CN108977427B - 一种海藻糖合酶突变体 - Google Patents

一种海藻糖合酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海藻糖合酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过对来源于Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶进行改造，削弱了该酶以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物时，葡萄糖对海藻糖合酶催化合成海藻糖的活性的抑制作用，以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物，野生酶生产海藻糖转化率为62.2％，而突变体G52H、G52H/H134N生产海藻糖的转化率分别达到74.8％、82.3％。本发明的突变体实现了底物中即使含有一定的葡萄糖，海藻糖合酶制备海藻糖的转化效率依然不会受到很大的影响，具有较高的工业价值。

Description

一种海藻糖合酶突变体
技术领域
本发明涉及一种海藻糖合酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
海藻糖是一种安全无毒以1,1-糖苷键构成的非还原性二糖，有三种异构体即(α,α)、异海藻糖(β,β)、新海藻糖(α,β)，一般以二水化合物的形式存在。与蛋白质或者氨基酸共同加热，不会产生美拉德反应，并且在酸性、碱性、高温、超低温环境都能保持一定的稳定性。其独特的生物活性，使得海藻糖得到广泛的应用。大量的研究表明，海藻糖是单细胞生物、动物组织和器官、蛋白质、生物膜、医药制剂等的保护剂，能够抑制脂质酸化、淀粉老化、蛋白质变性，具有矫味矫臭功能、搞玻璃转化温度、低吸湿性、低甜度等性质，能够将其应用到医药业、农业、生化制品业、化妆品行业、食品加工业。
早期商业化的海藻糖是从酵母中提取的。1990年价格约700美元/kg，提取率过低，成本过高。1995年日本利用双酶法实现工业化生产，使得海藻糖价格由原来的2万日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg。中国2002年首次以双酶法实现海藻糖的产业化，价格79元/kg。双酶法以淀粉为原料，在麦芽寡糖基海藻糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生产工艺复杂，难以推广，目前全世界只有几个公司能生产。而海藻糖合酶以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，是相对经济的生产方法，但仍有很多问题需要研究解决，其中海藻糖合酶是关键。因此，挖掘适合生产海藻糖的海藻糖合酶对于推动海藻糖的大规模工业化、降低产业成本具有重大的意义。
麦芽糖可以通过水解淀粉得到，生产过程中会产生一定的葡萄糖，工业化生产海藻糖使用纯的麦芽糖成本过高。海藻糖合酶除了转苷作用外还有微弱的水解反应，由此生成副产物葡萄糖。葡萄糖会在一定程度上抑制来源于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶的活性。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种海藻糖合酶的突变体，是以Thermobifida fusca YX海藻糖合酶为基础，将第52位的甘氨酸突变成组氨酸(G52H)；或将第52位的甘氨酸突变成组氨酸，同时将第134位的色氨酸突变成天冬酰胺(G52H/H134N)；所述Thermobifida fusca YX海藻糖合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种受葡萄糖抑制影响减弱的海藻糖合酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在Thermobifida fusca YX海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化获得海藻糖合酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
本发明通过对来源于Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶进行改造，削弱了该酶以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物时，葡萄糖对海藻糖合酶催化合成海藻糖的活性的抑制作用，以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物，野生酶生产海藻糖转化率为62.2％，而突变体G52H、G52H/H134N生产海藻糖的转化率分别达到74.8％、82.3％。
具体实施方式
实施例1：重组菌构建
选择带有T7启动子的质粒pET24a(+)为表达载体，将pET24a(+)质粒和含有TreS基因的质粒TreS/pMD 18T分别进行NdeⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养培养8h，挑转化子在含有30mg/L卡那霉素液体的LB培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒TreS/pET24a(+)。
将质粒TreS/pET24a(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素(30mg/L)的LB平板，37℃培养8h，命名为TreS/pET24a(+)/E.coli BL21(DE3)。挑单菌落到含有30mg/L卡那霉素液体LB培养基中，37℃培养过夜，保存甘油管。
实施例2：突变体的制备
(1)单突变G52H
根据Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶的基因序列，分别设计并合成引入G52H突变的引物，利用快速PCR技术，以表达载体TreS/pET24a(+)为模板，
引入G52H突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-TAC GAT AGC AAT GGC GAT CACACCGGCGATT-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-A ATC GCC GGT GTG ATC GCC ATT GCT ATC GTA-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含30μg/mL卡那霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒G52H/pET24a(+)转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过测序验证突变质粒携带编码突变体的基因。
