CN108956802B - 一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中多种成分的检测方法 - Google Patents

一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中多种成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，属于烟草及烟草制品中化学成分检测技术领域。本发明的处理方法，包括：1)称取待测样品加入碱性溶液进行提取，加入有机溶剂混匀，分层，得有机相；2)取有机相在硅胶固相萃取柱上上样，采用二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种进行淋洗；3)采用乙酸乙酯、丙醇中的至少一种洗脱硅胶固相萃取柱。本发明的处理方法，可实现对烟草及烟草样品中烟碱及次级生物碱、挥发性亚硝胺、种烟草特有亚硝胺、香豆素、多环芳烃这5类成分检测前的处理，节约了试剂、时间和人力成本，具有快速、经济、通量高、提取效率高、净化效果好、精密度高的优点，适合大批量样品的测定。

Description

一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中多种成 分的检测方法
技术领域
本发明涉及一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，属于烟草及烟草制品中化学成分检测技术领域。
背景技术
烟草及烟草制品样品基质极为复杂，含有多类化学成分，如烟碱及次级生物碱、香豆素类、多环芳烃、挥发性亚硝胺、烟草特有亚硝胺等。由于这些成分含量从ng到mg量级，而结构、极性上也具有一定差异性，因此目前现有的标准测定方法及文献报道的定量方法基本上仅针对其中一类成分。例如烟草及烟草制品中烟碱及次级生物碱的标准检测方法[1]需要称取0.3g试样，加入2.0mL 5％的氢氧化钠溶液湿润试样，静置15min，然后加入20.0mL含内标的氯仿萃取溶液进行振荡萃取，萃取液除水后采用GC/MS检测。烟草及烟草制品中烟草特有亚硝胺方法为GC-TEA方法[2]和LC-MS/MS[3]等。其中现行烟草行业标准GC-TEA法[2]需要称量1g样品，加入1mL10％氢氧化钠溶液，加20mL二氯甲烷超声20min，再采用碱性氧化铝层析柱进行净化，该方法仅可测定4种烟草特有亚硝胺，然而采用碱性氧化铝层析柱进行净化的操作相当繁琐，且使用了大量有机溶剂，如萃取需采用20mL二氯甲烷，层析柱的准备过程需要使用80mL二氯甲烷，层析过程需要使用45mL二氯甲烷、100mL甲醇：二氯甲烷(8:92)洗脱。关于烟草及烟草制品中多环芳烃、挥发性亚硝胺的检测，目前国内无烟草行业标准方法，但在国际上采用CORESTA(国际烟草合作研究中心)推荐方法对苯并[a]芘这一个多环芳烃指标进行检测，该方法需要采用甲醇作为萃取溶剂，同样需要引入固相萃取过程及浓缩过程。同样，文献报道的关于挥发性亚硝胺、香豆素等类型化合物的分析基本也都需要独立的萃取、净化、浓缩等前处理步骤。
样品测试的过程中，近70％的时间是用在样品前处理过程。要对烟草及烟草制品中烟碱及次级生物碱、香豆素类、多环芳烃、挥发性亚硝胺、烟草特有亚硝胺这五类化合物进行检测，按照现行方法，至少需要5个不同的检测方法，因此样品需要5次称量，5次萃取，以及需采用不同的净化过程。因此不仅有机使用量较大，而且耗时、耗力且成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种省时省力且成本低的烟草及烟草制品的处理方法，可实现烟草及烟草制品中多种成分的检测。
本发明还提供了一种烟草及烟草制品中多种成分的检测方法。
为了实现以上目的，本发明的烟草及烟草制品的处理方法所采用的技术方案是：
一种烟草及烟草制品的处理方法，包括以下步骤：
1)称取待测样品加入碱性溶液进行提取，然后加入有机溶剂A混匀，分层，得到有机相；
2)取有机相在硅胶固相萃取柱上上样，然后用有机溶剂B进行淋洗；所述有机溶剂B为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种；
