CN108939061A - 一种多组分b群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法 - Google Patents

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郭通
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冀颖
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Abstract

本发明提供一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法，本发明所述的多组分B群脑膜炎球菌疫苗含有：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)，B群脑膜炎球菌A亚家族和B亚家族人H因子结合蛋白(factor H binding protein，fHbp)的重组脂蛋白(fHbp‑A、fHbp‑B)，B群脑膜炎球菌奈瑟菌黏附素A(neisserial adhesin A，NadA)重组蛋白，以及B群脑膜炎球菌肝素结合抗原(neisseria heparin binding antigen，NHBA)重组蛋白。本发明的疫苗用于预防由B群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病，提供对B群脑膜炎球菌广泛有效的保护作用。

Description

一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法，属于生物制品领域。所述多组分B群脑膜炎球菌疫苗是由B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白、以及重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例混合配制而成的疫苗制剂。
背景技术
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)，是由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria Meningitides,NM，通常称之为脑膜炎球菌)感染引起的以脑脊髓膜炎和菌血症为主的呼吸道传染病。目前以婴幼儿发病为主，呈地方性流行、暴发、散发形式，NM引起的侵袭性疾病有脑膜炎、菌血症和肺炎等，病死率约为12％～20％，幸存者中有11％～19％留有后遗症。
最近，运用DNA序列分析荚膜多糖合成中的特定基因，已经代替传统的血清群用于定义分离株，脑膜炎奈瑟菌根据荚膜多糖的结构特征分为12个荚膜群。其中绝大多数的疾病由荚膜群A、B、C、W、X或Y引起。目前欧洲的流行性脑脊髓膜病例中有90％为荚膜B群所导致，而在美国，三分之一以上的的病例由荚膜B群所导致，在国内，根据流行病学调查与研究，B群脑膜炎球菌引起的病例，所占的比例逐年提高。
然而，由于B群脑膜炎球菌荚膜多糖免疫原性弱，加之包含的表位和人体组织的唾液酰基蛋白存在交叉反应，而不能像A、C、W、Y等荚膜群作为疫苗成份。B群脑膜炎球菌疫苗研发主要集中在外膜囊泡即OMV和外膜蛋白上。外膜蛋白主要有效抗原为fHbp、NadA、NABH等。
然而，单一重组蛋白成分的疫苗难以取得较好的免疫效果，多组分疫苗成为发展趋势，为B群脑膜炎球菌疫苗的研究带来新的方向。本发明的B群脑膜炎球菌多组分疫苗包含fHbp，脑膜炎奈瑟球菌外膜囊泡(OMV)，以及NadA和NHBA。
B群脑膜炎球菌外膜囊泡(Out Membrane Vesicle，OMV)，为整个细菌外膜上的相关蛋白和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)等囊泡成分，具有很好的免疫原性，为目前研制与应用较为广泛的疫苗。LPS是构成革兰氏阴性菌细菌外表层的一种生物大分子，可介导固有免疫反应，高剂量时会引起发热反应、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等疾病，低剂量时，能够引起肿瘤坏死因子TNF-α及白介素IL-6等细胞因子生成，激发Toll-样受体TLR4(少量R-型LPS可拮抗TLR4，如五日热巴尔通体Bartonella quintana的脂多糖)，帮助宿主抵御感染，因此可作为疫苗及佐剂的有效成分。
LPS主要由三部分组成：O-抗原，核心多糖和类脂A。类脂A是脂多糖中最保守的部分，同一菌种的类脂A结构基本一致，它是一种磷酸糖脂(phosphoglycolipid)，其骨架结构是被磷酸基团修饰、脂肪酸链取代的β-1,6连接的D-氨基葡萄糖(GlcN)二糖。LPS的内毒素活性完全由类脂A部分决定，类脂A的酰基链数量、分布及长度等脂肪酰谱对其生物活性有显著的影响作用。类脂A的合成途径发生在细胞质和内膜的内表面，其合成反应共计10步，可溶性蛋白lpxA是催化第一步反应的酶，作用结果是在UDP-氨基葡萄糖分子上添加脂肪酸链。B群脑膜炎球菌类脂A的3,3'位为3-OH十二月桂酰基，为12碳脂肪酸链，将B群脑膜炎球菌类脂A基因lpxA以大肠杆菌类脂A同源基因lpxA替换后，其3,3'位合成为3-OH豆蔻酰基，为14碳脂肪酸链，能够显著降低LPS数量，从而降低B群脑膜炎球菌突变株的内毒素活性。
fHbp蛋白为人H因子结合蛋白，是B群脑膜炎球菌外膜的脂蛋白成份。fHbp分为两个亚家族(Subfamily)，A亚家族(与变种分类法V2、V3相同)和B亚家族(与变种分类法V1相同)，基于聚类比对分析，fHbp蛋白***发生树表明，B亚家族约占分离株的70％，A亚家族约占30％。fHbp的氨基酸序列较保守，同一亚家族内91.6％～100％氨基酸相同，不同亚家族最低为62.8％。重组fHbp免疫产生的抗体可引起对同一类亚家族的补体介导的杀菌作用，并能诱导对感染乳鼠模型的被动保护，但对不同类亚家族的菌株不具有杀菌力。
fHbp重组蛋白具有良好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的杀菌抗体，且对顺序变异不敏感，其结构和保护性抗原表位可进行组合，因此完全具备作为候选疫苗免疫原性蛋白质的特征。P4为流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae)外膜脂蛋白e蛋白(亦称为P4蛋白)的信号肽，在重组表达fHbp过程中，将P4信号肽添加于蛋白N端，与B群脑膜炎球菌fHbp天然(Native)信号肽相比，能提高蛋白在大肠杆菌中的表达量，而更重要的是，P4信号肽在蛋白翻译起始后信号肽切割过程中，对与其相连的fHbp蛋白N端首个氨基酸进行脂酰化修饰，从而高效表达出具有天然活性的脂蛋白。
奈瑟菌黏附素A(Neisserial Adhesin A，NadA)，即GNA1994，在B群脑膜炎球菌中具有较高的保守性，在实验动物免疫评价中能产生保护性，为B群脑膜炎球菌疫苗的有效抗原成分。
