CN108949678A - 一种干细胞培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干细胞培养基，包括基础培养基以及添加剂，添加剂包括重组转铁蛋白1～200μg/mL，重组白蛋白1～300μg/mL，重组细胞因子0.1～200ng/mL，游离脂肪酸10～300μg/mL，蛋白酶抑制剂0.1～10mg/mL，维生素20～300μg/mL，硫酸锌0.5～10mg/mL，维A酸0.01～1mmol/L，***钠10～60nmol/L，尼克酰胺5～100μg/mL；本发明同时公开了一种干细胞培养方法，即使用本发明所提供的无血清干细胞培养基对干细胞进行三维培养。本发明提供的培养基及培养方法，扩大了培养基的适用性，同时为干细胞提供稳定的生长环境，显著提高干细胞培养效率，降低培养基的使用成本。

Description

一种干细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种干细胞培养基及培养方法。
背景技术
干细胞是指来自于胚胎、胎儿、成人的具有自我更新和不断繁殖以及分化为多种细胞能力的一类细胞，是机体及其他各种组织细胞的初始来源，这些细胞能够分化成为各种不同的组织细胞，是生物医学领域不佳而缺少的细胞来源，对于临床应用的意义非凡，因此近年来干细胞的研究是生物医学研究的热点。而由于干细胞在机体组织中含量甚微，因此体外培养、扩增干细胞，以使干细胞的数量满足干细胞相关作用及机制的需要，是干细胞研究领域中的关键技术。
目前，干细胞体外培养所用的培养基主要有血清培养基和无血清培养基。其中，血清培养基牵扯到血清的成分复杂、血清批间差异、成本高等问题，越来越多的科学家通过研究手段确定配细胞生长所需的营养物质成分，并通过试验确定了可以促进细胞生长时这些营养物质在培养基中的最低含量，从而丰富了人们对无血清培养基的认识。无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的添加剂两部分组成。基础培养基通常由葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等按一定比例的组合而成；而添加剂替代了传统培养基中的血清，既能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足动物细胞培养的要求。
干细胞的培养目前多是在二维培养条件下完成的，而二维细胞培养技术培养的细胞在体外环境下逐渐丧失了其体内原有的性状，在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远。
中国专利CN106520690A“一种无血清干细胞培养基”公开了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、淫羊藿苷、甘氨酰丙氨酸、丙氨酰-L酪氨酸、多聚赖氨酸、维生素E、聚乙烯吡咯烷酮、转化生长因子-β、还原性谷胱甘肽和碳酸氢钠，该培养基能够促进细胞的生长和增殖，并能明显促进干细胞的分化。
中国专利CN105087479A“无血清干细胞培养基及干细胞的培养方法”公开了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基、胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、***钠、孕酮和丁二胺，同时还公开了一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：获取干细胞，采用本发明提供的无血清干细胞培养基进行体外培养。
中国专利CN108220231A“一种干细胞培养基及其制备方法和应用”公开了一种干细胞培养基及其制备方法和应用，所述培养基包括间充质无血清干细胞培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和肝细胞因子，该发明有效解决现有技术的干细胞培养基不适合培养经血干细胞的技术缺陷。
目前，无血清干细胞培养基处于不断发展的过程之中，也存在许多不足之处，比如目前的培养基只能用于一种或少数几种干细胞的培养，缺少通用性；另外也存在使用成本比较昂贵等的缺点。因此，扩大培养基的适用性，降低培养基的使用成本是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种无血清干细胞培养基以及培养方法，扩大培养基的通用性，提高干细胞的培养效率，降低培养基的使用成本。
为达到上述技术目的，本发明采取以下技术方案：一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，添加剂包括重组转铁蛋白、重组白蛋白、重组细胞因子、游离脂肪酸、蛋白酶抑制剂、维生素、硫酸锌、维A酸、***钠、尼克酰胺。
优选地，所述添加剂在培养基中的用量分别为：重组转铁蛋白1～200μg/mL，重组白蛋白1～300μg/mL，重组细胞因子0.1～200ng/mL，游离脂肪酸10～300μg/mL，蛋白酶抑制剂0.1～10mg/mL，维生素20～300μg/mL，硫酸锌0.5～10mg/mL，维A酸0.01～1mmol/L，***钠10～60nmol/L，尼克酰胺5～100μg/mL。
优选地，所述基础培养基为低糖DMEM培养基或DMEM/F12(1：1)培养基。
优选地，所述重组细胞因子为重组表皮生长因子(EGF)、重组成纤维细胞生长因子(FGF)，重组神经生长因子(NGF)，重组血小板衍生生长因子(PDGF)，重组转化生长因子-β(TGF-β)，重组肝细胞生长因子(HGF)中的一种或几种的组合。
优选地，所述游离脂肪酸为亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸、丙氨酸中的一种或几种的组合。
优选地，所述蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤维蛋白溶酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂中的一种或几种的组合。
优选地，所述维生素包括维生素C、维生素E、维生素B族。
优选地，所述添加剂还包括芍药苷，其用量为1～20μmol/L。
一种干细胞培养方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
1)分离干细胞后，加入本发明的培养基吹打均匀，细胞密度在1～10×105个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取支架材料，用权利要求1)所述的培养基溶解，浓度3～30g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.0～7.5，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到1～10×106个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置带水凝胶凝固后，每孔再加入1mL本发明的无血清干细胞培养基，置细胞培养箱中培养。
优选地，步骤2)所述支架材料为透明质酸、基质胶、海藻酸钠、纤维蛋白、壳聚糖、聚乳酸中的一种或几种的组合。
本发明取得的有益效果：
1.本发明采用了硫酸锌代替胰岛素，刺激细胞生长，细胞***，调节葡萄糖和脂类代谢，降低了培养基的成本。
2.本发明采用维A酸，显著提高了干细胞的增殖能力。