3)采用有机溶剂C洗脱硅胶固相萃取柱；所述有机溶剂C为乙酸乙酯、1-丙醇、异丙醇中的至少一种。
本发明的烟草及烟草制品的处理方法，适用于烟丝、烟叶、无烟气烟草制品；所述无烟气烟草制品可以为袋装***烟、散装***烟、嚼烟、含化型烟草制品或胶基型烟草制品。所得有机相可直接用于烟碱及次级生物碱的检测；所得的淋洗过程的流出液可直接用于挥发性亚硝胺和多环芳烃的检测；所得的洗脱液可用于烟草特有亚硝胺和香豆素类的检测。本发明的处理方法通过对烟草及烟草制品一次处理可实现对烟草及烟草样品中烟碱及次级生物碱、挥发性亚硝胺、种烟草特有亚硝胺、香豆素、多环芳烃这5类成分的检测，节约了样品用量、有机溶剂用量、固相萃取柱等耗材用量，而且大大节约了时间成本和人力成本，具有快速、经济、通量高、提取效率高、净化效果好、精密度高的优点，适合大批量样品的测定。所述次级生物碱包括降烟碱、新烟碱、假木贼碱、麦斯明、可替宁中的至少一种。
所述挥发性亚硝胺包括N-亚硝基二甲基胺(N-Nitrosodimethylamine，简写为NDMA)、N-亚硝基吡咯烷(N-Nitrosopyrrolidine，简写为NPYR)、N-亚硝基哌啶(N-Nitrosopiperidine，简写为NPIP)、N-亚硝基吗啉(N-Nitrosomorpholine，简写为NMOR)、N-亚硝基二乙胺(N-Nitrosodiethylamine，简写为NDEA)中的至少一种。
所述烟草特有亚硝胺包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基吡啶基丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)中的至少一种。
所述多环芳烃包括萘、萘并乙烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、
Figure BDA0001672114290000021
苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g,h,i]芘的至少一种。
优选的，所述碱性溶液中OH-离子的浓度为0.2～1.5mol/L。碱性溶液的溶剂为水。
优选的，称取待测样品加入碱性溶液进行提取时，每0.2～1g所述待测样品对应采用的碱性溶液的体积为3～10mL。进一步优选的，每1g所述待测样品对应采用的碱性溶液的体积为2～10mL。
优选的，步骤1)中，每0.5～1g待测样品对应加入的有机溶剂A的体积为5～20mL。
所述碱性溶液为可溶性碱的水溶液或碱性的盐析剂溶液。
碱性的盐析剂溶液是将可溶性碱和盐析剂溶于水制成。
优选的，可溶性碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
所述盐析剂溶液中的盐析剂为氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。
所述混匀为振荡。所述振荡的时间为15～60min。可选的，所述振荡为机械振荡。优选的，所述机械振荡为涡旋振荡。
所述有机溶剂A为与水不互溶的有机溶剂。优选的，所述有机溶剂A为二氯甲烷、苯、甲苯、环己烷中的至少一种。
优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括加入有机相混匀后进行离心。加入有机相混匀后进行离心，能够促进水相和有机相分层，并减少分散在有机相中的提取残渣。
为便于表示上样体积、淋洗过程采用的有机溶剂B的体积、洗脱过程采用的有机溶剂C的体积，将硅胶固相萃取柱的柱床体积记为1BV。
优选的，步骤2)中，上样体积为1.5～3.5BV。上样流速为0.3～0.7BV/min。
优选的，步骤2)中，淋洗时所采用的有机溶剂B的体积为1～3.5BV。淋洗时，有机溶剂B的流速为0.3～1BV/min。
优选的，步骤3)中，洗脱时所采用的有机溶剂C的体积为1.5～3.5BV。洗脱时，有机溶剂C的流速为0.3～0.7BV/min。
上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括收集有机溶剂B淋洗过程的流出液。