奈瑟菌肝素结合抗原(Neisserial Heparin Binding Antigen，NHBA)，即GNA2132，在B群脑膜炎球菌中具有较低的保守性，但其氨基和羧基末端高度保守。重组NHBA蛋白能诱导小鼠产生抗体，且能协同OMV产生更强杀菌抗体应答。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗，能有效预防B群脑膜炎球菌的流行，对B群脑膜炎球菌提供广泛的保护作用。
本发明所述的疫苗，包括以下成分：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白、重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白。
以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV5-40μg/剂，B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白分别为20-60μg/剂，重组NadA蛋白20-100μg/剂，重组NHBA蛋白30-90μg/剂。
优选的，本发明所述的疫苗，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV为20-30μg/剂，重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白含量分别为25-35μg/剂；重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白的含量分别为35-55μg/剂。
进一步优选的，本发明所述的疫苗，以蛋白含量计，B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为25μg/剂、30μg/剂、30μg/剂、40μg/剂、40μg/剂。
本发明所述的疫苗的pH为5.8-7.2；铝含量为0.4-1.2mg/ml。
其中，该疫苗中还包括任选的生物制品用冻干保护剂或佐剂。
本发明的另一目的在于提供多组分B群脑膜炎球菌疫苗的制备方法。
本发明所述的多组分B群脑膜炎球菌疫苗，其制备方法如下：
提取纯化各个疫苗组分后，通过不同剂量矩阵配比分析，确定各疫苗组分配制比例，使各组分在免疫机理上有协同促进作用。
本发明所述疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白，重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例稀释配制后，采用冻干或吸附的方式配制成多组分B群脑膜炎球菌疫苗。
具体的，本发明的制备方法，包括以下步骤：
将相应剂量的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV，重组脂蛋白fHbp-A、fHbp-B以及重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例混合配制后，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成分制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或西林瓶分装。
或者将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV，重组脂蛋白fHbp-A、fHbp-B以及重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白，分别采用磷酸铝、氢氧化铝等佐剂吸附后，按比例混合配制制备成液体疫苗，以预填充注射器或西林瓶分装。
本发明所述的多组分疫苗，为供肌肉注射的冻干制剂或液体制剂。
按以上任一种疫苗配制方式，每剂配制成含有B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV为20-30μg，NadA为35-55μg，NHBA为35-55μg，fHbp-A和fHbp-B各25-35μg的疫苗制剂。
本发明所述的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV，为将B群脑膜炎球菌基因组LPS类脂A lpxA基因以大肠杆菌DH5α菌株的lpxA同源基因替换的基因改造突变株。
本发明所述的重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白，为采用大肠杆菌重组表达的B群脑膜炎球菌fHbp蛋白，其N端上游信号肽序列以流感嗜血杆菌的P4信号肽替换Native信号肽，增加蛋白表达，并在重组蛋白翻译过程中将fHbp修饰为天然脂蛋白。
本发明所述的重组NadA蛋白，为采用大肠杆菌重组表达的B群脑膜炎球菌NadA蛋白。
本发明所述的重组NHBA蛋白，为采用大肠杆菌重组表达的B群脑膜炎球菌NHBA蛋白。
具体的，本发明的蛋白的制备方法如下：
本发明的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV可通过以下方法制备获得：
将B群脑膜炎球菌LPS类脂A lpxA基因以大肠杆菌DH5α的lpxA基因替换，得到B群脑膜炎球菌低内毒素突变株，将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株进行发酵培养，发酵液离心并收集菌体，菌体采用低温超高压均质破碎，离心收集上清，再采用去污剂抽提、离子交换、疏水层析等纯化的方法得到纯化的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV。
优选的，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV的制备方法如下：
(1)B群脑膜炎球菌低内毒素突变株的构建：
将与B群脑膜炎球菌LPS类脂A同源的大肠杆菌、铜绿假单胞菌或其它菌属lpxA、lpxL1、lpxL2等基因，以及抗性基因(卡那霉素，氨苄青霉素，四环素，红霉素等)筛选标签连接于载体pUC19、pTZ19R、pUC57、pQE30或PBR322等，将质粒线性化后转化B群脑膜炎球菌，通过同源置换替换B群脑膜炎球菌菌株同源基因lpxA，经过筛选获得正确表达非B群脑膜炎球菌同源lpxA基因的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株。
(2)B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV的提取：
将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株于GC平板划线复苏，35-37℃，5-8％CO2培养过夜，刮取菌苔接种至改良的Frantz GC液体培养基，后逐渐扩大培养至发酵罐培养，将细菌培养至生长稳定期，加入终浓度0.01-0.1ug/ml的脱氧胆酸钠溶液杀菌5-20分钟。碟片式或大容量离心机离心收集菌体，将菌体以20-60mM PB，1mM Na2·EDTA pH7.2溶液5-10倍悬浮后，以1000-1400Pa 4℃高压均质破碎2-3次，10000g离心，收集上清。以0.45um中空纤维柱澄清过滤收集滤过液，10KD超滤膜包超滤浓缩至蛋白含量在2-4mg/ml，0.5-2％(w/v)TritonX-100缓冲液抽提，抽提液透析后采用GE QFF阴离子交换收集流穿液，超滤浓缩后，采用MILLIPORE TAME填料层析，收集流穿峰。将流穿峰以10KD超滤膜包超滤浓缩至2-4mg/ml，再经分子筛层析，经超滤浓缩后即得OMV原液。
