CN109402044A - 一种共培养肝细胞和肝窦内皮细胞的技术方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种共培养肝细胞系与肝窦内皮细胞系的方法及其应用。其特征在于：将肝窦内皮细胞系进行缺氧培养一定时间，然后收获肝窦内皮细胞系，与肝细胞系以一定比例进行共培养。与肝窦内皮细胞系共培养可部分模拟体内肝脏环境，有利于肝细胞功能，并且通过缺氧激活肝窦内皮细胞后，其促进肝细胞功能的能力增强，且不需使用外源的内皮细胞激活剂，减少外源物质的引入，有利于后续的细胞应用。本发明还提供这种共培养方法在包括药物筛选和生物人工肝制备等领域的应用。

Description

一种共培养肝细胞和肝窦内皮细胞的技术方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学和生物学领域，具体涉及肝细胞和肝窦内皮细胞的共培养方法以及共培养的肝细胞和肝窦内皮细胞在制备生物人工肝或药物筛选中的应用。
背景技术
体外培养的肝细胞在多方面具有应用或潜在应用价值，例如：药物或毒性物质筛选、肝炎病毒感染机制和治疗研究、以及利用培养的肝细胞制备生物人工肝用于肝衰竭的治疗等。但随着培养时间的延长，肝细胞在体外单层培养过程中极易丧失其结构特征和功能(Elaut G，Henkens T，Papeleu P，et al.Molecular mechanisms underlying thededifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.CurrDrug Metab，2006，7：629-660.)。体外培养肝细胞功能减退的主要原因是肝细胞脱离了体内微环境导致了表型和功能改变。肝细胞功能的维持依赖于肝脏的三维结构、肝细胞与肝细胞、以及肝细胞与***之间的相互作用。***在体内通过与肝细胞发生相互作用，如直接接触或旁分泌各类细胞因子、生长因子和细胞外基质，为肝脏细胞提供合适的生存微环境，并促进肝细胞迁移、增殖和分化等。
因此，很多研究者尝试各种模拟体内微环境的方法以提高肝细胞体外增殖和功能，包括三维立体培养、胶原双层凝胶、肝细胞球、肝细胞和***共培养等。研究发现肝细胞与肝脏非实质细胞(肝窦内皮细胞、枯否氏细胞、肝星形细胞)共同培养，可以使细胞间相互沟通信息，模拟体内环境、维持细胞功能和活力以及诱导细胞分化、调控细胞增殖、提高代谢物产量(Liu Y，Li H，Yan S，et al.Hepatocyte Cocultures with EndothelialCells and Fibroblasts on Micropatterned Fibrous Mats to Promote Liver-Specific Functions and Capillary Formation Capabilities.Biomacromolecules.2014，15(3)：1044-1054.Zinchenko YS，Schrum LW，Clemens M，et al.Hepatocyte andKupffer Cells Co-cultured on Micropatterned Surfaces to Optimize HepatocyteFunction.Tissue Engineering. 2006，12(4)：751-761.张茜，金若敏.细胞共培养技术的研究进展.中国药理学与毒理学杂志，2011，25(3)：330-332)。
肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)是肝脏非实质细胞的主要细胞群，占这些细胞数的70％左右。LSEC在肝脏物质交换、代谢、免疫中起着重要作用，并能分泌血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)等多种细胞因子，对维持肝脏功能非常重要。