3.本发明采用无血清培养基替代传统的血清培养基，减少了动物血清带来的一系列成分复杂等问题，使培养基的成分更加明确，质量更可控；同时本发明提供的培养基能进一步提高干细胞的培养效率，降低培养基的使用成本。
4.本发明采用三维技术培养干细胞，为干细胞培养提供了更为稳定的环境，进一步提高了干细胞的培养效率。
说明书附图
图1为干细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐述本发明，但下述实施例并不构成对本发明的限制。
下述实施例中，除特殊说明以外，所用试剂均为生化级试剂，并能通过商业渠道获得。下述实施例中所提及的细胞培养箱的培养条件，如无特殊说明，均为温度37℃，湿度95％，CO2体积分数5％。
实施例1无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为低糖DMEM培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例2无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为DMEM/F12(1：1)培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例3无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为低糖DMEM培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例4无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为低糖DMEM培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例5无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为低糖DMEM培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例6无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为DMEM/F12(1：1)培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例7无血清干细胞陪养基
无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂。
其中，基础培养基为RPMI-1640培养基，添加剂的种类和用量为：
实施例8干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在4×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取海藻酸钠、透明质酸(1：1)，用培养基溶解，浓度8g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.1，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到5×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例9干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在5×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取透明质酸、纤维蛋白(1：1)，用培养基溶解，浓度8g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.2，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到5.5×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例10干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在9×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取基质胶、纤维蛋白(1：2)，用培养基溶解，浓度12g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.4，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到9×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例11干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在2×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取聚乳酸、纤维蛋白，用培养基溶解，浓度28g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.1，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到1.5×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例12干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在4×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取海藻酸钠、壳聚糖(2：1)用培养基溶解，浓度为12g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.4，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到2×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例13干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离神经干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在5×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取海藻酸钠，用培养基溶解，浓度10g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.2，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到3×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例14干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在6×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取聚乳酸、纤维蛋白、海藻酸钠(2：2：1)，用培养基溶解，浓度8g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.2，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到4.5×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