本发明的B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白可通过以下方法制备获得：
重组fHbp-A脂蛋白的制备方法：
根据fHbp-A、流感嗜血杆菌信号肽P4的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列；流感嗜血杆菌信号肽P4序列直接连接于fHbp-A N末端。将目的基因片段(p4)fhbp-A和质粒pET43.1a以DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到fHbp-A/BL21(DE3)菌株，将菌株培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组fHbp-A脂蛋白。
重组fHbp-B脂蛋白的制备方法：
根据fHbp-B、流感嗜血杆菌信号肽P4的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列；流感嗜血杆菌信号肽P4序列直接连接于fHbp-B N末端。将目的基因片段(p4)fhbp-B和质粒pET43.1a以DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到fHbp-B/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组fHbp-B脂蛋白。
优选的，重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白的制备方法如下：
fHbp-A、fHbp-B工程菌株的构建：
fHbp蛋白分为A亚家族和B亚家族，分别筛选fHbp-A、fHbp-B特异性亚家族氨基酸序列，为增加目的蛋白表达量并对重组蛋白进行脂酰化修饰以增加免疫原性，于fHbp上游添加流感嗜血杆菌P4外膜蛋白信号肽序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性分别设计并合成DNA全长序列。质粒选择为pBR322、pET28a、pET32a或pET43.1a等，抗性基因可以采用四环素、卡那霉素或氨苄青霉素等，采用限制性内切酶HindIII、BamHI、NdeI、XhoI等处理基因合成产物和质粒，并以DNA重组酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证DNA序列完全正确后，表达宿主选择为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌C43(DE3)等，在含抗生素的培养基上培养，挑取单克隆培养后，经电泳或质谱或氨基酸序列测定分析等方法鉴定后，确定为fHbp脂蛋白表达。
工程菌株的发酵培养与诱导表达：
取工程菌株划线接种含抗生素LB琼脂培养基，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至含抗生素LB液体培养基中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐以LB+M9培养基发酵培养，控制溶氧在20-50％，待OD600达到20-24时，采用终浓度0.05-0.1mM/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，碟片式或大容量离心机离心收集菌体。
重组fHbp脂蛋白的提取纯化：
将菌体采用高压均质破碎或渗透冲击等方法破碎，离心收集上清液，上清以20mMTris，1mM EDTA，0.5％TritonX-100pH7.2经10KD超滤膜包超滤去除小分子物质，并浓缩至蛋白浓度为2-4mg/ml，再采用阴离子交换或疏水层析及分子筛等进行精细纯化，去除脂多糖、核酸及其他大肠杆菌杂蛋白，得到纯度大于95％的重组脂蛋白原液。
重组脂蛋白原液细菌内毒素不高于20EU/ml，本发明应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。
本发明的重组NadA蛋白可通过以下方法制备获得：
根据B群脑膜炎球菌NadA蛋白的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将目的基因片段和质粒pET43.1a以T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到NadA/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组蛋白。
优选的，重组NadA蛋白的制备方法如下：
重组NadA蛋白工程菌株的构建：
筛选NadA蛋白特异氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性设计并合成基因，质粒选择为pBR322、pET28a、pET32a或pET43.1a等，抗性基因可以采用四环素、卡那霉素或氨苄青霉素等，采用限制性内切酶Hind III、Bam HI、NdeI、XhoI等处理基因合成产物和质粒，并以DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证DNA序列完全正确后，表达宿主选择为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌C43(DE3)等，在含抗生素的培养基上培养，挑取单克隆培养后，经电泳或质谱或氨基酸序列测定等方法鉴定后，确定为NadA蛋白表达。
工程菌的发酵培养与诱导表达：
取工程菌株工作种子库菌种，划线接种含抗生素LB琼脂培养基，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至含抗生素LB液体培养基中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到14-20时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，离心收集菌体。
重组蛋白的提取纯化：
将发酵培养收获的菌体采用超声破碎、高压均质破碎或渗透冲击等方法将细菌菌体破碎，离心收集上清液，经过硫酸铵分级沉淀，酒精分步沉淀提取蛋白，再采用阴离子交换或疏水层析及分子筛等进行精细纯化，去除脂多糖、核酸及其他大肠杆菌杂蛋白，得到纯度大于95％的重组NadA蛋白原液。
重组NadA蛋白原液细菌内毒素不高于20EU/ml，本研究应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。
本发明的重组NHBA蛋白可通过以下方法制备获得：
根据B群脑膜炎球菌NHBA蛋白的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将目的基因片段和质粒pET43.1a以T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到NHBA/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组蛋白。
