CN108982640A - 一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法。该评价方法通过多聚糖‑金属离子水凝胶的制备；低浓度活性氧簇制备；金属离子在解聚过程中电化学氧化还原测定；分析金属探针信号和总抗氧化性能间的关系；最后实现对实例样品的总抗氧化性能进行评价。该方法简便、廉价，能够实现对抗氧化剂总抗氧化能力的高效检测分析。

Description

一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法
技术领域
本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法。
背景技术
上世纪40年代，壳牌公司的物理化学家Denham Harman试图开始寻找人类衰老的机制。在1956年，他发表了著名的论文《Aging:a theory based on free radical andradiation chemistry》，认为生物体的衰老过程是组织细胞不断产生的活性氧簇积累所致。之后，他又进一步提出抗氧化剂可以减缓衰老的理论。生物体中自身有着一套由抗氧化的代谢产物和酶构成的复杂***，通过由抗氧化作用的代谢中间体和产物与酶之间的协同作用使得重要的细胞成分比如DNA、蛋白质和脂类免受氧化损伤。然而生物体内若是活性氧簇成分与抗氧化***之间平衡失调，则会引起氧化应激，而氧化应激被认为是引起多种疾病例如类风湿性关节炎和帕金森氏症的原因之一。因此，在各种保健措施中，服用抗氧化剂和食用富含天然抗氧化剂的蔬菜水果被认为拥有延缓衰老的功效。其中总抗氧化能力业已成为衡量食品、果汁和添加剂抗氧化能力的一项重要指标。但近些年来，很多研究也发现了截然相反的意见，过多的摄入抗氧化剂可能会带来健康的风险。例如浙江大学医学院免疫学研究所鲁林荣教授课题组从免疫学的角度出发，发现补充摄入抗氧化剂存在促进自身性免疫疾病的发生发展的风险。虽然学术界对于抗氧化剂的作用一直存在争议，但无论其对健康有益还是有害，建立一种高效检测总抗氧化能力的方法在营养学、药理学、生理学和食品加工等领域都已有了广泛的需求。
现今，对于总抗氧化能力的常规检测方法包括了氧自由基吸收能力检测、总氧化剂清楚能力检测、ROO·致β-胡萝卜素褪色法、铁离子还原能力测定和 Folin-Ciocalteu比色法等。这些以光学手段为主的检测方法一般拥有着一些难以克服的缺点，比如需要较长的检测时间、需对检测样品事先进行脱色处理以及抗干扰能力的不足。酶法检测和最新型的DNA损伤法可以有效地解决干扰物的影响，并且提供更为灵敏的型号，但酶和DNA较容易失活，价格也较为昂贵，并且不易稳定固载于电极表面。
相比之下，利用电化学方法进行总抗氧化能力检测由于其检测仪器廉价、检测信号灵敏、可实现携带检测，成为了备受期待的替代方法。其中直接电极检测法和化学修饰电极检测法容易受到复杂样品中其他成分的干扰，较适用于评估单一氧化剂的抗氧化能力。例如中国专利申请CN201210098387.X公开了一种快速检测蜂产品的抗氧化性能的电化学方法，其以没食子酸为标准品，通过待测溶液的氧化还原电流峰值的大小来确定其抗氧化物质含量。
发明内容
本发明的目的针对电化学检测总抗氧化能力实用性不足的现状，提供一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，该方法简便、廉价，能够实现对抗氧化剂总抗氧化能力的高效检测分析。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，包括如下步骤：
步骤(1)：多聚糖-金属离子水凝胶的制备：
将多聚糖均匀分散于溶剂中，然后向多聚糖分散液中添加一定浓度的金属前驱体盐溶液，搅拌，得到多聚糖-金属离子交联水凝胶；
步骤(2)：低浓度活性氧簇制备技术：
混合过氧化氢和硫酸亚铁溶液制备低浓度活性氧簇；
步骤(3)：金属离子在解聚过程中电化学氧化还原测定：
利用循环伏安扫描测定多聚糖-金属离子交联水凝胶中金属离子氧化还原电流值；
在多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液后等待一定时间，测定金属离子氧化还原电流值；
