CN108956796A - 利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃的方法，其包括如下步骤：制备不同浓度标准样品溶液；检测分析不同浓度标准样品溶液中多环芳烃的含量；制备标准曲线；利用超临界萃取技术萃取植物叶片中多环芳烃，制备待测样品；对待测样品进行净化；检测分析待测样品中多环芳烃的含量。本发明利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃的含量，相比超声萃取和索氏萃取技术，简化了实验过程，减少了实验试剂用量，较好地规避了萃取过程中出现的杂质等问题，大大提高了植物叶片中多环芳烃的萃取效率，是目前对植物叶片中多环芳烃萃取科学、可靠、有效的方法。

Description

利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法
技术领域
本发明属于环境样品污染物检测领域，具体涉及一种利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法。
背景技术
当前，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，交通运输业和工业得到了迅猛发展，但环境污染问题日渐严重，其中大气污染对人类影响较大，引起了多方面的重视。多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是分子中两个或两个以上苯环的烃类有机物以及由它们衍生出来的各类化合物的统称，具有致癌性、致突变性等特征，对生态环境和人类健康造成了巨大威胁。
研究表明，植物可以作为大气环境中多环芳烃的天然被动采样器。大气中易挥发、低分子量的多环芳烃以气态形式沉降于叶片表面，难挥发、高分子量的多环芳烃则以颗粒物形式沉降于叶片表面，继而被叶片吸收。同时，植物叶面角质层上覆盖着一层蜡脂类物质，能够吸收气态的多环芳烃，而被蜡脂物质吸收的多环芳烃会被保留在表皮脂类物质中，并进一步向叶片内部迁移。因此，测定植物叶片中多环芳烃含量，进而监控、治理大气环境中多环芳烃污染，具有非凡的意义。
经过对大量技术文献的研究后发现，目前植物叶片中多环芳烃的测定过程分为萃取、净化和检测分析三个部分。其中萃取方法主要有以下几种：高效快速溶剂萃取法、超声萃取法等。净化方法一般采用固相萃取法(SPE)。检测分析方法常用的是：气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测法，气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)等。但快速高效萃取对操作者素质要求较高，且对低环多环芳烃萃取效率较低；而超声萃取有机溶剂扩散严重，共提取物较多。为保证萃取效率，目前研究中通常采用内标标准曲线法，减少实验过程中目标产物的损失。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用GC-MS技术对不同浓度标准样品溶液中各组分多环芳烃含量进行检测，制备标准曲线；所述标准曲线的公式为：式中，Ci为被测目标化合物浓度，Cs为内标物浓度，Ai为被测目标化合物峰面积，As为内标物峰面积；
S2、利用超临界萃取技术，制备植物叶片中多环芳烃待测样品；
S3、利用GC-MS技术检测所述待测样品得到待测化合物与内标物的峰面积比，对应所述标准曲线中待测化合物与内标物的浓度比，获得待测组分浓度。
优选的，所述不同浓度标准样品溶液的制备包括如下步骤：以多环芳烃标准溶液原液中的某种多环芳烃含量为基准，以正己烷或二氯甲烷为稀释溶剂，分别配置该多环芳烃浓度的若干个不同梯度；每个浓度梯度提取适当体积，加入体积为标准溶液体(即该适当体积)二分之一的浓度为2ug/mL的氘代多环芳烃作为内标物。
优选的，所述若干个不同梯度为5个不同梯度：4ug/mL、2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.1ug/mL。
