甲藻毒素的同时测定，本发明中的检测方法液相色谱串联质谱定量分析贝类中3种短裸甲藻毒素，回收率高，重复性好，定量限达到3.0μg/kg，方法稳定可靠，灵敏度高，满足目前对短裸甲藻毒素的分析检测需要，具有推广应用价值，有利于海洋生态环境监测和污染源的调查追踪。

Description

液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法

技术领域

本发明涉及毒素检测技术领域，尤其是涉及一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法。

背景技术

短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是一类聚醚类的脂溶性藻毒素，主要是由双鞭甲藻及裸甲藻属部分藻类产生的赤潮藻毒素。短裸甲藻毒素是由10到11个环状结构构成的大环多醚类物质，是较强的钠通道激活毒素，可以与钠通道受体靶部位VI结合，开启兴奋膜上的钠通道，可以使细胞膜对钠离子的通透性增强，活化电压门控钠通道，产生较强的细胞去极化作用，引起神经肌肉兴奋的传导发生改变，因此也称为神经性贝类毒素。短裸甲藻毒素具有热稳定性，使其在贝类等生物体中的消除半衰期长达数十天甚至数月，加热、微波等常规加工方式因降低了水产品中的含水量而导致毒素浓度更高并导致消费者产生诸如恶心、呕吐、腹泻、麻痹、昏迷等中毒症状。2014年7月东海海域温州海区发生赤潮，通过对此海区的贝类样品调查分析，发现海区内贝类样品短裸甲藻毒素含量为1.23-10.41μg/kg；2017年6月浙江宁波海域爆发了以短裸甲藻为优势种的有毒赤潮，虽然含量不高，但对人体健康造成潜在危害，有必要加强水产品中短裸甲藻毒素的检测工作，以利于监测海洋生态环境和保障水产品质量安全。

目前，短裸甲藻毒素的分析法主要有小鼠生物法、细胞毒性实验、放射免疫法、酶联免疫法和液相色谱串联质谱法。其中，小鼠生物法是发展最早、应用最广泛的分析方法，但无法精确定量毒素的含量；酶联免疫法虽检测时间短，但易出现交叉反应；而高效液相色谱串联质谱法结合高效液相色谱的色谱分离能力与质谱高灵敏度的定性定量能力，成为检测分析的首选方法。贝类除了含有脂肪、蛋白质、色素等杂质外，通常还含有分泌黏液，导致液液萃取过程中经常出现乳化的现象，同时也吸附一部分目标物，造成回收率低的状况。

发明内容

为解决现有技术中存在的检测方法步骤繁杂，检测灵敏度过低并且无法同时检测3种短裸甲藻毒素的问题，本发明提供了一种可以提高检测效率和检测灵敏度并且同时能够检测 3种短裸甲藻毒素的液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，包括以下步骤：

a)提取：称取1.00g的待测样品，置于离心管A中，加入4mL有机提取剂，涡旋振荡2分钟，常温超声振荡10分钟，5000rpm转速离心6分钟，接着将上清液转移至离心管B中，往离心管B中加入16mL水，超声振荡0.5分钟，制得待净化的混合液；

b)将待净化的混合液加至已用10mL活化液活化的C₁₈固相萃取柱，上样结束后，用5mL淋洗液淋洗处理，抽干柱内残留液并弃用全部流出液，再用3mL洗脱液进行洗脱，用离心管C收集洗脱液，漩涡振荡1分钟，经有机相微孔滤膜过滤，制得待测液；

c)分析测定：在超高效液相色谱-串联质谱的多反应监测模式下针对待测液中的3种短裸甲藻毒素进行定性定量分析。

作为优选，步骤c)分析测定中，

液相色谱测试条件如下：色谱柱为ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈柱(2.1mm×100mm，1.7 μm)，进样体积10μL，样品室温度4℃，柱温40℃，流速0.2mL/min，流动相A为含有 0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～0.5min，50％流动相A；0.5～ 1.5min，50％～35％流动相A；1.5～9.0min，35％流动相A；9.0～10min，35％～50％流动相 A；10～11min，50％流动相A；