在多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液和抗氧化剂后等待相同时间，测定金属离子氧化还原电流值。
步骤(4)：分析金属探针信号和总抗氧化性能间的关系：交联水凝胶在是否加入抗氧剂情况下均会解聚，比较有无抗氧剂存在情况下金属离子电化学氧化还原信号的差异，实现对抗氧化剂的总抗氧化能力的评价。
步骤(5)：对实例样品的总抗氧化性能进行检测：将步骤(4)中的抗氧化剂改为实例样品，所述实例样品包括血清、血浆、尿液或植物提取液，通过金属离子探针电化学相应的区别评价实例样品的总抗氧化能力。
优选的，所述步骤(1)中的多聚糖选自壳聚糖、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、角叉菜胶中的一种或多种。
优选的，所述溶剂为0.1-1M醋酸或盐酸溶液。
优选的，所述金属前驱体盐为银、铜、镍、锌、镉、铁、钴或钯的醋酸盐或氯化物，所配置的溶液浓度为0.001-0.5M。
优选的，所述多聚糖分散液和金属前驱体盐溶液的体积比为100:1-10:1。
优选的，所述步骤(2)中低浓度活性氧簇的过氧化氢质量浓度为1％-10％，二价铁离子浓度为0.001-0.01M。
优选的，所述步骤(3)中循环伏安扫描的区间为-1.5-1.5V；扫描速度为 20～100mV/s。
优选的，所述步骤(4)中的评价方式具体为：采取百分比制，取多聚糖-金属离子交联水凝胶中金属离子氧化或还原峰的电流值为背景电流，多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液后所测得的金属离子氧化或还原峰的电流值减去背景电流值后为上限值，计算多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液和抗氧化剂后所测得的金属离子氧化或还原峰的电流值为实验组数据。
优选的，所述步骤(5)中实例样品为新鲜样品，或是在-20℃环境下保存的一个月样品，或是-80℃环境下保存的三个月样品。
本发明的方法以多聚糖-金属离子交联水凝胶作为检测平台，基于活性氧簇引起的水凝胶解聚反应和抗氧化剂对活性氧簇的清除作用，利用水凝胶中金属离子的电化学信号变化，实现对抗氧化剂总抗氧化性能的高效检测分析。该项目旨在为营养学、药理学、生理学、食品加工等领域对总抗氧化性能评价日益增加的需求，提供一种操作性强、无需电极表面修饰且成本低廉的分析手段。
本发明具有的有益效果是：
1.本发明提出的整个分析过程无需生物试剂，大大降低电化学总抗氧化性能评价方式的成本。
2.利用金属离子作为探针来评价总抗氧化性能，避免了直接电化学检测抗氧化剂时容易受到的干扰物影响。
3.本发明提出的总抗氧化性能评价方法可有潜力制作成微型试剂盒产品，具有实地检测的潜力。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例1.芦丁和木犀草素混合溶液的总抗氧化能力检测
(1)将低分子量壳聚糖分散于0.5M醋酸溶液中，配置成10mL，向壳聚糖分散液中加入0.1mL的0.05M醋酸锌。混合液用磁力搅拌机进行5min快速搅拌，形成壳聚糖-金属锌离子交联水凝胶。
(2)在2％的过氧化氢中加入13.9μg硫酸亚铁溶液，制备低浓度活性氧簇。
(3)测定壳聚糖-锌离子交联水凝胶中锌离子还原电流值作为评价抗氧化性能的背景电流。在壳聚糖-锌离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液后等待 10min，测定锌属离子还原电流值减去背景电流后作为上限值。在壳聚糖-锌离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液和0.1mL的0.01M芦丁和木犀草素混合溶液，等待10min，测定锌离子还原电流值。循环伏安的扫描的区间为 -0.8～-0.8V；扫描速度为50mV/s。
(4)将加入芦丁和木犀草素后锌离子还原电流值减去背景电流后较之上限值减少了78.4％，该数值用于评价0.01M芦丁和木犀草素混合溶液的总抗氧化能力。
实施例2.抗坏血酸和尿酸的总抗氧化能力检测
步骤(1)、(2)同实施例1.