优选的，重组NHBA蛋白的制备方法如下：
筛选NHBA蛋白特异氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性设计并合成基因，质粒选择为pBR322、pET28a、pET32a或pET43.1a等，抗性基因可以采用四环素、卡那霉素或氨苄青霉素等，采用限制性内切酶Hind III、Bam HI、NdeI、XhoI等处理基因合成产物和质粒，并以DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证DNA序列完全正确后，表达宿主选择为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌C43(DE3)等，在含抗生素的培养基上培养，挑取单克隆培养后，经电泳或质谱或氨基酸序列测定等方法鉴定后，确定为NHBA蛋白表达
工程菌的发酵培养与诱导表达：
取工程菌株工作种子库菌种，划线接种含抗生素的LB琼脂培养基，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至含抗生素的LB液体培养基中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到18-22时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，离心收集菌体。
重组蛋白的提取纯化：
将发酵培养收获的菌体采用超声破碎、高压均质破碎或渗透冲击等方法将细菌菌体破碎，离心收集上清液，经过硫酸铵分级沉淀，酒精分步沉淀提取蛋白，再采用阴离子交换或疏水层析及分子筛等进行精细纯化，去除脂多糖、核酸及其他大肠杆菌杂蛋白，得到纯度大于95％的重组NHBA蛋白原液。
重组NHBA蛋白原液细菌内毒素不高于20EU/ml，本研究应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。
本发明的另一个目的在于提供多组分疫苗在制备预防B群脑膜炎球菌的流行的药物中的应用。
本发明的多组分B群脑膜炎球菌疫苗应用于2月龄至25岁人群的免疫，用于预防由B群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病，提供对B群脑膜炎球菌广泛有效的保护作用。
本发明的优点是，针对B群脑膜炎球菌荚膜多糖成分不适合用作疫苗，提取纯化B群脑膜炎球菌低内毒素突变株外膜OMV，并利用反向遗传学的技术，表达B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHbp)重组抗原，该蛋白抗原含有A亚家族和B亚家族两个亚家族的重组脂蛋白，完全覆盖了B群脑膜炎球菌所有菌株，对B群脑膜炎球菌预防感染起到有效的预防作用；同时添加奈瑟菌黏附素A(NadA)重组抗原，以及奈瑟菌肝素结合抗原(NHBA)重组抗原，制备成多组分B群脑膜炎球菌疫苗，使得本疫苗能够充分并广泛的预防由B群脑膜炎球菌感染引起的疾病。
附图说明
图1：构建B群脑膜炎球菌低内毒素突变株打靶质粒示意图
图2：pET43.1a质粒经NdeI和XhoI酶切后的DNA电泳图。
图3：PCR扩增(p4)fhbp-A基因片段DNA电泳图。
图4：PCR扩增(p4)fhbp-B基因片段DNA电泳图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例1：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株的构建：
本实施例以B群脑膜炎球菌流行菌株ST4821克隆群341215株为例。
1.1根据B群脑膜炎球菌lpxA基因序列，设计合成引物如下：
5'TGATTACGCCAAGCTTCAAAAACTCATCCCCCA 3'
5'TATCAATCACGTTTTTCCTTTCCTGTCG 3'
以该引物PCR扩增B群脑膜炎球菌341215菌株lpxA基因上游500bp序列；
1.2根据大肠杆菌DH5α菌株lpxA基因序列，设计合成引物如下：
5'AAGGAAAAACGTGATTGATAAATCCGCC 3'
5'TATGGCTCATTTAACGAATCAGACCGCG 3'
以该引物PCR扩增大肠杆菌DH5α菌株lpxA基因；
1.3根据pET28a质粒上卡那霉素抗性基因序列，设计合成引物如下：
5'GATTCGTTAAATGAGCCATATTCAACGG 3'
5'AAGGGTACGGTTAGAAAAACTCATCGAG 3'
以该引物PCR扩增pET28a质粒上卡那霉素抗性基因；
1.4根据B群脑膜炎球菌lpxA基因序列，设计合成引物如下：
5'GTTTTTCTAACCGTACCCTTTTGATGCC 3'
5'AAACGACGGCCAGTGAATTCCTTTGTCTGTTTT 3'
以该引物PCR扩增B群脑膜炎球菌341215菌株lpxA基因下游500bp序列；
1.5以限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ处理pUC19质粒，回收酶切大片段；
1.6将所回收的酶切大片段，以及纯化后的各PCR产物按比例混匀，用DNA连接酶连接各片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，连接后的打靶质粒示意图如图1所示；采用卡那霉素抗性筛选转化单克隆。
1.7提取打靶质粒，用限制性内切酶NdeⅠ处理提取质粒，进行纯化回收。
1.8线性化打靶质粒并转化B群脑膜炎球菌341215菌株，以卡那霉素抗性筛选转化单克隆，挑取单克隆扩增培养并保存。
1.9筛选的阳性克隆菌株的鉴定：
1.9.1菌株的抗性检测：取低内毒素突变株与341215菌株于含有卡那霉素抗生素的GC平板37℃5％CO2培养过夜，低内毒素突变株生长，而341215株不生长。
1.9.2 lpxA基因PCR检测，PCR扩增lpxA基因片断，经DNA琼脂糖凝胶电泳检测为约800bp大片断，序列送生工(上海)生物工程有限公司检测，序列完全相符。
1.9.3低内毒素突变株LPS结构中脂肪酸的GC-MS分析：将培养的B群脑膜炎球菌菌体及低内毒素突变株菌体低温超高压均质破碎，10000g离心去除菌体碎片，再150000g离心收集OMV，将OMV于60℃真空干燥3小时。精密稳定干燥后的2种OMV组分和脂肪酸对照品各50mg，于螺口试管中，加入14％三氟化硼-甲醇溶液2ml，充氮气密封，以超声振荡5-15min后，于70℃水浴30min，再加入正己烷2ml，涡旋振荡5min后，静置取上清，并以1ml正己烷洗涤1次后，合并上清液，经0.22um过滤后，进行GC-MS分析。结果显示，经与B群脑膜炎球菌及脂肪酸甲酯(C4-C24)混合对照品对比分析，低内毒素突变株C14甲酯峰含量明显高于C12甲酯峰，而B群脑膜炎球菌菌株结果中为C12甲酯峰含量高。
实施例2：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV的提取
2.1 B群脑膜炎球菌低内毒素突变株的培养