当肝脏受损时，血管内皮生长因子升高，肝窦内皮细胞分泌HGF和IL-6来促进肝细胞再生。有报道显示，原代肝细胞在体外单独培养1周内逐渐死亡，而肝细胞与内皮细胞共培养在滚瓶中时可以形成异质细胞球，其中内皮细胞贴附在表面，局部形成了类似肝窦样的腔，且12天后肝细胞蛋白分泌较单独培养增加1倍，降低血氨能力明显升高(Lee DH，YoonHH，Lee JH，et al.Enhanced liver-specific functions of endothelial cell-coveredhepatocyte hetero-spheroids. Biochem Eng J，2004，20(2/3)：181-187)。
在上述对共培养研究中多采用原代分离培养的肝脏细胞，细胞难以在体外维持长期培养，每次分离获得的原代细胞增殖能力和功能会有所不同，难以进行稳定重复，这对其应用带来困难。使用肝细胞系和肝窦内皮细胞系是实际应用中的最佳选择，但细胞系获得体外无限增殖能力的同时，细胞功能会有所减弱。此前我们利用建立的肝窦内皮细胞系和肝细胞系进行共培养，发现虽然共培养可以增强肝细胞的功能基因表达，并且促进肝细胞对胆红素和氨的代谢(符思远，罗杏英，门秀丽等，肝窦内皮细胞对肝细胞生物学特性影响的体外研究。东南大学学报(医学版)2018，37(4)：566-572)，但共培养组比单独肝细胞组功能提升仅10-20％，共培养组在72h降低胆红素的能力尚不足50％，这对于要求肝细胞功能比较高的应用领域还需要改进。因此，如果要获得最佳的共培养效果，需要采取一定手段使肝窦内皮细胞系激活，以使之大量释放活性物质，增强改变肝细胞系局部微环境的效果。
发明内容
针对上述肝窦内皮细胞系与肝细胞系共培养的问题，本发明的目的之一是提供一种共培养肝细胞系与肝窦内皮细胞系的方法，其特征在于：将肝窦内皮细胞系进行缺氧培养一定时间，然后收获肝窦内皮细胞系，以一定比例与肝细胞系进行共培养。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
所述的肝窦内皮细胞系缺氧方式是将培养肝窦内皮细胞系的培养瓶或培养皿等放置于氧浓度≤3％的环境中进行培养，其中氧浓度≤3％的环境可以使用三气培养箱、可商业获得的缺氧装置，或密闭容器中通入95％氮气和5％二氧化碳的混合气体实现。
所述缺氧时间是放入肝窦内皮细胞系后，待缺氧环境中氧浓度达到≤3％的标准后开始计时3-24小时，优选6-12小时。
所述共培养的肝细胞系和肝窦内皮细胞系可以是任何哺乳动物来源。其中肝细胞系可以是来源于正常肝细胞也可以是来源于肝脏肿瘤细胞的细胞系。
所述共培养的肝细胞系和肝窦内皮细胞系，其中肝细胞系和肝窦内皮细胞系的比例为1∶0.25～1∶4，优选肝细胞系和肝窦内皮细胞系的比例为1∶0.5～1∶2。
所述共培养的方式可以是平面培养也可以是三维立体培养；平面培养包括但不限于使用细胞培养瓶、培养皿、细胞工厂等；三维立体培养包括但不局限于微载体培养、三维支架培养、凝胶培养等。
所述共培养的起始方式可以是将两种细胞分别收获后按照所述比例混匀后接种，也可以是将肝窦内皮细胞系收获后制备成单细胞悬液，加入到生长有肝细胞系的培养体系中。
本专利所提供的共培养方法中培养基和培养耗材可以是任何可商业获得的适合细胞培养的产品。
本发明的另一个目的是提供肝细胞和肝窦内皮细胞共培养方法的应用。该应用包括利用共培养的肝细胞和肝窦内皮细胞进行药物筛选，以及利用微载体大规模培养后用于制备生物人工肝的应用等。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
所述的利用共培养肝细胞系与肝窦内皮细胞系进行药物筛选，将肝细胞系和肝窦内皮细胞系按上述方法共培养在细胞培养板内，分别加入候选药物，通过检测肝细胞系的存活和功能指标判断候选药物的作用。
所述的共培养的肝细胞系与肝窦内皮细胞系在制备生物人工肝方面的应用，是将共培养的肝细胞系和肝窦内皮细胞系作为细胞材料，装载到生物反应器中，用于制备生物人工肝，其中生物反应器可以是任何适用于制备生物人工肝的生物反应器。
综上所述，本发明所提供的共培养肝细胞系和肝窦内皮细胞系的方法和应用，其优点在于：
1.采用与***共培养的方式促进体外培养的肝细胞系功能，模拟体内环境；
2.采用缺氧培养的方式使肝窦内皮细胞系激活，增强了共培养对肝细胞功能的支持作用；
3.使用体外具有无限增殖能力的肝细胞系和肝窦内皮细胞系，可长期稳定培养，适合产业化应用；
4.采用缺氧培养的方式激活内皮细胞系，不需添加其他激活内皮细胞的物质，因此避免了引入外源物质，有利于后续的细胞应用。
5.本发明的方法不仅可以用于肝脏药物的筛选，而且可以用于制备生物人工肝，应用前景广阔，经济价值和社会价值巨大。