发酵产酶
(2)双突变
双突变体酶G52H/H134N的制备方法，以单突变体G52H编码基因为模板，设计并合成引入H134N突变的引物，对单突变体G52H编码基因进行定点突变，测定序列，鉴别出第134位的His变成Asn密码子，将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到双突变海藻糖合酶突变体。
利用快速PCR技术，以表达载体G52H/pET24a(+)为模板，制备G52H/H134N/pET24a(+)
引入H134N突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-AGC GAT CAA AAC CCC TGG TTG CAA GCA AGC A-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-T GCT TGC TTG CAA CCA GGG GTT TTG ATC GCT-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系、反应条件及突变基因的测序方法同单突变体的方法。
(3)突变体酶的发酵与纯化
分别挑取携带野生酶的大肠杆菌TreS/pET24a(+)/E.coli BL21(DE3)、携带单突变体、双突变体基因的G52H/pET24a(+)/E.coli BL21(DE3)、G52H/H134N/pET24a(+)/E.coli BL21(DE3)于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，在37℃摇床中培养48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液即为粗酶液。
实施例3：HPLC检测海藻糖的产量
在反应器中加入麦芽糖300g/L(含葡萄糖10％)，加入一定量实施例2中获得的野生酶和突变体的粗酶液，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到8.0，在30℃、150rpm的水浴摇床中反应30-50小时定时取样，煮沸10min终止反应后将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：示差折光检测器，NH2柱(APS-2HYPERSIL，Thermo Scientific)，流动相(水:乙腈＝1:4)，流速：0.8mL·min-1，柱温：40℃。
根据海藻糖的产量，计算麦芽糖转化率(海藻糖与麦芽糖的质量比)，结果如表1所示，以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物，野生酶生产海藻糖转化率为62.2％，而突变体G52H、G52H/H134N生产海藻糖的转化率提高到74.8％、82.3％。
表1以工业级麦芽糖为底物生产海藻糖的转化率
酶 转化率(％)
野生酶 62.2％
G52H 74.8％
G52H/H134N 82.3％
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南汇升生物科技有限公司
<120> 一种海藻糖合酶突变体
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 606
<212> PRT
<213> Thermobifida fusca
<400> 1
Met Thr Thr Gln Pro Ala Pro Gly Ala Arg Pro Thr Pro Thr Gly Ser
1 5 10 15
Val Pro Asp Thr Phe Thr His Ala Lys Pro Arg Asp Pro Tyr Trp Tyr
20 25 30
Lys His Ala Val Phe Tyr Glu Val Leu Val Arg Gly Phe Tyr Asp Ser
35 40 45
Asn Gly Asp Gly Thr Gly Asp Leu Arg Gly Leu Ile Glu Lys Leu Asp
50 55 60
Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Ile Asp Cys Leu Trp Leu Leu Pro Ile Tyr
65 70 75 80
Glu Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Met Lys
85 90 95
Ile Leu Pro Glu Phe Gly Arg Ile Ser Asp Phe Val Glu Leu Val Glu
100 105 110
Lys Ala His Gln Arg Gly Ile Arg Val Ile Thr Asp Leu Val Met Asn
115 120 125
His Thr Ser Asp Gln His Pro Trp Phe Gln Ala Ser Arg His Asp Pro
130 135 140
Asp Gly Pro Tyr Gly Asn Phe Tyr Val Trp Ser Asp Thr Thr Glu Arg
145 150 155 160
Tyr Ser Asp Ala Arg Ile Ile Phe Ile Asp Thr Glu Gln Ser Asn Trp
165 170 175
Thr Tyr Asp Glu Val Arg Gly Gln Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ser
180 185 190
His Gln Pro Asp Leu Asn Phe Glu Asn Pro Asp Val Gln Asp Ala Ile
195 200 205
Leu Glu Val Met Arg Phe Trp Leu Asp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg
210 215 220
Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr Glu Arg Glu Gly Thr Asn Cys Glu
225 230 235 240
Asn Leu Lys Glu Thr His Glu Phe Leu Lys Arg Ile Arg Ala Glu Val
245 250 255
Asp Arg Leu Tyr Pro Asp Arg Val Leu Leu Ser Glu Ala Asn Gln Trp
260 265 270
Pro Ala Asp Val Val Asp Tyr Phe Gly Asp Tyr Glu Ser Gly Gly Asp
275 280 285
Glu Cys His Met Asn Phe His Phe Pro Leu Met Pro Arg Met Phe Met