将-70℃冻存的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株涂布接种于10％羊血普通琼脂培养基，37℃，5％CO2过夜培养。刮取菌苔接种到营养肉汤培养基内，37℃，180rpm培养4-6小时，经30L，100L，500L发酵罐逐级放大培养至OD值约6-12，加入终浓度0.01-0.1ug/ml的脱氧胆酸钠溶液杀菌5-20分钟。
2.2 B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV的提取
取发酵菌液以碟片式离心机离心收集菌体，将菌体以50mM PB，1mM Na2·EDTApH7.2溶液5-10倍悬浮后，以1000-1200bar 4℃高压均质破碎2-3次，10000g离心，收集上清。以0.45um中空纤维柱澄清过滤收集滤过液，10KD超滤膜包超滤浓缩至蛋白含量在2-4mg/ml，50mM PB，1mM Na2·EDTA ，1％(w/v)TritonX-100抽提，将抽提液以10KD超滤膜包透析后，采用GE QFF阴离子交换收集流穿液，超滤浓缩后，采用MILLIPORE TAME层析去除小分子蛋白，收集流穿峰。将流穿峰采用10KD超滤膜包超滤浓缩至2-4mg/ml，再经Superose6Increase分子筛层填料层析后，收集V0处蛋白峰，该收集液经10KD膜包超滤浓缩至蛋白浓度为1.5-2.5mg/ml，即得OMV原液。
实施例3：fHbp-A重组脂蛋白的制备
3.1 fHbp-A/BL21(DE3)工程菌的构建
根据fHbp–A、流感嗜血杆菌P4外膜蛋白信号肽的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，P4信号肽直接位于fHbp-A N末端，于质粒pUC57上设计并合成全长DNA序列；
以限制性内切酶NdeI和XhoI处理pUC57合成质粒，得到(p4)fhbp-A基因大片断。
以限制性内切酶NdeI和XhoI处理pET43.1a质粒，得到酶切处理后的质粒pET43.1a，如图2。
将处理后的目的基因片段(P4)fHbp-A和质粒pET43.1a以重组酶连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃过夜培养。挑取阳性克隆接种LB(Amp)液体培养基，37℃振荡培养过夜。
根据p4、fhbp-A基因序列设计如下引物
用引物p4-F，fhbp-A-R对挑取克隆进行PCR鉴定，得到约850bp左右目的片段，如图3所示。将目的基因测序，结果显示质粒pET43.1a的外源基因片段DNA序列(p4)fhbp-A完全正确。将质粒转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含100μg/ml氨苄青霉素)，得到fHbp-A/BL21(DE3)表达菌株，挑取单个克隆，37℃振荡培养至细菌密度至OD600约0.5～1.0时，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养4-6小时，经SDS-PAGE鉴定，fHbp-A/BL21(DE3)菌株诱导后有明显的目的蛋白表达条带，分子量约为29.0KD。将表达蛋白条带经质谱鉴定为fHbp-A蛋白，表达正确。将工程菌株按现行版药典要求进行种子库的建立。
3.2 fHbp-A/BL21(DE3)工程菌的发酵
将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时。以1％比例扩大接种至发酵罐，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至20-24，IPTG(0.5mM)诱导4-6小时。大容量离心机离心收集菌体。
3.3 fHbp-A重组脂蛋白的提取纯化
菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(20mM PB，2mM EDTA，pH7.5)，低温超高压(1200-1400bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。
蛋白提取：采用30-60％硫酸铵分级沉淀，20mM PB PH7.5溶解，10KD超滤并浓缩至原体积的1/5-1/3。
蛋白纯化：采用Sepharose QFF，平衡液：20mM PB PH7.5，洗脱液：20mM PB+1MNaCl PH7.5，洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集10％洗脱峰。
3.4 fHbp-A重组脂蛋白原液的制备：
取10％梯度洗脱液10KD超滤膜包超滤浓缩，经GE Sepharose 4FF层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查合格后，即为fHbp-A蛋白原液。
分子量与纯度检查：采用10-15％的分离胶进行SDS-PAGE，并以未转化的大肠杆菌BL21(DE3)为对照，以Gel DocTM XR+凝胶成像仪进行凝胶扫描，以Image Lab软件计算分子量及纯度分析，目的蛋白分子量为29.2KD，纯度为97.9％。
蛋白特异性检查Western Blot：样品和未转化的大肠杆菌BL21(DE3)经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，以脱脂奶粉封闭后分别结合兔抗fHbp特异性抗体和fHBP-A单克隆抗体，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，分别结合羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，DAB显色。结果显示，fHbp-A在29.0KD左右显现特异性蛋白带，而未转化大肠杆菌则无特异性蛋白带显现。
实施例4：fHbp-B重组脂蛋白的制备
4.1 fHbp-B/BL21(DE3)工程菌的构建
根据fHbp–B、流感嗜血杆菌P4外膜蛋白信号肽的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，P4信号肽直接位于fHbp-B N末端，于质粒pUC57上设计并合成全长DNA序列；
以限制性内切酶NdeI和XhoI处理pUC57合成质粒，得到(p4)fhbp-B基因大片断。
以限制性内切酶NdeI和XhoI处理pET43.1a质粒，得到酶切处理后的质粒pET43.1a。
将处理后的目的基因片段(p4)fhbp-B和质粒pET43.1a以重组酶连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃过夜培养。挑取阳性克隆接种LB(Amp)液体培养基，37℃振荡培养过夜。
根据p4、fhbp-B基因序列设计如下引物