优选的，分别配置Phenanthrene菲浓度的5个不同梯度：4ug/mL、2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.1ug/mL；每个浓度梯度提取100uL，加入50uL浓度为2ug/mL的Naphthalene-d8氘代萘作为内标物。
优选的，所述多环芳烃标准溶液原液中含9.89ug/mL萘、5.41ug/mL苊烯、4.80ug/mL苊、4.07ug/mL芴、10.00ug/mL菲、3.23ug/mL蒽、7.20ug/mL荧蒽、7.74ug/mL嵌二萘、3.19ug/mL苯[a]蒽、4.00ug/mL3.40ug/mL苯并[k]荧蒽、3.40ug/mL苯并[b]荧蒽、4.04ug/mL苯并[a]芘、3.82ug/mL茚并(1，2，3-cd)芘、3.94ug/mL二苯并[a，h]蒽、4.90ug/mL苯并[g，h，i]
优选的，步骤S1中，所述制备标准曲线包括：以不同浓度标准样品溶液中目标化合物与内标物的峰面积之比为横轴，以目标化合物与内标物浓度之比为纵轴作图，并利用线性拟合方法，对所得数据进行拟合，得到所述标准曲线。
优选的，步骤S1中，利用GC-MS技术对不同浓度标准样品溶液中各组分多环芳烃含量进行检测包括：采用EI离子源方式进行轰击，电离电压70-75V，扫描范围50-500amu；采用色谱选用30m Rtx-5MS毛细柱，柱内径0.25mm，膜厚0.25um，氦气为载气，柱温程序为30℃-50℃，恒温5min，然后以10℃/min的速度升温至120℃-150℃，并在120℃-150℃恒温2-5min；再以20℃/min的速度升温至250℃-300℃，并在250℃-300℃保持15min以上；分析过程中以分流方式进行，分流比为10∶1-15∶1，以线速度进行流量控制，柱流量为1.12mL/min。
优选的，步骤S2中，制备植物叶片中多环芳烃待测样品包括：利用超临界萃取仪，称取预处理后的植物样品加入萃取釜，取适量植物样品，加入样品重量一半的无水硫酸、与样品等量的硅胶，并加入与植物样品质量比为1∶20的浓度为2ug/mL的氘代多环芳烃作为内标物；温度设置为120℃-180℃，压强设置为250-350atm；萃取时间为30-40min；共溶剂为正己烷或二氯甲烷；在收集待测样品时，用正己烷或二氯甲烷作为收集溶剂，并将流速控制在2-6mL/min。
优选的，所述预处理包括：在非降雨期内，选取若干个棵成熟的、大小相似、生长健康且外表无损伤的乔木，且两棵树之间间隔至少100m；在离地2-3m处，从东南西北四个方向分别采集健康完整的叶片，混合后作为一个样品；将样品进行粉碎并混合。
优选的，所述制备植物叶片中多环芳烃待测样品还包括利用固相萃取分离净化技术对待测样品进行净化的步骤。
优选的，所述净化具体为：选用硅胶和氧化铝联用小柱；用35mL甲苯对小柱进行活化，将样品上样，用2-3mL正己烷进行淋洗，用体积比3∶2的正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗脱多次；收集洗脱液，混合，氮吹浓缩至近干，用二氯甲烷定容至2mL。
优选的，步骤S3中，利用GC-MS技术检测所述待测样品的检测参数及步骤与步骤S1中的检测参数及步骤相同。
本发明是利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量，相比超声萃取和索氏萃取技术，简化了实验，减少了实验试剂用量，较好地规避了萃取过程中出现的杂质等，大大提高了萃取效率，是目前对植物叶片中多环芳烃萃取科学、可靠、有效的方法。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次将超临界萃取技术应用于植物叶片中，由于植物叶片本身特性，含有较多色素、蜡质等杂质，本发明首次利用超临界萃取技术较好地规避了植物叶片所带来的一些杂质。相对于索氏萃取，大大节约了时间(索氏要24小时，超临界2小时)，相对于超声萃取，规避杂质效果较好，萃取效率较高(超临界的峰比超声的干净)。
2、本发明所提及的参数(超临界萃取步骤的参数，不包括净化步骤参数和GCMS的参数)均是独有的，是最适合于植物叶片萃取(对植物杂质规避效果最好)的参数。