290 295 300
Ala Val Arg Arg Glu Gln Arg Tyr Pro Ile Ser Glu Ile Leu Ala Gln
305 310 315 320
Thr Pro Pro Ile Pro Arg Asn Cys Gln Trp Ala Ile Phe Leu Arg Asn
325 330 335
His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu Glu Arg Asp Tyr
340 345 350
Met Tyr Ser Glu Tyr Ala Lys Asp Pro Arg Met Arg Ala Asn Met Gly
355 360 365
Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Glu Asn Asp Leu Asn Gln Ile
370 375 380
Lys Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gly Ser Pro Val Leu
385 390 395 400
Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp
405 410 415
Arg Asp Ser Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala
420 425 430
Gly Phe Ser Arg Cys Asp Pro Gly Arg Leu Tyr Leu Pro Val Ile Met
435 440 445
Asp Pro Ile Tyr Gly Tyr Gln Ala Ile Asn Val Glu Ala Gln Gln Asn
450 455 460
Asn Pro Asn Ser Leu Leu Asn Trp Thr Arg Asn Met Ile Gln Ile Arg
465 470 475 480
Lys Gln His Pro Val Phe Gly Thr Gly Asp Phe Thr Glu Leu His Ala
485 490 495
Ser Asn Pro Ser Val Phe Ala Phe Val Arg Glu Tyr Gly Asp Asp Arg
500 505 510
Met Leu Cys Val Asn Asn Leu Ser Arg Phe Pro Gln Pro Val Glu Leu
515 520 525
Asp Leu Arg Arg Phe Glu Gly Ile Thr Pro Ile Glu Cys Thr Gly Gly
530 535 540
Val His Phe Pro Pro Ile Gly Glu Leu Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Gln Leu Pro Pro Val Ala Glu Glu Gln
565 570 575
Pro Leu Ala Gln Pro Val Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Gln Pro Pro
580 585 590
Ala Pro Ala Asp Arg Pro Ala Ser Asp Pro Thr Gln Arg Ser
595 600 605
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacgatagca atggcgatca caccggcgat t 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatcgccggt gtgatcgcca ttgctatcgt a 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcgatcaaa acccctggtt gcaagcaagc a 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgcttgcttg caaccagggg ttttgatcgc t 31

Claims (8)

1.一种海藻糖合酶突变体，其特征在于，相对于海藻糖合酶亲本，将第52位的甘氨酸突变成组氨酸；或将第52位的甘氨酸突变成组氨酸，同时将第134位的组氨酸突变成天冬酰胺；所述海藻糖合酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在亲本海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体；
(2)将携带编码突变体的基因的质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化得到海藻糖合酶突变体；
所述宿主细胞为细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
4.权利要求1所述突变体在制备海藻糖中的应用。
5.编码权利要求1所述突变体的基因。
6.携带权利要求5所述基因的细胞，其特征在于，所述细胞为细菌。
7.权利要求6所述细胞在制备海藻糖中的应用。
8.携带权利要求5所示基因的质粒。
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水生栖热菌 FL-03 海藻糖合酶基因的克隆及真核表达;刘俊梅 等;《食品科学》;20101231;第31卷(第23期);第267-270页

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Patentee after: Hunan Jindai Technology Development Co.,Ltd.

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Patentee before: HUNAN HUISHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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Denomination of invention: A trehalose synthase mutant

Effective date of registration: 20231215

Granted publication date: 20190903

Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Leiyang branch

Pledgor: Hunan Jindai Technology Development Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980071878