用引物p4-F，fhbp-B-R对挑取克隆进行PCR鉴定，得到约850bp左右目的基因片段，如图4所示。将目的基因测序，结果显示质粒pET43.1a的外源基因片段DNA序列(p4)fhbp-B完全正确。将质粒转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含100ug/ml氨苄青霉素)，得到fHbp-B/BL21(DE3)表达菌株，挑取单个克隆，37℃振荡培养至细菌密度至OD600约0.5～1.0时，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果显示，fHbp-B/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量约为28.7KD。将表达蛋白条带经质谱鉴定为fHbp-B蛋白，表达正确。将工程菌株按现行版药典要求进行种子库的建立。
4.2 fHbp-B/BL21(DE3)工程菌的发酵
将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时。以1％比例扩大接种至发酵罐，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至20～24，IPTG(0.5mM)诱导4-6小时。大容量离心机离心收集菌体。
4.3 fHbp-B重组脂蛋白的提取纯化
菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(25mM PB，4mM EDTA，pH7.5)，低温超高压(1200-1400bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。
蛋白提取：采用40-60％硫酸铵分级沉淀，25mM PB PH7.4溶解，10KD超滤并浓缩至原体积的1/5-1/3。
蛋白纯化：采用Sepharose QFF，平衡液：25mM PB PH7.5，洗脱液：25mM PB+1MNaCl PH7.4，洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集15％洗脱峰。
4.4 fHbp-B重组脂蛋白原液的制备：
取15％梯度洗脱液10KD超滤膜包超滤浓缩，经GE Sepharose 4FF层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查合格后，即为fHbp-B蛋白原液。
分子量与纯度检查：采用12％的分离胶进行SDS-PAGE，并以未转化的大肠杆菌BL21(DE3)为对照，以Gel DocTM XR+凝胶成像仪进行凝胶扫描，以Image Lab软件计算分子量及纯度分析，分子量为28.8KD，纯度为98.3％。
蛋白特异性检查Western Blot：样品和未转化的大肠杆菌BL21(DE3)经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，以脱脂奶粉封闭后分别结合兔抗fHbp特异性抗体和fHBP-B单克隆抗体，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，分别结合羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，DAB显色。结果显示，fHbp-B在28.8KD左右显现特异性蛋白带，而未转化大肠杆菌则无特异性蛋白带显现。
实施例5 NadA重组蛋白的制备：
5.1 NadA/BL21(DE3)工程菌的工程菌的构建
根据NadA的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列(NadA)，以合成得到的NadA序列为模板，设计NadA-U1和NadA-D1为引物，引物序列如下：
NadA-U1:5'TTAAATTTCATATGAAACACTTTCCATCCAAAG 3'(NdeI)
NadA-D1:5'GCCCCTCGAGCTATTACCACTCGTAATTGACG 3'(XhoI)
PCR扩增得到NadA基因，回收NadA的PCR产物(约1100bp)，以限制性内切酶NdeI和XhoI酶切处理PCR产物和pET43.1a。
将酶切处理后PCR产物(目的基因NadA)和pET43.1a以T4 DNA ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落进行PCR鉴定。阳性克隆接种LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，提取质粒。将目的基因测序，结果显示质粒pET43.1a的外源基因片段DNA序列完全正确。
将质粒转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含100ug/ml氨苄青霉素)，得到NadA/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD600约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，NadA/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量为41.7KD。经质谱鉴定为NadA蛋白。将工程菌种按现行版药典要求进行种子库的建立。
5.2 NadA/BL21(DE3)工程菌的工程菌的发酵
将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养14小时，以1％接种比例扩大接种至发酵罐培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至14～20，IPTG(0.5mM)诱导4-6小时。大容量离心机离心收集菌体。
5.3 NadA重组蛋白的提取纯化
菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(50mM PB，2mM EDTA，pH7.2)，高压(800-1000bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。
蛋白提取：采用25-45％硫酸铵分级沉淀，50mM PB PH7.2溶解，30KD超滤5次，并浓缩至原体积的1/5-1/3。
蛋白纯化：采用Sepharose QFF层析，平衡液：50mM PB PH7.2，洗脱液：50mM PB+1MNaCl PH7.2。洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集30％的洗脱液。
5.4 NadA重组蛋白原液制备：
取30％梯度洗脱液经30KD超滤膜包超滤浓缩，采用Sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、30KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查即为NadA蛋白原液。
分子量与纯度检查：分子量为41.8KD，纯度为96.7％。
蛋白特异性检查Western Blot：样品和未转化的大肠杆菌BL21(DE3)经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，以脱脂奶粉封闭后分别结合兔抗NadA特异性单克隆抗体，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，结合羊抗鼠二抗，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，DAB显色。结果显示，NadA在42KD左右显现特异性蛋白带，而未转化大肠杆菌则无特异性蛋白带显现。
