CN108948206B - 一种抗egfr/pd-1双靶向抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

一种抗egfr/pd-1双靶向抗体、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种EGFR/PD‑1双靶向抗体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。所述EGFR/PD‑1双靶向抗体是以Cetuximab抗体和5C4抗体为亲本，采用knob‑into‑hole技术制备而成。所述双靶向抗体抗体具有比Cetuximab抗体和5C4抗体联合使用都更强的抗肿瘤效果，具有巨大应用前景。

Description

一种抗EGFR/PD-1双靶向抗体、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种EGFR/PD-1双靶向抗体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，其致死率居各种疾病致死率的前列。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。
抗体靶向性药物具有特异性好、副作用小、半衰周期长等优点，已广泛应用于肿瘤的临床治疗。目前，已经发现了一些能够作为肿瘤靶向治疗的潜在靶点：EGFR家族是一组跨膜蛋白,参与调节许多生物学关键过程,如细胞增殖、***、迁移和分化等。EGFR在多种肿瘤细胞上均高表达，并通过与配体结合,激活许多下游信号传导通路,进而参与肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭、迁移、凋亡及肿瘤血管生成等。因此，EGFR已经成为肿瘤靶向治疗的一个理想靶点。
程序性死亡分子1(programmed death 1,PD-1)是免疫球蛋白B7-CD28家族成员之一，可表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞和树突状细胞上,目前已经证实其与效应性T细胞应答活性密切相关。PD-L1是PD-1的主要配体，在包括NSCLC、黑色素瘤、肾细胞癌等许多恶性肿瘤中高表达。PD-1/PD-L1信号通路的激活可导致免疫抑制性肿瘤微环境形成,使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤,而阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境,增强抗肿瘤免疫效应。目前，靶向PD-1、PD-L1的抗体药物在多种肿瘤的临床试验中都取得较好的疗效。这些结果为后续肿瘤靶向治疗指明了方向。然而即使是目前疗效较好的肿瘤靶向抗体，其反应率和疗效依然有待提高，大部分患者在治疗过程中也逐渐产生耐受。众所周知，肿瘤在发生、发展过程中的异质性和复杂性决定了，仅仅依靠单一靶点的抗体靶向药物很难更加有效杀伤肿瘤细胞、激活抗肿瘤免疫，进而避免肿瘤复发。因此，多靶向抗体是目前抗体靶向药物研究的一个热点。
发明内容
本发明的一个目的是，提供一种EGFR/PD-1双靶向抗体及其相应的药物制剂，所述EGFR/PD-1双靶向抗体是由4条肽链构成的全抗体,其既可以靶向、杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞，又能够阻断PD-1/PD-L1免疫抑制信号。
本发明的另一个目的是，提供一种EGFR/PD-1双靶向抗体的制备方法。
根据本发明的一个方面，提供一种以EGFR的抗体Cetuximab和PD-1的抗体5C4为亲本，运用基因工程技术获得双靶向抗体，所述双靶向抗体的结构如图1所示。
所述双靶向抗体包括4条肽链，分别为如SEQ ID NO:20所示的5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3、如SEQ ID NO:22所示的5C4LV-CH1、如SEQ ID NO:18所示的Cetuximab重链knob突变体、如SEQ ID NO:26所示的Cetuximab轻链。
进一步地，上述双靶向抗体可应用于抗肿瘤药物的制备；
上述双靶向抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双靶向抗体氨基酸核心序列的结构完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。所述制剂可以是各种形态，通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下至少稳定保存一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。
对于本发明公开的双功能融合蛋白(双靶向抗体)的水针或冻干制剂，其中药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能融合蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到在稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
使用上述双靶向抗体及其药物制剂在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重、疾病特性和严重性、以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或***的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
上述双靶向抗体及其药物制剂还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些用于联合给药的抗肿瘤药包括：1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT－207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤(6－MP)和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗***：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)；Bevacizumab(Avastin)；Yervoy(Ipilimumab)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。
根据本发明的另一个方面，具体建立了上述EGFR/PD-1双靶向抗体的制备方法。
在本发明的双靶向抗体制备方法中，可以使用任何合适的载体，可选自pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
真核/原核宿主细胞均可用于本发明的双功能融合蛋白(EGFR/PD-1双靶向抗体)的表达，真核宿主细胞优选哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***，优选COS、CHO、NS0、sf9及sf21等细胞均；原核宿主细胞优选为DH5a、BL21(DE3)、TG1之一。
可在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白，分离或纯化所述的双功能融合蛋白。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双功能融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的双功能融合蛋白。
利用上述方法，可以将双功能融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
所述制备方法具体包括以下步骤：
1)分别克隆Cetuximab抗体和5C4抗体可变区基因；
2)将5C4抗体重链可变区基因与抗体轻链恒定区进行融合，构建5C4HV-CL融合片段；
3)将5C4抗体轻链可变区基因与抗体重链恒定区CH1进行融合，构建5C4LV-CH1融合片段；
4)分别对抗体Fc区域构建knob突变体：T366W,S354C；hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；