优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括：取有机相在硅胶固相萃取柱上上样前，将硅胶固相萃取柱采用所述有机溶剂D进行平衡。进一步优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括：在收集淋洗过程的流出液前，收集上样过程的流出液，并将上样过程的流出液与收集的淋洗过程的流出液合并。
优选的，所述有机溶剂D为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种。
优选的，将硅胶固相萃取柱进行平衡时，所采用的有机溶剂D的体积为1～2BV。
优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括将淋洗过程的流出液进行浓缩或将上样过程的流出液与收集的淋洗过程的流出液合并液体进行浓缩。
优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括收集采用有机溶剂C洗脱硅胶固相萃取柱的洗脱液。进一步优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括将所得洗脱液进行浓缩。
优选的，上述的烟草及烟草制品的处理方法，还包括在取有机相在硅胶固相萃取柱上上样前，对步骤1)所得有机相进行除水。对步骤1)所得有机相除水，是在有机相中加入无水硫酸镁和/或无水硫酸钠除水。
待测样品根据烟草及烟草制品种类的不同，获得的方式也不同。对于烟草、烟丝和含化型烟草制品等烟草及烟草制品，待测样品的制备方法包括：将烟叶、烟丝或含化型烟草制品磨碎成粉料A，即得。优选的，所述粉料A的平均粒径不大于40目。
优选的，所述待测样品为粉料A时，每0.5～1g所述待测样品对应采用的碱性溶液的体积为3～10mL。
对于袋装型无烟气烟草制品，如袋装型***烟，待测样品的制备方法包括：将袋装型无烟气烟草制品直接称量整袋样品质量，从中间撕开袋子后，得到待测样品。
对于散装***烟、嚼烟等非粉末状无烟气烟草制品以及胶基型无烟气烟草制品，待测样品的制备方法包括：在无烟气烟草制品中加入液氮进行磨碎成粉料B，制得待测样品。优选的，所述粉料B的平均粒径不大于40目。
本发明的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法所采用的技术方案为：
一种烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，包括以下步骤：
i)称取待测样品加入碱性溶液、内标溶液进行提取，然后加入有机溶剂A混匀，分层，得到有机相；所述内标溶液中的内标物包括挥发性亚硝胺内标物、多环芳烃内标物中的至少一种；所述内标物还包括烟草特有亚硝胺内标物、香豆素内标物中的至少一种；
ii)取有机相在硅胶固相萃取柱上上样，然后用有机溶剂B进行淋洗，收集淋洗过程的流出液；所述有机溶剂B为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种；
采用有机溶剂C洗脱硅胶固相萃取柱，收集洗脱液；所述有机溶剂C为乙酸乙酯、1-丙醇、异丙醇中的至少一种；
取所得的淋洗过程的流出液对挥发性亚硝胺和/或多环芳烃进行检测；
取所得的洗脱液对烟草特有亚硝胺和/或香豆素进行检测。
本法发明的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，实现了烟草及烟草制品中挥发性亚硝胺、多环芳烃中至少一种以及烟草特有亚硝胺、香豆素中至少一种的检测方法的合并，节约了样品用量、有机溶剂用量、固相萃取柱等耗材用量，而且大大节约了时间成本和人力成本，具有快速、经济、通量高、提取效率高、净化效果好、精密度高的优点，适合大批量样品的测定。
优选的，每0.2～1g待测样品对应加入的内标溶液的体积为100μL。
优选的，烟草特有亚硝胺的内标物包括NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4中的至少一种。