3、用本发明探索出的最适用于植物叶片的参数进行萃取，能发现萃取出来的杂质较少(萃取液较为澄清，且GCMS出峰干净)，且萃取效果较好(回收率高)。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为标准曲线(以萘为例)；
图2为某生长季四种代表植物叶片中多环芳烃含量(以菲为例)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
1、制备标准样品的标准曲线：
1.1制备不同浓度梯度标准样品
选取一定量的多环芳烃标准溶液原液(其中，Phenanthrene菲的浓度为10ug/mL)，以正己烷为稀释溶剂，分别稀释至4ug/mL、2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.1ug/mL，如表1所示。每个浓度梯度溶液中取100uL，加入50uL浓度为2ug/mL的Naphthalene-d8氘代萘作为内标物。装入棕色瓶，密封，待测。
表1不同浓度梯度中标准溶液不同组分浓度
1.2制备标准曲线
利用GC-MS技术，对标准样品中各组分多环芳烃含量进行检测分析。由于部分组分化学量相近，难以区分，因此，将部分组分合并。以标准溶液中目标化合物与内标物的峰面积之比为横轴，以目标化合物与内标物浓度之比为纵轴作图，并利用线性拟合方法，对所得数据进行拟合，得到标准曲线：
式中，Ci为被测组分浓度，Cs为内标物浓度，Ai为被测组分峰面积，As为内标物峰面积。
标准曲线(以Naphthalene萘为例)如图1所示。
2、制备植物叶片中多环芳烃待测样品：
2.1采样
2018年3月30日，于上海市闵行区吴泾公园，以香樟、雪松、广玉兰、罗汉松为目标树种，选取5棵成熟的(树龄10-20年)、大小相似、生长健康且外表无损伤的乔木，且两棵树之间间隔至少100m。在离地2-3m处，从东南西北四个方向分别采集健康完整的叶片，混合后作为一个样品。样品采集后，迅速放入聚乙烯袋中，避光运回实验室。将样品粉碎并混合。
2.2萃取
利用超临界萃取仪，称取5g植物样品加入萃取釜，加入2g无水硫酸、5g硅胶，250uL浓度为2ug/mL的Naphthalene-d8氘代萘作为内标物质。温度设置为180℃，压强设置为350atm。萃取时间为30-40min。共溶剂为正己烷。在收集待测样品时，用二氯甲烷作为收集溶剂，并将流速控制在4mL/min。
2.3净化与浓缩
利用固相萃取分离净化技术，选用硅胶和氧化铝联用小柱。用5mL甲苯对小柱进行活化，将样品上样，用2mL正己烷进行淋洗，用5mL混合溶液(正己烷和二氯甲烷混合溶液，体积比3∶2)洗脱5次。收集洗脱液，混合，氮吹浓缩至近干，用二氯甲烷定容至2mL。
3、待测样品检测分析
利用GC-MS技术检测分析待测样品中多环芳烃含量。采用EI离子源方式进行轰击，电离电压70V，扫描范围50-500amu。采用色谱选用30m Rtx-5MS毛细柱，柱内径0.25mm，膜厚0.25μm，氦气为载气，柱温程序为40℃恒温5min，然后以10℃/min的速度升温至120℃，并在120℃恒温2min；再以20℃/min的速度升温至300℃，并在300℃保持20min。分析过程中以分流方式进行，分流比为10∶1，以线速度进行流量控制，柱流量为1.12mL/min。
得到待测组分与内标物质的峰面积比，对应标准曲线中待测组分与内标物质的浓度比，从而得到待测组分浓度。
不同树种叶片中多环芳烃含量(以Phenanthrene菲为例)如图2所示。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、利用GC-MS技术对不同浓度标准样品溶液中各组分多环芳烃含量进行检测，制备标准曲线；所述标准曲线的公式为：式中，Ci为被测目标化合物浓度，Cs为内标物浓度，Ai为被测目标化合物峰面积，As为内标物峰面积；
S2、利用超临界萃取技术，制备植物叶片中多环芳烃待测样品；
S3、利用GC-MS技术检测所述待测样品得到待测化合物与内标物的峰面积比，对应所述标准曲线中待测化合物与内标物的浓度比，获得待测组分浓度。