实施例15干细胞培养方法
一种干细胞培养方法，具体的，其所采用的培养基为本发明实施例1所述的无血清培养基，培养过程包括如下步骤：
1)分离干细胞后，加入培养基吹打均匀，细胞密度在5.5×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取透明质酸、纤维蛋白、海藻酸钠(2：1：1)，用培养基溶解，浓度8g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.2，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到5.5×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
对比例1：干细胞培养基
参考CN105087479A“无血清干细胞培养基及干细胞的培养方法”中实施例1，无血清干细胞培养基的组分及各组分在干细胞无血清培养基中的浓度分别为：
DMEM/F12培养基：100mL；
***钠：50μg/mL；
转铁蛋白：150μg/mL；
柠檬酸铁：50μg/mL；
胰岛素：15μg/mL；
谷氨酰胺的浓度为5mmol/L；
孕酮的浓度为10mmol/L；
丁二胺的浓度为40μmol/L。
试验例1干细胞培养
本试验取实施例1所述的培养基以及实施例8、实施例9的方法培养干细胞，即设置A、B两个试验组。
对照组参考CN105087479A“无血清干细胞培养基及干细胞的培养方法”中提及的方法。
本试验例中干细胞选取成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)，来自赛业(苏州)生物科技有限公司。
具体试验步骤如下：
1)骨髓间充质干细胞复苏：取传代至二代的BMSCs，复苏后继续培养，用流式细胞仪对培养的BMSCs进行鉴定。选取第三代生长良好的BMSCs，在倒置显微镜下观察细胞的形态变。
2)试验组A、B：取生长良好的第三代BMSCs，分别按照实施例8、9的方法，自步骤1)“胰酶消化传代”起按步骤操作，最终在细胞培养箱中培养两周。
3)对照组：取生长良好的第三代BMSCs，接种到对比例1所述的培养基中，置培养箱中培养两周。试验例2细胞生长曲线的测定
采用MTT法测定细胞生长曲线。MTT试剂盒来自sigma公司。
本试验例中干细胞选取成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)，来自赛业(苏州)生物科技有限公司。
具体步骤为，
1)胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，用PBS制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×106个/mL。
2)试验分组：试验组A、B，对照组C、D
①试验组A、B
分别按照实施例8、实施例9中步骤2)中的操作，每天取样0.3mL，取其中的0.1mL用于细胞计数。
②对照组C、D
对照组C、D分别加入实施例1中的无血清干细胞培养基和对比例1中的无血清干细胞培养基。
具体操作步骤为：取7块96孔板，在外周孔加入灭菌PBS填充，第二竖排孔加入无血清培养基作为空白对照，其余每孔接种100μL细胞悬液，并加入200μL无血清培养基填充，每3天对96孔板内培养基进行换液。
每天取出3孔细胞进行计数，计算均值。
3)分别以上述试验组的时间为横轴，平均细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。
细胞生长曲线结果见图1，由图可知，在二维培养的情况下，细胞培养至第六天即进入稳定期，而在三维培养的条件下，细胞增殖效率显著提高。比较同期培养获得活细胞数量，试验组显著高于对照组，在对照组中，本发明提供的无血清干细胞培养基(即对照组C)的培养效率明显高于对比例提供的无血清干细胞培养基(即对照组D)。可见，本发明提供的无血清干细胞培养基即干细胞培养方法能够显著提高干细胞的培养效率。

Claims (10)

1.一种干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，其特征在于，所述添加剂包括重组转铁蛋白、重组白蛋白、重组细胞因子、游离脂肪酸、蛋白酶抑制剂、维生素、硫酸锌、维A酸、***钠、尼克酰胺。
2.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加剂在培养基中的用量分别为：重组转铁蛋白1～200μg/mL，重组白蛋白1～300μg/mL，重组细胞因子0.1～200ng/mL，游离脂肪酸10～300μg/mL，蛋白酶抑制剂0.1～10mg/mL，维生素20～300μg/mL，硫酸锌0.5～10mg/mL，维A酸0.01～1mmol/L，***钠10～60nmol/L，尼克酰胺5～100μg/mL。
3.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为低糖DMEM培养基或DMEM/F12(1：1)培养基。
4.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述重组细胞因子为重组表皮生长因子(EGF)、重组成纤维细胞生长因子(FGF)，重组神经生长因子(NGF)，重组血小板衍生生长因子(PDGF)，重组转化生长因子-β(TGF-β)，重组肝细胞生长因子(HGF)中的一种或几种的组合。
5.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述游离脂肪酸为亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸、丙氨酸中的一种或几种的组合。
6.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤维蛋白溶酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂中的一种或几种的组合。
7.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述维生素包括维生素C、维生素E、维生素B族。
8.如权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加剂还包括芍药苷，其用量为1～20μmol/L。
9.一种干细胞培养方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
1)分离干细胞后，加入权利要求1中的培养基吹打均匀，细胞密度在1～10×106个/mL，将悬液接种在培养皿中，置细胞培养箱中培养，当细胞铺满80％皿底时，胰酶消化传代，离心收集细胞，重悬于PBS中，悬液置冰浴中备用；
2)取支架材料，用权利要求1)所述的培养基溶解，浓度3～30g/L，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值7.0～7.5，加入步骤1)所得细胞悬浮液，使细胞密度达到1～10×105个/mL，混匀后加到96孔培养板中，室温下放置至凝胶凝固后，每孔再加入1mL权利要求1所述的干细胞无血清培养基，置细胞培养箱中培养。
10.如权利要求9所述的干细胞培养方法，其特征在于，步骤2)所述支架材料为透明质酸、基质胶、海藻酸钠、纤维蛋白、壳聚糖、聚乳酸中的一种或几种的组合。
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