实施例6 NHBA重组蛋白的制备：
6.1 NHBA/BL21(DE3)工程菌的工程菌的构建
根据NHBA的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列(NHBA)，以合成得到的NHBA序列为模板，设计NHBA-U1和NHBA-D1为引物，引物序列如下：
NHBA-U1:5'GGAATTCCATATGTTTGAACGCAGTGT 3'(NdeI)
NHBA-D1:5'CCGCTCGAGCTATTAATCCTGCT 3'(XhoI)
PCR扩增得到NHBA基因，回收NHBA的PCR产物(约1300bp)，以限制性内切酶NdeI和XhoI酶切处理PCR产物和pET43.1a。
将酶切处理后PCR产物(目的基因NHBA)和pET43.1a以T4 DNA ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落进行PCR鉴定。阳性克隆接种LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，提取质粒。将目的基因测序，结果显示质粒pET43.1a的外源基因片段DNA序列完全正确。
将质粒转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含100μg/ml氨苄青霉素)，得到NHBA/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD600约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，NHBA/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量为48.7KD。经质谱鉴定为NHBA蛋白。将工程菌种按现行版药典要求进行种子库的建立。
6.2 NHBA/BL21(DE3)工程菌的工程菌的发酵
将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时，以1％接种比例扩大接种至发酵罐培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至18～22，IPTG(0.5mM)诱导4-6小时。大容量离心机离心收集菌体。
6.3 NHBA重组蛋白的提取纯化
菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(50mM PB，2mM EDTA，pH7.0)，高压(900-1100bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。
蛋白提取：采用30-50％硫酸铵分级沉淀，50mM PB PH7.0溶解，30KD超滤5次，并浓缩至原体积的1/5-1/3。
蛋白纯化：采用Sepharose QFF层析，平衡液：50mM PB PH7.0，洗脱液：50mM PB+1MNaCl PH7.0。洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集20％的洗脱液。
6.4 NHBA重组蛋白原液制备：
取20％梯度洗脱液经30KD超滤膜包超滤浓缩，采用Sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查即为NHBA蛋白原液。
分子量与纯度检查：分子量为48.7KD，纯度为96.7％。
蛋白特异性检查Western Blot：样品和未转化的大肠杆菌BL21(DE3)经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，以脱脂奶粉封闭后分别结合兔抗NHBA特异性单克隆抗体，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，结合羊抗鼠二抗，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，DAB显色。结果显示，NHBA在49KD左右显现特异性蛋白带，而未转化大肠杆菌则无特异性蛋白带显现。
实施例7、多组分疫苗的疫苗配方筛选实验
7.1多组分疫苗的组分配比
根据实验设计，按下表进行疫苗组分配比，均采用磷酸铝佐剂吸附，分别检测不同组别免疫小鼠血清的抗体滴度和杀菌滴度。
表5多组分疫苗成分的配方筛选
7.2免疫：
小鼠免疫：1-11组配制后，分别腹腔免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清。
7.3免疫原性检测：流行菌株的杀菌力实验
采用菌株440902，该菌株亦为ST4821序列型，属ST4821序列群。
靶菌的制备：培养流行性脑膜炎球菌440902菌株，在8-12％羊血琼脂平板上，37℃5-8％二氧化碳培养16-18小时，刮取菌苔至生理盐水中，细菌比浊法计数，根据计数，将靶菌稀释至1×106。
将待检血清56℃灭活30min后，加入补体，并设灭活补体、补体对照，倍比稀释至96孔培养板上，并滴加10ul靶菌。混匀于37℃培养1-2小时。
点样：将培养后的混合菌液，以10ul的量滴加至固体琼脂培养基上，37℃培养过夜。
显色：将含有150-300ug/ml的TTC的软琼脂覆盖在固体琼脂上，适宜温度显色。
计数：采用图像扫描技术，分析并计算细菌菌落个数，以杀菌力结果计算软件计算出杀菌滴度(杀菌力实验以大于1：8为具有保护性)。
7.4抗体滴度的检测：
全菌体包被B群脑膜炎球菌菌株440902株，将该菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生理盐水溶解，56℃菌体灭活后，稀释为2×108个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜，洗板后，进行血清抗体滴度检测。
实施例8、多组分疫苗的配制：
8.1各组分疫苗成份的单独吸附配制：
将B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白，分别以磷酸铝佐剂搅拌吸附，4℃过夜。以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为250μg/ml、300μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、400μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.85mg/ml。
8.2多组分疫苗配制：
将经磷酸铝佐剂吸附后的B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白按照1：1：1：1：1的比例混合，至B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为50μg/ml、60μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、80μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.85mg/ml。