质谱检测条件如下：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式为多反应监测模式；毛细管电压为3.0kV；离子源温度为150℃；脱溶剂气温度为450℃；锥孔气流量为150L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流量：150L/h；脱溶剂气流量：600L/h。

作为优选，待测样品为经粉碎充分匀质后的待测贝类样品。

作为优选，有机提取剂为丙酮、甲醇或乙腈中的一种。

作为优选，有机提取剂为丙酮。

作为优选，离心管A为15mL的离心管，离心管B为50mL的离心管。

作为优选，活化液为20vol％的丙酮水溶液。

作为优选，淋洗液为20vol％的甲醇水溶液。

作为优选，洗脱液为乙腈。

作为优选，有机相微孔滤膜的孔径为0.22μm。

因此，本发明具有以下有益效果：本发明中的前处理方法简单，灵敏度高，稳定性好，适用于贝类中3种短裸甲藻毒素的同时测定；本发明中的检测方法液相色谱串联质谱定量分析贝类中3种短裸甲藻毒素，回收率高，重复性好，定量限达到3.0μg/kg，方法稳定可靠，灵敏度高，满足目前对短裸甲藻毒素的分析检测需要，具有推广应用价值，有利于海洋生态环境监测和污染源的调查追踪。

附图说明

图1为液相条件未优化的样品MRM图；

图2为液相条件优化后的样品MRM图；

图3为BTXs在不同比例乙腈中对应的响应值；

图4为BTXs二级离子质谱图；

图5为不同洗脱体积的乙腈对短裸甲藻毒素回收率的影响；

图6为3.0μg/kg加标贻贝样品的MRM图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料均可从市场上购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

以下实施例及测试条件的确定及优化过程中军采用以下仪器和试剂：

ACQUITYTM I-Class超高效液相色谱Xevo TQ-S质谱仪(美国Waters公司)；SPE-24固相萃取装置(美国supelco公司)；MS3Digital漩涡混合器(德国IKA公司)；Centrifuge5810 高速离心机(德国Eppendorf公司)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation公司)；Sep-Pak Vac C₁₈固相萃取柱(6mL，1000mg，美国Waters公司)。

BTX-A、BTX-B、BTX-C短裸甲藻毒素标准品(均为100μg，中国台湾ALGALCHEM 公司)；甲酸、乙酸铵(色谱纯，美国Sigma公司)；乙腈、甲醇、丙酮(色谱纯，德国Merck 公司)；实验用水为经Millipore***处理的超纯水。

短裸甲藻毒素混合标准储备液(10μg/mL)：用甲醇溶解BTX-A、BTX-B、BTX-C 短裸甲藻毒素标准品，混合定容至10mL，-20℃保存，有效期6个月。

短裸甲藻毒素混合标准使用液(1μg/mL)：移取1mL短裸甲藻毒素混合标准储备液，用甲醇稀释配成1μg/mL混合溶液，-20℃保存，有效期1个月。

一、实施例1

一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，具体操作步骤如下：

a)称取1.00g(准确到0.01g)充分均质的待测样品，置于15mL离心管中，加入4mL丙酮，涡旋振荡2min，常温超声振荡10min，5000r/min离心6min，将上清液转移至50mL离心管；往50mL离心管中加入16mL水，超声振荡0.5min，制得待净化的混合液；

b)移取上述混合液加至已用10mL 20％丙酮水溶液活化的C₁₈固相萃取柱；上样结束后，用 5mL 20％甲醇水溶液淋洗，抽干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，再用3mL乙腈洗脱，用15mL离心管收集洗脱液，旋涡振荡1min，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤，制得待测液；

c)在超高效液相色谱-串联质谱的多反应监测模式下针对待测液中的3种短裸甲藻毒素进行定性定量分析；

其中检测条件如下：

质谱检测条件如下：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式为多反应监测模式；毛细管电压为3.0kV；离子源温度为150℃；脱溶剂气温度为450℃；锥孔气流量为150L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流量：150L/h；脱溶剂气流量：600L/h；

短裸甲藻毒素的母离子及子离子等质谱多反应监测实验条件如表1所示。

表1短裸甲藻毒素的质谱参数

*定量离子(Quantitative ion)