2.如权利要求1所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述不同浓度标准样品溶液的制备包括如下步骤：以多环芳烃标准溶液原液中的某种多环芳烃含量为基准，以正己烷或二氯甲烷为稀释溶剂，分别配置该多环芳烃浓度的若干个不同梯度；每个浓度梯度提取适当体积，加入体积为标准溶液体积二分之一的浓度为2ug/mL的氘代多环芳烃作为内标物。
3.如权利要求2所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，所述多环芳烃标准溶液原液中含9.89ug/mL萘、5.41ug/mL苊烯、4.80ug/mL苊、4.07ug/mL芴、10.00ug/mL菲、3.23ug/mL蒽、7.20ug/mL荧蒽、7.74ug/mL嵌二萘、3.19ug/mL苯[a]蒽、4.00ug/mL3.40ug/mL苯并[k]荧蒽、3.40ug/mL苯并[b]荧蒽、4.04ug/mL苯并[a]芘、3.82ug/mL茚并(1，2，3-cd)芘、3.94ug/mL二苯并[a，h]蒽、4.90ug/mL苯并[g，h，i]苝。
4.如权利要求1所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述制备标准曲线包括：以不同浓度标准样品溶液中目标化合物与内标物的峰面积之比为横轴，以目标化合物与内标物浓度之比为纵轴作图，并利用线性拟合方法，对所得数据进行拟合，得到所述标准曲线。
5.如权利要求1所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，步骤S1中，利用GC-MS技术对不同浓度标准样品溶液中各组分多环芳烃含量进行检测包括：采用EI离子源方式进行轰击，电离电压70-75V，扫描范围50-500amu；采用色谱选用30m Rtx-5MS毛细柱，柱内径0.25mm，膜厚0.25um，氦气为载气，柱温程序为30℃-50℃，恒温5min，然后以10℃/min的速度升温至120℃-150℃，并在120℃-150℃恒温2-5min；再以20℃/min的速度升温至250℃-300℃，并在250℃-300℃保持15min以上；分析过程中以分流方式进行，分流比为10∶1-15∶1，以线速度进行流量控制，柱流量为1.12mL/min。
6.如权利要求1所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，步骤S2中，制备植物叶片中多环芳烃待测样品包括：利用超临界萃取仪，称取预处理后的植物样品加入萃取釜，取适量植物样品，加入样品重量一半的无水硫酸、与样品等量的硅胶，并加入与植物样品质量比为1∶20的浓度为2ug/mL的氘代多环芳烃作为内标物；温度设置为120℃-180℃，压强设置为250-350atm；萃取时间为30-40min；共溶剂为正己烷或二氯甲烷；在收集待测样品时，用正己烷或二氯甲烷作为收集溶剂，并将流速控制在2-6mL/min。
7.如权利要求6所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，所述预处理包括：在非降雨期内，选取若干棵成熟的、大小相似、生长健康且外表无损伤的乔木，且两棵树之间间隔至少100m；在离地2-3m处，从东南西北四个方向分别采集健康完整的叶片，混合后作为一个样品；将样品进行粉碎并混合。
8.如权利要求6所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，所述制备植物叶片中多环芳烃待测样品还包括利用固相萃取分离净化技术对待测样品进行净化的步骤。
9.如权利要求8所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，所述净化具体为：选用硅胶和氧化铝联用小柱；用3-5mL甲苯对小柱进行活化，将样品上样，用2-3mL正己烷进行淋洗，用体积比3∶2的正己烷和二氯甲烷的混合溶液洗脱多次；收集洗脱液，混合，氮吹浓缩至近干，用二氯甲烷定容至2mL。
10.如权利要求1所述的利用超临界萃取技术测定植物叶片中多环芳烃含量的方法，其特征在于，步骤S3中，利用GC-MS技术检测所述待测样品的检测参数及步骤与步骤S1中的检测参数及步骤相同。
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