5)分别将Cetuximab重链可变区与knob突变体融合，5C4HV-CL与hole突变体融合，装入表达载体；
6)将上述表达载体与Cetuximab抗体轻链进行共转表达，通过分离纯化得到双靶向抗体；其中所述表达载体为pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司产品)，用脂质体法转染或电转CHO-K1细胞(ATCC)，并用含600μg/ml G418的选择培养基筛选稳定表达双功能融合蛋白的细胞克隆，利用Protein A层析柱，通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化得到双靶向抗体。
附图说明
图1.Cetu-5C4CrossMab双靶向抗体及亲本抗体结构示意图；
图2.Cetuximab重链knob突变体结构图；
图3.5C4重链hole突变体5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3结构图；
图4.Cetu-5C4CrossMab双靶向抗体结合活性；
图5.Cetu-5C4CrossMab双靶向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行进一步阐述，但不对本发明权利要求构成限制。
本发明所使用的试剂均为市售，Cetuximab抗体购买自默克公司，5C4抗体购买自百时美施贵宝公司。
实施例1.【Cetuximab和5C4抗体可变区基因的克隆】
参照专利(PCT/US96/09847和PCT/JP2006/309606),分别合成Cetuximab和5C4的重链可变区基因和轻链可变区基因。其中抗体信号肽氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS。经测序获得正确的克隆片段备用。SEQ ID NO：2显示Cetuximab重链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3为5C4重链可变区的核苷酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6显示5C4轻链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：24为Cetuximab轻链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：23。
实施例2.【人源抗体CL、重链CH1、Fc区的克隆】
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Life公司产品)提取总RNA，根据文献(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functionalsegments.Hieter PA,Max EE,Seidman JG,Maizel JV Jr,Leder P.Cell.1980Nov；22(1Pt1):197-207.)和文献(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin Cgamma1gene.Ellison JW,Berson BJ,Hood LE.Nucleic Acids Res.1982Jul 10；10(13):4071-9.)采用RT-PCR反应扩增抗体轻链恒定区，重链恒定区CH1以及Fc区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQID NO：8显示CL氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10显示Fc氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：12显示CH1氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQID NO：11。
实施例3.【抗体Fc区knob突变体的构建】
取实施例2中获得的抗体Fc区，采用overlap PCR的方法引入突变点：T366W,S354C和点突变N297Q。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：14显示Fc-knob氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ IDNO：13。
实施例4.【抗体Fc区hole突变体的构建】
取实施例3中获得的抗体Fc区，采用PCR的方法将Fc区的部分hinge及CH2、CH3区克隆到pGEM-T载体，测序验证后。采用overlap PCR的方法引入突变点：T366S，L368A，Y407V,Y394C和点突变N297Q。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：16显示Fc-hole氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQID NO：15。
实施例5.【Cetuximab重链突变体的构建】
以实施例1获得的Cetuximab重链可变区和实施例3获得的Fc区knob突变体为模板，采用overlap PCR的方法将Cetuximab重链可变区与Fc区knob突变体进行融合，构建Cetuximab重链knob突变体(见附图2)。SEQ ID NO：18显示Cetuximab重链knob突变体氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：17。
实施例6.【5C4重链突变体的构建】
以实施例1获得的5C4重链可变区、实施例2获得的CL以及实施例4获得的Fc区hole突变体为模板，采用overlap PCR的方法将5C4重链可变区与CL及Fc区hole突变体进行片段融合，然后装入表达载体，构建5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3(见附图3)。SEQIDNO：20显示5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：19。
实施例7.【5C4轻链突变体的构建】
以实施例1获得的5C4轻链可变区，实施例2获得的CH1为模板，采用overlap PCR的方法将5C4轻链可变区与CH1进行片段融合，然后装入表达载体，构建5C4LV-CH1。SEQ IDNO：22显示5C4LV-CH1的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：21。
实施例8.【Cetuximab轻链的构建】
以实施例1获得的Cetuximab轻链可变区，实施例2获得的CL为模板，采用overlapPCR的方法将Cetuximab轻链可变区与CL进行片段融合，然后装入表达载体，构建Cetuximab轻链。SEQ ID NO：26显示Cetuximab轻链的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：25。
实施例9.【Cetu-5C4CrossMab的表达与纯化】
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg Cetuximab重链knob突变体(SEQ ID NO：17)，5C4重链hole突变体(SEQ ID NO：19)以及4μg Cetuximab轻链(SEQ ID NO：25)及5C4轻链突变体(SEQ ID NO:21)和20μl Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Humanmyeloma IgG1,κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB于37℃作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化双靶向抗体。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。
实施例10.【双靶向抗体结合活性检测】