下面结合具体实施方式进一步说明本发明，但是应当指出，实施例仅作为说明本发明的例子，不限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1：共培养方法1
将2瓶人肝窦内皮细胞系LSEC在正常条件下(95％空气、5％二氧化碳的 37℃培养箱)培养至60～80％汇合，然后1瓶继续正常培养，另1瓶放入氧浓度 3％的三气培养箱中，关好培养箱门，待氧浓度降至3％后开始计时，缺氧培养 24小时后取出培养瓶，用0.1％胰酶/0.1％EDTA消化法分别收集正常培养的和缺氧培养的LSEC，以及正常培养的人肝细胞系IHH。分成三组进行接种，每组6 孔。单纯IHH组：以1×104个IHH/孔的细胞密度接种24孔板；正常LSEC共培养组：IHH与正常培养的LSEC以1∶0.25的比例混合，接种于24孔板中，每孔含1×104个IHH细胞和2.5×103个LSEC；缺氧LSEC共培养组：IHH与缺氧培养的LSEC以1∶0.25的比例混合，接种于24孔板中，每孔含1×104个IHH细胞和2.5×103个LSEC。将培养板置于正常培养条件(95％空气、5％二氧化碳的37℃培养箱中)共培养24小时后，每组各取3孔用来检测降低肝衰竭患者血浆胆红素的作用，每组另外3孔用于检测肝细胞合成尿素的能力。具体地：
检测降低胆红素能力时，弃去各孔细胞培养基，更换为新鲜培养基和肝衰竭患者血浆1∶1的混合液，每孔1ml。另设无细胞的空白对照组，同样加液但孔中无细胞。继续培养24小时，收集每孔培养上清，离心去除杂质后用全自动生化分析仪检测总胆红素含量，结果如表1所示，IHH组具有降低胆红素的能力，与正常培养的LSEC共培养后IHH降低胆红素能力增强，而与缺氧培养后LSEC 共培养组效果最强，说明缺氧刺激提高了LSEC对IHH的功能支持作用。
检测尿素合成能力时，吸弃各孔培养基，用基础培养基洗涤2次，然后加入含有4mM氯化铵(NH4Cl)(Sigma公司，货号254134)的无血清培养基，1ml/ 孔。另设无细胞的空白对照组，同样加液但孔中无细胞。继续培养24小时后，取各孔培养上清，离心去除杂质后用尿素检测试剂盒(BioAssay公司，货号 UIDR-500)检测各孔培养上清中尿素含量。结果如表1所示，IHH组具有利用氨合成尿素的能力，与正常培养的LSEC共培养后IHH合成尿素能力有所提高，而与缺氧培养后LSEC共培养组尿素合成能力更强，说明缺氧刺激提高了LSEC 对IHH的功能支持作用。
表1：与缺氧处理的LSEC共培养对IHH功能的影响
实施例2：共培养方法2
将2瓶人肝窦内皮细胞系LSEC在正常条件下(95％空气、5％二氧化碳的 37℃培养箱)培养至60～80％汇合，然后1瓶继续正常培养，另1瓶放入氧浓度 2％的三气培养箱中，关好培养箱门，待氧浓度降至2％后开始计时，缺氧培养 12小时后取出培养瓶，用0.1％胰酶/0.1％EDTA消化法分别收集正常培养的和缺氧培养的LSEC，以及正常培养的人肝细胞系IHH。分成三组进行接种，每组6 孔。单纯IHH组：以1×104个IHH/孔的细胞密度接种12孔板；正常LSEC共培养组：IHH与正常培养的LSEC以1∶4的比例混合，接种于12孔板中，每孔含 1×104个IHH细胞和4×104个LSEC；缺氧LSEC共培养组：IHH与缺氧培养的 LSEC以1∶4的比例混合，接种于12孔板中，每孔含1×104个IHH细胞和4×104个LSEC。将培养板置于正常培养条件(95％空气、5％二氧化碳的37℃培养箱中)共培养24小时后，每组各取3孔用来检测降低肝衰竭患者血浆胆红素的作用，每组另外3孔用于检测肝细胞合成尿素的能力。检测方法同实施例1所述，检测结果如表2所示。
表2：与缺氧处理的LSEC共培养对IHH功能的影响
实施例3：共培养方法3
将2瓶人肝窦内皮细胞系LSEC在正常条件下(95％空气、5％二氧化碳的 37℃培养箱)培养至60～80％汇合，然后1瓶继续正常培养，另1瓶放入氧浓度 1％的三气培养箱中，关好培养箱门，待氧浓度降至1％后开始计时，缺氧培养6 小时后取出培养瓶，用0.1％胰酶/0.1％EDTA消化法分别收集正常培养的和缺氧培养的LSEC。另外于收获LSEC的前一天，将正常培养的人肝细胞系IHH接种 24孔板，1×104个IHH/孔，共接种18孔。收获LSEC后，分别按照5×103个LSEC/ 孔的量加入到IHH培养孔中，正常培养和缺氧培养的LSEC各接种6孔。将培养板置于正常培养条件(95％空气、5％二氧化碳的37℃培养箱中)共培养24 小时后，每组各取3孔用来检测降低肝衰竭患者血浆胆红素的作用，每组另外3 孔用于检测肝细胞合成尿素的能力。检测方法同实施例1所述，检测结果如表3 所示。