优选的，香豆素的内标物包括香豆素-d4。
优选的，所述挥发性亚硝胺内标物包括NDMA-d6、NPYR-d8、NPIP-d10、NMOR-d8、NDEA-d10中的至少一种。
优选的，多环芳烃内标物包括萘-d8、苊-d10、蒽-d10、芘-d10、苯并[a]蒽-d12、苯并[a]芘-d12、二苯并[a，h]蒽-d14中的至少一种。
优选的，上述烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，还包括取步骤1)所得的有机相对烟碱和/或次级生物碱进行检测；所述内标溶液的内标物还包括烟碱内标物和/或次级生物碱内标物。
优选的，烟碱内标物为2-甲基喹啉。
优选的，次级生物碱内标物包括6-异丙基喹啉、6-叔丁基喹啉、降烟碱-d4中的至少一种。
对烟碱和/或次级生物碱的检测可以采用GC-MS、GC-MS/MS等仪器进行。
对挥发性亚硝胺和多环芳烃的检测可以采用GC-MS/MS、GC-TEA等仪器进行。
对烟草特有亚硝胺的检测可以采用GC-MS/MS、GC-TEA等仪器进行；对香豆素的检测可以采用GC-MS、GC-MS/MS等仪器进行。
所述次级生物碱包括降烟碱、新烟碱、假木贼碱、麦斯明、可替宁中的至少一种。
所述挥发性亚硝胺包括N-亚硝基二甲基胺(N-Nitrosodimethylamine，简写为NDMA)、N-亚硝基吡咯烷(N-Nitrosopyrrolidine，简写为NPYR)、N-亚硝基哌啶(N-Nitrosopiperidine，简写为NPIP)、N-亚硝基吗啉(N-Nitrosomorpholine，简写为NMOR)、N-亚硝基二乙胺(N-Nitrosodiethylamine，简写为NDEA)中的至少一种。
所述烟草特有亚硝胺包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基吡啶基丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)中的至少一种。
所述多环芳烃包括萘、萘并乙烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、
Figure BDA0001672114290000051
苯并 [b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g,h,i]芘的至少一种。
优选的，所述碱性溶液的OH-的浓度为0.2～1.5mol/L。碱性溶液的溶剂为水。
称取待测样品加入碱性溶液进行提取时，每0.2～1g所述待测样品对应采用的碱性溶液的体积为3～10mL。
所述碱性溶液为可溶性碱的水溶液或碱性的盐析剂溶液。
优选的，步骤i)中，每1g待测样品对应加入的有机溶剂A的体积为5～20mL。
碱性的盐析剂溶液是将可溶性碱和盐析剂溶于水制成。
优选的，可溶性碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
所述盐析剂溶液中的盐析剂为氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种。
所述混匀为振荡。所述振荡的时间为15～60min。可选的，所述振荡为机械振荡。优选的，所述机械振荡为涡旋振荡。
所述有机溶剂A为与水不互溶的有机溶剂。优选的，所述有机溶剂A为二氯甲烷、苯、甲苯、环己烷中的至少一种。
优选的，上述烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，还包括加入有机相混匀后进行离心。加入有机相混匀后进行离心，能够促进水相和有机相分层，并减少分散在有机相中的提取残渣。
优选的，上述烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，还包括：取有机相在硅胶固相萃取柱上上样前，将硅胶固相萃取柱采用有机溶剂D进行平衡。