参照"Development of a Two-part Strategy to Identify a TherapeuticHuman Bispecific Antibody That Inhibits IgE Receptor Signaling".J BiolChem.2010Jul 2；285(27):20850–20859.将EGFR-ECD包被ELISA板上并封闭后，与纯化后不同浓度的抗体与包被在ELISA板上的EGFR-ECD蛋白37度孵育1小时。PBST洗板三次后，将生物素标记的PD-1-ECD加入进行37度孵育1小时。PBST洗板三次后，将亲和素标记的HRP加入进行37度孵育1小时。洗板后，进行DAB显色()。如图4所示，只有双靶向抗体Cetu-5C4CrossMab能够同时靶向两个不同的抗原，而Cetuximab及5C4抗体由于不能够同时结合两种不同抗原，因此未表现出结合活性。
实施例11.【Cetu-5C4CrossMab双靶向抗体的抗肿瘤活性检测】
选取雌性C57BL小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，皮下接种稳定表达人EGFR蛋白的3LL小鼠肺癌细胞(3LL-huEGFR)。其中3LL小鼠肺癌细胞系购自ATCC(CRL-1642),将装载人EGFR基因的pcDNA3.1，用lipofectamin2000(购自Thermo Fisher公司)参照该试剂转染使用说明书，转染3LL细胞。后续采用G418筛选出能稳定表达人EGFR蛋白的3LL细胞。
当肿瘤体积达到100mm3后将荷瘤小鼠采用随机分组法进行分组后，分别接种PBS、Cetu-5C4CrossMab、Cetuximab、5C4或者Cetuximab+5C4抗体，每周接种三次，连续接种四周。通过测量肿瘤体积大小变化评价双靶向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性。结果如图5所示，Cetu-5C4CrossMab双靶向抗体表现出比单药亲本抗体Cetuximab、5C4以及Cetuximab与5C4联合用药更强的小鼠体内杀伤肿瘤的能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 赵, 磊
<120> 一种抗EGFR/PD-1双靶向抗体、其制备方法及用途
<130> BJ1929-17P121569
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acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300
tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
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ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agttacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag agtagcaact ggcctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5C4轻链可变区的氨基酸序列
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CL核苷酸序列
<400> 7
gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120
gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180
gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240
aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300
aacagaggag aatgc 315
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CL氨基酸序列
<400> 8
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1 5 10 15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65 70 75 80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 990
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Fc核苷酸序列
<400> 9
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 10
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc氨基酸序列
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 11
<211> 309
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH1核苷酸序列
<400> 11
cgtacgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgt 309
<210> 12
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH1氨基酸序列
<400> 12
Arg Thr Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 13
<211> 990
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc-knob核苷酸序列
<400> 13
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagccagt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtaccag 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 14
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc-knob氨基酸序列
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 15
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc-hole核苷酸序列
<400> 15
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtcctg cgcggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 16
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc-hole氨基酸序列
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 17
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cetuximab重链knob突变体核苷酸序列
<400> 17
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180
acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300
tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 360
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agccagtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtaccagagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 18