表3：与缺氧处理的LSEC共培养对IHH功能的影响
实施例4：共培养方法4
将2瓶人肝窦内皮细胞系LSEC在正常条件下(95％空气、5％二氧化碳的 37℃培养箱)培养至60～80％汇合，然后1瓶继续正常培养，另1瓶放入带有进气和出气管路的密闭容器中，从进气管路向容器中持续通入95％氮气和5％二氧化碳的混合气体，大约30分钟后容器中氧浓度接近于0，开始计时，缺氧培养3小时后取出培养瓶，用0.1％胰酶/0.1％EDTA消化法分别收集正常培养的和缺氧培养的LSEC。另外于收获LSEC的前一天，将正常培养的人肝细胞系IHH 接种24孔板，1×104个IHH/孔，共接种18孔。收获LSEC后，分别按照1×104个LSEC/孔的量加入到IHH培养孔中，正常培养和缺氧培养的LSEC各接种6 孔。将培养板置于正常培养条件(95％空气、5％二氧化碳的37℃培养箱中)共培养24小时后，每组各取3孔用来检测降低肝衰竭患者血浆胆红素的作用，每组另外3孔用于检测肝细胞合成尿素的能力。检测方法同实施例1所述，检测结果如表4所示。
表4：与缺氧处理的LSEC共培养对IHH功能的影响
实施例5：以共培养的肝细胞系和肝窦内皮细胞系制备生物人工肝
称取12g cytopore 2微载体(美国GE公司)，用无Ca2+和Mg2+的D-Hank’s 溶液水合膨胀过夜，洗涤数次后置于生物反应器(Eppendorf公司，BioFlo 320 型)中，在121℃高压蒸汽灭菌120min，灭菌后静置沉降微载体，无菌操作下弃上清，加入DMEM/F12基础培养基洗涤2次，微载体沉降后弃去上清，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，4℃浸泡过夜后使用。
按照实施例1-4的方法进行LSEC的缺氧培养，然后收获缺氧培养的LSEC 细胞和正常培养的IHH细胞，混合后接种于装有处理好的cytopore2微载体的生物反应器中进行培养。待微载体上细胞密度达到50-80％％后，收获微载体，按照发明专利ZL200910242907.8描述的方法制备生物人工肝。将生物反应器通过管路与透析治疗仪相连接，就制备成一种生物型人工肝支持***。

Claims (8)

1.一种共培养肝细胞系与肝窦内皮细胞系的方法，其特征在于：将肝窦内皮细胞系进行缺氧培养一定时间，然后收获肝窦内皮细胞系，与肝细胞系以一定比例进行共培养。
2.权利要求1所述的共培养方法，其中所述的缺氧培养是将肝窦内皮细胞系在氧浓度≤3％的环境中进行培养，实现氧浓度≤3％的环境的方法包括但不局限于使用三气培养箱、可商业获得的缺氧装置、或密闭容器中通入95％氮气和5％二氧化碳的混合气体。
3.权利要求1所述的共培养方法，其中所述缺氧时间是3-24小时，优选6-12小时。
4.权利要求1所述的共培养方法，其中所述共培养的肝细胞系和肝窦内皮细胞系可以是任何哺乳动物来源，其中肝细胞系可以是来源于正常肝细胞也可以是来源于肝脏肿瘤的细胞系。
5.权利要求1所述的共培养方法，其中所述共培养体系中肝细胞系和肝窦内皮细胞系的比例为1∶0.25～1∶4，优选肝细胞系和肝窦内皮细胞系的比例为1∶0.5～1∶2。
6.权利要求1所述的共培养方法，其中所述共培养的方式可以是平面培养也可以是三维立体培养；平面培养包括但不限于使用细胞培养瓶、培养皿、细胞工厂；三维立体培养包括但不局限于微载体培养、三维支架培养、凝胶培养。
7.权利要求1所述的共培养方法，其中所述共培养的起始方式可以是将两种细胞分别收获后按照所述比例混匀后接种，也可以是将肝窦内皮细胞系收获后制备成单细胞悬液，加入到生长有肝细胞系的培养体系中。
8.权利要求1-7所述的肝细胞系和肝窦内皮细胞系共培养方法的应用，其包括但不局限于利用共培养的肝细胞系和肝窦内皮细胞系进行药物筛选或制备生物人工肝。
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