优选的，将步骤ii)替换为：将硅胶固相萃取柱采用有机溶剂D进行平衡，取有机相在硅胶固相萃取柱上上样，然后用有机溶剂B进行淋洗，收集并合并上样及淋洗过程的流出液，得到合并液；所述有机溶解B为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种；采用有机溶剂C洗脱硅胶固相萃取柱，收集洗脱液；所述有机溶剂C为乙酸乙酯、1-丙醇、异丙醇中的至少一种；取所得的合并液对挥发性亚硝胺和多环芳烃进行检测；取所得的洗脱液对烟草特有亚硝胺和/或香豆素进行检测。
优选的，步骤ii)中，上样体积为1.5～3.5BV。上样流速为0.3～0.7BV/min。
优选的，步骤ii)中，淋洗时所采用的有机溶剂B的体积为1～3.5BV。淋洗时，有机溶剂B的流速为0.3～1BV/min。
优选的，步骤ii)中，洗脱时所采用的有机溶剂C的体积为1.5～3.5BV。洗脱时，有机溶剂C的流速为0.3～0.7BV/min。
优选的，将硅胶固相萃取柱进行平衡时，所采用的有机溶剂D的体积为1～2BV。优选的，有机溶剂D与所述有机溶剂A相同。所述有机溶剂D为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种。
优选的，上述烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，还包括将淋洗过程的流出液进行浓缩或将上样过程的流出液与收集的淋洗过程的流出液合并后所得合并液进行浓缩。
优选的，上述烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，还包括将所得洗脱液进行浓缩。
优选的，上述的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，还包括在取有机相在硅胶固相萃取柱上上样前，对步骤i)所得有机相进行除水。对步骤i)所得有机相除水，是在有机相中加入无水硫酸镁和/或无水硫酸钠除水。
待测样品根据烟草及烟草制品种类的不同，获得的方式也不同。对于烟草、烟丝和含化型烟草制品等烟草及烟草制品，待测样品的制备方法包括：将烟叶、烟丝或含化型烟草制品磨碎成粉料A，即得。优选的，所述粉料A的平均粒径不大于40目。
优选的，所述待测样品为粉料A时，每0.5～1g所述待测样品对应采用的碱性溶液的体积为5～20mL。
对于袋装型无烟气烟草制品，如袋装型***烟，待测样品的制备方法包括：将袋装型无烟气烟草制品直接称量整袋样品质量，从中间撕开袋子后，得到待测样品。
对于散装型***烟、嚼烟等非粉末状无烟气烟草制品以及胶基型无烟气烟草制品，待测样品的制备方法包括：在无烟气烟草制品中加入液氮进行磨碎成粉料B，制得待测样品。优选的，所述粉料B的平均粒径不大于40目。
本发明的中有机溶剂A、有机溶剂B、有机溶剂C、有机溶剂D均只用于对各步骤中所采用的有机溶剂进行标记，不对各步骤中有机溶剂的具体成分构成限制。
附图说明
图1为实施例1中烟草及烟草制品的处理方法的工艺流程图；
图2为实施例1中的烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱的提取离子流SIM图；
图3为实施例1中的NDMA、NDEA、NPYR、NMOR、NPIP的总离子流图；
图4～图8依次为NDMA、NDEA、NPYR、NMOR、NPIP的提取离子流MRM图；
图9为实施例1中的16种PAHs的总离子流图；
图10～图20为16种PAHs的提取离子流MRM图；
图21为实施例1中的香豆素、NNN、NAT、NAB、NNK的总离子流图；
图22～图26为香豆素、NNN、NAT、NAB、NNK的提取离子流MRM图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
具体实施方式中所采用的硅胶固相萃取柱的规格为：填料500mL，柱床体积为3mL；所采用的混合内标溶液中，2-甲基喹啉浓度为50mg/mL，6-异丙基喹啉、6-叔丁基喹啉、降烟碱-d4的浓度均为20μg/mL，NDMA-d6、NPYR-d8、NPIP-d10、NMOR-d8、NDEA-d10、香豆素-d4的浓度均为200ng/mL，NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4的浓度均为2μg/mL，萘-d8、苊-d10、蒽-d10、芘-d10、苯并[a]蒽-d12、苯并[a]芘-d12、二苯并[a，h]蒽-d14的浓度均为200ng/mL。