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cetuximab重链knob突变体氨基酸序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 19
<211> 1335
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3核苷酸序列
<400> 19
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
gactgtaaag cgtctggaat caccttcagt aactctggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa aagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gacaaacgac 300
gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct accccagaga agccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480
ggaaacagcc aggaaagcgt gacagagcag gattccaagg attccacata cagcctgagc 540
agcacactga cactgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600
acacaccagg gactgtcctc ccctgtgaca aagagcttca acagaggaga atgcgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctgt cctgcgcggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 20
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3氨基酸序列
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 21
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5C4LV-CH1的核苷酸序列
<400> 21
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agttacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag agtagcaact ggcctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgtacgacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 360
tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 420
cccgaacctg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 480
ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 540
agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 600
gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 630
<210> 22
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5C4LV-CH1的氨基酸序列
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys
210
<210> 23
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cetuximab轻链可变区的核苷酸序列
<400> 23
gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cetuximab轻链可变区的氨基酸序列
<400> 24
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 25
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cetuximab的轻链核苷酸序列
<400> 25
gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 420
cccagagaag ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg aaacagccag 480
gaaagcgtga cagagcagga ttccaaggat tccacataca gcctgagcag cacactgaca 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac acaccaggga 600
ctgtcctccc ctgtgacaaa gagcttcaac agaggagaat gc 642
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Cetuximab的轻链氨基酸序列
<400> 26
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (7)

1.一种EGFR/PD-1双靶向抗体，其特征在于所述抗体由下述氨基酸序列的四条肽链组成，分别为：
如SEQ ID NO:20所示的5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3、如SEQ ID NO:22所示的5C4LV-CH1、如SEQ ID NO:18所示的Cetuximab重链knob突变体和如SEQ ID NO:26所示的Cetuximab轻链。
2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的抗体，由如下述核苷酸序列所示的多核苷酸组成：编码5C4HV-CL-Hinge-CH2-CH3的如SEQ ID NO：19所示的多核苷酸，编码5C4LV-CH1的如SEQ ID NO：21所示的多核苷酸，编码Cetuximab重链knob突变体的如SEQ IDNO：17所示的多核苷酸和编码Cetuximab轻链的如SEQ ID NO：25所示的多核苷酸。
3.一种表达载体，其特征在于含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。
5.一种权利要求1所述的EGFR/PD-1双靶向抗体的制备方法，包括：
1)分别克隆如SEQ ID NO.1所示的EGFR抗体Cetuximab重链可变区和如SEQ ID NO.23所示的EGFR抗体Cetuximab轻链可变区，以及如SEQ ID NO.3所示的PD-1抗体5C4的重链可变区和如SEQ ID NO.5所示的PD-1抗体5C4的轻链可变区；
2)在抗体Fc区域分别构建knob突变体,以及hole突变体；
3)将PD-1抗体5C4轻链可变区与抗体重链CH1区融合构建5C4LV-CH1融合片段；
4)将PD-1抗体5C4重链可变区与抗体轻链恒定区融合构建5C4HV-CL融合片段；
5)将Cetuximab重链可变区和5C4HV-CL中的一个与knob突变体融合，将另一个与hole突变体融合，装入表达载体；
6)将构建好的三个表达载体与装有Cetuximab轻链基因的表达载体共同转染进行表达，分离纯化；
所述抗体Fc区域knob突变体的突变方式为，第366位的Thr突变为Trp，第354位的Ser突变为Cys和点突变N297Q；所述抗体Fc区域hole突变体的突变方式为，第366位的Thr突变为Ser，第368位的Leu突变为Ala，第407位的Tyr突变为Val，第394位的Tyr突变为Cys和点突变N297Q。
6.一种药物组合物，含有权利要求1所述的EGFR/PD-1双靶向抗体。
7.权利要求1所述双靶向抗体在制备治疗肺癌药物中的用途。
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