8.3疫苗分装：
采用BD预填充注射器分装，0.5-0.6ml/剂，本实施例中，多组分疫苗各抗原组分为，B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白各组分的蛋白含量分别为25μg、30μg、30μg、40μg、40μg/剂。
实施例9、多组分疫苗与单一组分及对照品的免疫原性分析：
9.1免疫剂型为：单组分疫苗成份和最佳配比多组分疫苗成分及对照。
单组分疫苗为配制为多组分疫苗的各蛋白成分。多组分疫苗为配方最佳筛选剂量：B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为25μg/剂、30μg/剂、30μg/剂、40μg/剂、40μg/剂。对照为同等剂量的大肠杆菌蛋白及铝佐剂加缓冲液对照。
9.2小鼠免疫：分别腹腔免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠/组对照，相同方法注射经佐剂吸附的生理盐水和大肠杆菌菌体蛋白。
表6 B群流行株440902株杀菌力实验:BC50titer(1：)
由于受到篇幅限制，本发明此处只列举部分实施例实验结果，实际上，本发明其他疫苗也能取得与上述实施例相同或者相近的有益效果。

Claims (10)

1.一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述疫苗包括：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白、重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV 5-40μg/剂，B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白分别为20-60μg/剂，重组NadA蛋白20-100μg/剂，重组NHBA蛋白30-90μg/剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV为20-30μg/剂，重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白含量分别为25-35μg/剂；重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白的含量分别为35-55μg/剂。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，以蛋白含量计，B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为25μg/剂、30μg/剂、30μg/剂、40μg/剂、40μg/剂。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，该疫苗的pH为5.8-7.2；铝含量为0.4-1.2mg/ml。
5.权利要求1所述的疫苗的制备方法，包括以下步骤：将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白，重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例稀释配制后，采用冻干或吸附的方式配制成多组分B群脑膜炎球菌疫苗。
6.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV的制备：将B群脑膜炎球菌LPS类脂A lpxA基因以大肠杆菌DH5α的lpxA基因替换，得到B群脑膜炎球菌低内毒素突变株，将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株进行发酵培养，发酵液离心并收集菌体，菌体采用低温超高压均质破碎，离心收集上清，再采用去污剂抽提、离子交换、疏水层析等纯化的方法得到纯化的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV。
7.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，
重组fHbp-A脂蛋白的制备方法：
根据fHbp-A、流感嗜血杆菌信号肽P4的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列；流感嗜血杆菌信号肽P4序列直接连接于fHbp-A N末端，将目的基因片段(p4)fhbp-A和质粒pET43.1a以DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到fHbp-A/BL21(DE3)菌株，将菌株培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组fHbp-A脂蛋白，
重组fHbp-B脂蛋白的制备方法：
根据fHbp-B、流感嗜血杆菌信号肽P4的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列；流感嗜血杆菌信号肽P4序列直接连接于fHbp-B N末端，将目的基因片段(p4)fhbp-B和质粒pET43.1a以DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到fHbp-B/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组fHbp-B脂蛋白。
8.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，重组NadA蛋白的制备方法：根据B群脑膜炎球菌NadA蛋白的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将目的基因片段和质粒pET43.1a以T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，得到NadA/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组蛋白。
9.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，B群脑膜炎球菌重组NHBA蛋白的制备方法：根据B群脑膜炎球菌NHBA蛋白的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将目的基因片段和质粒pET43.1a以T4DNA Ligase连接，连接产物转化E.coliBL21(DE3)，得到NHBA/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取，蛋白纯化得到重组蛋白。
10.权利要求1所述的疫苗在制备预防B群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病的药物中的应用。
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