实施例1
本实施例的烟草及烟草制品中成分的处理方法，如图1所示，包括以下步骤：
1)将散装***烟在加入液氮下研磨，称量0.5g磨碎后样品并转移至50mL离心管，加入100μL混合内标溶液，再加入5mL的2％氢氧化钠水溶液，静置15min，再加入20mL二氯甲烷，涡旋振荡20min，6000r/min下离心5min，分层，得到有机相；
2)取12mL下层有机相，加入2g无水硫酸钠并静置1h，得到除水体系；
取所得除水体系的上层清液1mL通过GC-MS仪器的SIM模式检测烟碱及次级生物碱；所得的提取离子流SIM图如图2所示，各定量离子为：133(烟碱)、119(降烟碱)、105(假木贼碱)、160(新烟草碱)；
3)将硅胶固相萃取柱采用10mL二氯甲烷平衡后，取步骤2)中所得除水体系的上清液10mL以2mL/min的速率上样，然后以1mL/min的速率加入10mL二氯甲烷淋洗，收集上样及淋洗过程流出液并浓缩至0.5mL，得到浓缩液1；
取浓缩液1用于多环芳烃(GC-MS/MS，EI源)、挥发性亚硝胺(GC-MS/MS，CI源，氨气为反应气)的检测；5种挥发性亚硝胺的总离子流图及提取离子流MRM图谱分别见图3～8，各个定量离子对为92/43(NDMA)、120/103(NDEA)、118/101(NPYR)、134/117(NMOR)、132/41(NPIP)，可达基线分离并准确定量；
16种多环芳烃的总离子流图和提取离子流MRM图谱见图9～20，各个定量离子对为128/127(萘)、152/151(萘并乙烯)、154/153(苊)、166/165(芴)、178/176(菲)、178/176(蒽)、202/200(荧蒽)、202/200(芘)、228/226(苯并[a]蒽)、228/226
Figure BDA0001672114290000081
252/250(苯并[b]荧蒽)、252/250(苯并[k]荧蒽)、252/250(苯并[a]芘)、276/275(茚并[1,2,3-cd]芘)、278/276(二苯并[a，h]蒽)、276/274(苯并[g,h,i]芘)；
4)以1mL/min速率加入15mL乙酸乙酯继续洗脱硅胶固相萃取柱，收集乙酸乙酯洗脱液浓缩至0.5mL，得到浓缩液2；将浓缩液2用于分析香豆素、NNN、NNK、NAT、NAB，所采用仪器为GC-MS/MS(CI源、氨气为反应气)；
香豆素、NNN、NAT、NAB、NNK的总离子流图及提取离子流MRM图谱见图21～26，各个定量离子对为164/91(香豆素)、178/148(NNN)、190/160(NAT)、192/162(NAB)、208/122(NNK)；
5)分别配制各内标物的不同浓度的标准溶液，按照对应待测成分的检测方法以峰面积对浓度作图得到工作曲线，然后根据检测结果及各工作曲线计算相应成分的含量。
实施例2
本实施例的烟草及烟草制品的处理方法，包括以下步骤：
1)将烟丝样品在常温下机械磨碎，称量0.5g磨碎后样品转移至50mL离心管，加入100μL混合内标溶液，再加入3mL的5％氢氧化钾水溶液，静置20min，然后加入15mL环己烷，涡旋振荡20min，再在5000r/min下离心3min，分层，得到有机相；
2)取10mL上层有机相，加入2g无水硫酸钠并静置1h，得到除水体系；
3)将硅胶固相萃取柱采用10mL二氯甲烷平衡后，取除水体系的上清液8mL以1mL/min的速率上样，然后再以2mL/min的速率加入10mL环己烷淋洗，收集上样及淋洗过程流出液浓缩至1.0mL，得到浓缩液1；
4)以3mL/min的速率加入15mL1-丙醇继续洗脱硅胶固相萃取柱，收集1-丙醇洗脱液浓缩至0.5mL，得到浓缩液2；
步骤1)中得到的有机相用于烟碱及次级生物碱的检测；步骤2)得到的浓缩液用于多环芳烃(GC-MS/MS，EI源)、挥发性亚硝胺(GC-MS/MS，CI源，氨气为反应气)的检测；步骤3)得到的浓缩液2用于烟草中特有亚硝胺和香豆素的检测；