(3)为测定壳聚糖-锌离子交联水凝胶中锌离子还原电流值作为评价抗氧化性能的背景电流。在壳聚糖-锌离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液后等待10min，测定锌属离子还原电流值减去背景电流后作为上限值。在壳聚糖-锌离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液和0.1mL的0.01M抗坏血酸和 0.005M尿酸混合溶液，等待10min，测定锌离子还原电流值。循环伏安的扫描的区间为-0.8～-0.8V；扫描速度为50mV/s。
(4)将加入抗坏血酸和尿酸溶液后锌离子还原电流值减去背景电流后较之上限值减少了66.7％，该数值用于评价0.01M抗坏血酸和0.005M尿酸溶液的总抗氧化能力。
实施例3.石蒜属忽地笑球茎提取液的总抗氧化能力检测
(1)忽地笑球茎组织1g碾碎后加入10mL甲醇溶液，进行30min超声萃取，滤纸过滤，溶剂浓缩后得到1mL提取液。
(2)将低分子量海藻酸钠分散于0.5M盐酸溶液中，配置成10mL，向海藻酸钠分散液中加入0.1mL的0.01M硝酸银。混合液用磁力搅拌机进行5min快速搅拌，形成海藻酸钠-金属银离子交联水凝胶。
(3)在1％的过氧化氢中加入13.9μg硫酸亚铁溶液，制备低浓度活性氧簇。
(4)测定海藻酸钠-银离子交联水凝胶中银离子还原电流值作为评价抗氧化性能的背景电流。在海藻酸钠-银离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液后等待30min，测定银属离子还原电流值减去背景电流后作为上限值。在海藻酸钠-银离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液和0.1mL忽地笑提取液，等待30min，测定锌离子还原电流值。循环伏安的扫描的区间为-0.5～-0.5V；扫描速度为100mV/s。
(5)加入忽地笑提取液后银离子还原电流值减去背景电流后较之上限值减少了32.3％，该数值用于评价忽地笑提取液的总抗氧化能力。
实施例4.石蒜属换锦花叶片提取液的总抗氧化能力检测
(1)换锦花叶片组织1g碾碎后加入10mL甲醇溶液，进行30min超声萃取，滤纸过滤，溶剂浓缩后得到1mL提取液。
步骤(2)、(3)同实施例3.
(4)测定海藻酸钠-银离子交联水凝胶中银离子还原电流值作为评价抗氧化性能的背景电流。在海藻酸钠-银离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液后等待30min，测定银属离子还原电流值减去背景电流后作为上限值。在海藻酸钠-银离子交联水凝胶中加入0.1mL活性氧簇溶液和0.1mL换锦花提取液，等待30min，测定锌离子还原电流值。循环伏安的扫描的区间为-0.5～-0.5V；扫描速度为100mV/s。
(5)加入换锦花提取液后银离子还原电流值减去背景电流后较之上限值减少了11.4％，该数值用于评价换锦花提取液的总抗氧化能力。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：多聚糖-金属离子水凝胶的制备：
将多聚糖均匀分散于溶剂中，然后向多聚糖分散液中添加一定浓度的金属前驱体盐溶液，搅拌，得到多聚糖-金属离子交联水凝胶；
步骤(2)：低浓度活性氧簇制备技术：
混合过氧化氢和硫酸亚铁溶液制备低浓度活性氧簇；
步骤(3)：金属离子在解聚过程中电化学氧化还原测定：
利用循环伏安扫描测定多聚糖-金属离子交联水凝胶中金属离子氧化还原电流值；
在多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液后等待一定时间，测定金属离子氧化还原电流值；
在多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液和抗氧化剂后等待相同时间，测定金属离子氧化还原电流值。
步骤(4)：分析金属探针信号和总抗氧化性能间的关系：交联水凝胶在是否加入抗氧剂情况下均会解聚，比较有无抗氧剂存在情况下金属离子电化学氧化还原信号的差异，实现对抗氧化剂的总抗氧化能力的评价。
步骤(5)：对实例样品的总抗氧化性能进行检测：将步骤(4)中的抗氧化剂改为实例样品，所述实例样品包括血清、血浆、尿液或植物提取液，通过金属离子探针电化学相应的区别评价实例样品的总抗氧化能力。
2.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述步骤(1)中的多聚糖选自壳聚糖、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、角叉菜胶中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述溶剂为0.1-1M醋酸或盐酸溶液。
4.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述金属前驱体盐为银、铜、镍、锌、镉、铁、钴或钯的醋酸盐或氯化物，所配置的溶液浓度为0.001-0.5M。
5.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述多聚糖分散液和金属前驱体盐溶液的体积比为100:1-10:1。
6.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中低浓度活性氧簇的过氧化氢质量浓度为1％-10％，二价铁离子浓度为0.001-0.01M。
7.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述步骤(3)中循环伏安扫描的区间为-1.5-1.5V；扫描速度为20～100mV/s。
8.根据权利要求1所述的一种基于交联水凝胶的总抗氧化能力的评价方法，其特征在于，所述步骤(4)中的评价方式具体为：采取百分比制，取多聚糖-金属离子交联水凝胶中金属离子氧化或还原峰的电流值为背景电流，多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液后所测得的金属离子氧化或还原峰的电流值减去背景电流值后为上限值，计算多聚糖-金属离子交联水凝胶中加入活性氧簇溶液和抗氧化剂后所测得的金属离子氧化或还原峰的电流值为实验组数据。
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