二、测试条件的确定及优化

1.液相色谱条件优化

BTX-A、BTX-B、BTX-C三种分析物结构相似，属亲脂性化合物，常规的C₁₈色谱柱就能满足BTXs液相色谱分析的需要。对BTXs标准溶液进行色谱分离时发现，选择0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液作为水相，乙腈作为有机相，5min就能有效分离三种分析物，且峰形尖锐对称；但运用相同条件对样品进行分析时，出现目标峰无法有效积分、信噪比低等色谱现象，见图1。由图可知，样品带来的基质效应使得基线不断抬高延伸，杂峰与目标峰混为一体，无法分离。为平缓色谱基线、放大杂峰与目标峰色谱差速分离效果，采用长色谱柱，延长分析时间，运行低速且洗脱梯度相对稳定的液相条件，根据基线的平稳状况、目标峰的分离度及信噪比等信息，调试优化流动相的最佳梯度。经比较梯度调整的效果，综合分析时长，最终确定实验分析相应的色谱柱和液相条件；在此条件下，目标峰能够在11分钟内与杂峰分离，且峰型尖锐，基线平稳，见图2。

在液相色谱分析领域，为去除溶剂效应，通常采用初始流动相溶解分析物进行检测；但BTXs属脂溶性毒素，分析时需溶解在乙腈中，而不能采用初始流动相。BTXs在不同比例乙腈中对应的响应值见图3，可知0～50％乙腈对应的BTXs响应值显著增强；响应值在乙腈超过50％后缓慢增强，在比例为100％时达到最大值。

2.质谱分析条件的确定

分别在ESI源的正负两离子模式下比较BTXs的响应信号，并对锥孔温度、脱溶剂气流量等质谱参数进行优化。结果表明：BTXs在ESI⁺模式下的响应值较ESI-模式高，可产生稳定的[M+H]⁺特征离子，将其确定为分析物的准分子离子峰，并优化毛细管电压和锥孔电压。通过准分子离子峰二级质谱裂解分析，根据碎片离子的丰度强弱，筛选出定量离子和定性离子。由于BTXs是多个环状结构作为骨架构成的大环多醚类物质，导致裂解后的碎片离子较少，且定量和定性离子的稳定性和丰度还不及特征离子强。随着碰撞能量增大出现碎片离子(包括定量和定性离子)衰减甚至消失但特征离子仍存在的质谱现象，与常规化合物质谱分析有所不同。鉴于BTXs质谱表达的特殊性，将定量定性离子的筛选过程和碰撞能量的优化过程相互衔接，记录比较不同碰撞能量下各碎片离子的丰度状况，最终确定BTXs的定量定性离子和碰撞能量，见表1，二级离子质谱图见图4。

3.提取条件优化

短裸甲藻毒素属脂溶性藻类毒素，实验分别比较丙酮、甲醇、乙腈对短裸甲藻毒素的提取效率。甲醇能渗透组织，沉淀蛋白质，但对短裸甲藻毒素的提取效率较低；乙腈是极性非质子溶剂，对短裸甲藻毒素具有较高提取率，但毒性较大；丙酮对短裸甲藻毒素的提取率最高，且能与水按不同比例混溶，有利于优化固相萃取上样液的溶剂比例，结合单位样品质量的有效提取体积，故选择4mL丙酮作为提取剂。

4.固相萃取柱的选择

短裸甲藻毒素属聚醚类毒素，其结构中大量存在的碳氢键能与C₁₈官能团上的碳氢键产生非极性作用力，适合在C₁₈固相萃取柱富集净化。提取剂丙酮的非极性作用力较大，容易与固相萃取柱的官能团相结合，导致丙酮中的短裸甲藻毒素不能有效富集；因此将4mL丙酮与 16mL水混合作为上样液，以增强上样液的极性，减弱上样液的非极性作用力，提高目标物的富集效率。实验选择20％甲醇水作为淋洗液，不仅能有效祛除柱内的残留杂质，也不影响目标物的化学状态。根据洗脱液和目标物的极性，实验分别采用乙腈、甲醇作为洗脱液，通过考察洗脱液的体积、回收率、基质干扰等评估指标，选择适合短裸甲藻毒素在C₁₈固相萃取柱分离的洗脱液。实验结果表明：甲醇虽能有效洗脱短裸甲藻毒素，但其对应的色谱基线干扰较大，信噪比较低；乙腈不仅能有效洗脱目标物，且色谱基线较稳，信噪比较高，灵敏度较高。不同体积乙腈洗脱对应的短裸甲藻毒素回收率见图5，可知3mL体积的乙腈就能有效洗脱短裸甲藻毒素，实现贝类中短裸甲藻毒素的高效率富集净化。