5)分别配制各内标物的不同浓度的标准溶液，按照对应待测成分的检测方法以峰面积对浓度作图得到工作曲线，然后根据检测结果及各工作曲线计算相应成分的含量。
实施例3
本实施例的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，包括以下步骤：
1)直接取1袋袋装型***烟样品A(质量约为1g)，称量并记录袋装型***烟样品A的重量后，加工袋装型***烟样品A从中间撕开并将***烟粉末转移至50mL离心管，并将撕开的袋子也置放于该离心管中，然后加入100μL混合内标溶液，再加入5mL的5％氢氧化钠水溶液，静置20min；然后加入20mL二氯甲烷，涡旋振荡15min，再在5000r/min下离心3min，分层，得到有机相；
2)取10mL下层有机相，加入2g无水硫酸钠并静置1h，得到除水体系；
取除水体系的上清液1mL采用GC-MS仪器的SIM模式对烟碱及次级生物碱碱性检测；
3)将硅胶固相萃取柱采用10mL二氯甲烷平衡后，取步骤2)除水体系的上清液8mL以1mL/min的速率上样，然后再以2mL/min的速率加入10mL二氯甲烷淋洗，收集上样及淋洗过程流出液并浓缩至1.0mL，得到浓缩液1；
取浓缩液1用于多环芳烃(GC-MS/MS，EI源)、挥发性亚硝胺(GC-MS/MS，CI源，氨气为反应气)的检测；
4)以1mL/min的速率加入10mL乙酸乙酯继续洗脱硅胶固相萃取柱，收集乙酸乙酯洗脱液并浓缩至1mL，得到浓缩液2；
采用GC-MS/MS(CI源、氨气为反应气)对浓缩液2中香豆素、NNN、NNK、NAT、NAB碱性检测；
5)分别配制各内标物的不同浓度的标准溶液，按照对应待测成分的检测方法以峰面积对浓度作图得到工作曲线，然后根据检测结果及各工作曲线计算相应成分的含量。
按照本实施例的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法进行5次平行实验，该5次平行实验的测定均值及精密度如表1所示，可以看到，除了均未检测到香豆素指标，其余检测指标的精密度均在7％以内，证明该样品制备方案重现性较好。
表1成分的含量、日间精密度
Figure BDA0001672114290000101
Figure BDA0001672114290000111
实施例4
本实施例的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，包括以下步骤：
1)称取2g散装***烟转移至50mL离心管，并将撕开的袋子也置放于该离心管中，然后加入100μL混合内标溶液，再加入20mL的含5％氢氧化钠的氯化钠水溶液，静置20min；然后加入10mL甲苯，涡旋振荡15min，再在5000r/min下离心3min，分层，得到有机相；
2)取8mL上层有机相，加入2g无水硫酸钠并静置1h，得到除水体系；
取除水体系的上清液1mL采用GC-MS仪器的SIM模式对烟碱及次级生物碱碱性检测；
3)将硅胶固相萃取柱采用5mL二氯甲烷平衡后，取步骤2)除水体系的上清液5mL以2mL/min的速率上样，然后再以2mL/min的速率加入3mL二氯甲烷淋洗，收集上样及淋洗过程流出液并浓缩至2.0mL，得到浓缩液1；
取浓缩液1用于多环芳烃(GC-MS/MS，EI源)、挥发性亚硝胺(GC-MS/MS，CI源，氨气为反应气)的检测；
4)以2mL/min的速率加入5mL乙酸乙酯继续洗脱硅胶固相萃取柱，收集乙酸乙酯洗脱液并浓缩至2mL，得到浓缩液2；
采用GC-MS/MS(CI源、氨气为反应气)对浓缩液2中香豆素、NNN、NNK、NAT、NAB碱性检测；
5)分别配制各内标物的不同浓度的标准溶液，按照对应待测成分的检测方法以峰面积对浓度作图得到工作曲线，然后根据检测结果及各工作曲线计算相应成分的含量。
实验例1
本实验例为加标试验，试验方法包括以下步骤：
1)平行置放3个50mL离心管，分别标记为离心管A、离心管B、离心管C；针对每个离心管，分别直接取1袋袋装型***烟样品A，从中间撕开并将***烟粉末转移至50mL离心管，称量并记录***烟样品的具体重量后，将撕开袋子置放于该离心管中，依次加入100μL混合内标溶液(同实施例1)、混合标准品溶液，再加入5mL的5％氢氧化钠水溶液，静置20min；然后加入20mL二氯甲烷，涡旋振荡15min，再在5000r/min下离心3min，分层，得到有机相；
其中，离心管A、离心管B、离心管C中加入的混合标准品试剂量分别为低、中、高三个水平，分别为化合物含量的50％、100％，200％添加量(未检出的NMOR、香豆素除外)；NMOR、NPIP的低、中、高三个添加水平分别为2ng/g、5ng/g、10ng/g；
2)其余操作步骤同实施例3的步骤2)～4)。
各待测成分所测定回收率(见表2)在82-109％之间，可见本发明的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法准确率高。
表2各待测成分的回收率
Figure BDA0001672114290000121
Figure BDA0001672114290000131

Claims (4)

1.一种烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
i）称取待测样品加入碱性溶液、内标溶液进行提取，然后加入有机溶剂A混匀，分层，所得有机相进行除水，得到有机相；所述内标溶液中的内标物包括挥发性亚硝胺内标物、多环芳烃内标物中的至少一种；所述内标物还包括烟草特有亚硝胺内标物、香豆素内标物中的至少一种；所述有机溶剂A为二氯甲烷、环己烷、苯、甲苯中的至少一种；所述碱性溶液为可溶性碱的水溶液或碱性的盐析剂溶液；所述可溶性碱的水溶液中的可溶性碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种；所述盐析剂溶液中的盐析剂为氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁中的至少一种；
ii）取有机相在硅胶固相萃取柱上上样，然后用有机溶剂B进行淋洗，收集淋洗过程的流出液；所述有机溶剂B为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种；
采用有机溶剂C洗脱硅胶固相萃取柱，收集洗脱液；所述有机溶剂C为乙酸乙酯、1-丙醇、异丙醇中的至少一种；
取得到有机相对烟碱及次级烟碱进行检测；
取所得的淋洗过程的流出液对挥发性亚硝胺和/或多环芳烃进行检测；
取所得的洗脱液对烟草特有亚硝胺和/或香豆素进行检测；
步骤i）中，每0.5~1g待测样品对应加入的有机溶剂A的体积为5~20mL；
步骤ii）中，将硅胶固相萃取柱的柱床体积记为1BV；淋洗时所采用的有机溶剂B的体积为1~3.5BV；淋洗时，有机溶剂B的流速为0.3~1BV/min；洗脱时采用的有机溶剂C的体积为1.5~3.5BV；洗脱时，有机溶剂C的流速为0.3~0.7BV/min。
2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，其特征在于：所述碱性溶液中OH-离子的浓度为0.2~1.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，其特征在于：还包括：取有机相在硅胶固相萃取柱上上样前，将硅胶固相萃取柱采用所述有机溶剂D进行平衡。
4.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种成分的检测方法，其特征在于：
将步骤ii）替换为：将硅胶固相萃取柱采用有机溶剂D进行平衡，取有机相在硅胶固相萃取柱上上样，然后用有机溶剂B进行淋洗，收集并合并上样及淋洗过程的流出液，得到合并液；所述有机溶剂B为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种；所述有机溶剂D为二氯甲烷、苯、环己烷中的至少一种；
采用有机溶剂C洗脱硅胶固相萃取柱，收集洗脱液；所述有机溶剂C为乙酸乙酯、1-丙醇、异丙醇中的至少一种；
取得到有机相对烟碱及次级烟碱进行检测；
取所得的合并液对挥发性亚硝胺和多环芳烃进行检测；
取所得的洗脱液对烟草特有亚硝胺和/或香豆素进行检测。
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