5.方法的定量限及线性范围

移取适量BTXs混合标准使用液配制浓度为1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L系列标准工作液，以BTXs浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。按照本研究的仪器条件，得到三种六溴环十二烷的线性关系，方法线性范围以及回归方程，见表2。以3倍信噪比确定本方法的检出限(LOD)为1.0μg/kg，以10倍信噪比确定本方法的定量限(LOQ)为3.0μg/kg，如图6所示。

表2短裸甲藻毒素的线性方程和相关系数

6.方法回收率、精密度、准确度

准确称取1.00g阴性贻贝、缢蛏和青蛤样品，添加5.0、20、50μg/kg三个浓度水平的BTXs标准溶液，每个浓度的实验重复六次，计算方法回收率和精密度，结果见表3。结果表明BTXs在添加量为5.0μg/kg～50μg/kg，平均回收率为80.0％～87.5％；相对标准偏差为1.32％～5.40％。

表3短裸甲藻毒素的平均回收率及精密度(n＝6)

7.结论

本方法以丙酮为提取剂，C₁₈固相萃取净化，液相色谱串联质谱定量分析贝类中3种短裸甲藻毒素，回收率高，重复性好，定量限达到3.0μg/kg。方法稳定可靠，灵敏度高，满足目前对短裸甲藻毒素的分析检测需要，具有推广应用价值，有利于海洋生态环境监测和污染源的调查追踪。

应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于包括以下步骤：

a）提取：称取1.00g的待测样品，置于离心管A中，加入4mL有机提取剂，涡旋振荡2分钟，常温超声振荡10分钟，5000rpm转速离心6分钟，接着将上清液转移至离心管B中，往离心管B中加入16mL水，超声振荡0.5分钟，制得待净化的混合液；

b）将待净化的混合液加至已用10mL活化液活化的C₁₈固相萃取柱，上样结束后，用5mL淋洗液淋洗处理，抽干柱内残留液并弃用全部流出液，再用3mL洗脱液进行洗脱，用离心管C收集洗脱液，漩涡振荡1分钟，经有机相微孔滤膜过滤，制得待测液；

c）分析测定：在超高效液相色谱-串联质谱的多反应监测模式下针对待测液中的3种短裸甲藻毒素进行定性定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：

所述步骤c）分析测定中，

液相色谱测试条件如下：色谱柱为ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm），进样体积10 μL，样品室温度4℃，柱温40 ℃，流速0.2 mL/min，流动相A为含有0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～0.5 min，50%流动相A；0.5～1.5 min，50%～35%流动相A；1.5～9.0 min，35%流动相A；9.0～10 min，35%～50%流动相A；10～11min，50%流动相A；

质谱检测条件如下：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式为多反应监测模式；毛细管电压为3.0 kV；离子源温度为150 ℃；脱溶剂气温度为450 ℃；锥孔气流量为150 L/h；脱溶剂气流量为600 L/h。

3.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述待测样品为经粉碎充分匀质后的待测贝类样品。

4.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述有机提取剂为丙酮、甲醇或乙腈中的一种。

5.根据权利要求1或4所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述的有机提取剂为丙酮。

6.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述离心管A为15mL的离心管，所述离心管B为50mL的离心管。

7.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述的活化液为20vol%的丙酮水溶液。

8.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述的淋洗液为20vol%的甲醇水溶液。

9.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述的洗脱液为乙腈。

10.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱测定贝类中3种短裸甲藻毒素的方法，其特征在于：所述有机相微孔滤膜的孔径为0.22μm。