CN108918625B - 一种生物传感膜的制备方法、生物传感膜及监测装置 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种生物传感膜的制备方法，对氧化还原酶进行电化学活化修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜，其中，所述化学交联剂为戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚。本申请还公开了一种上述方法制备的生物传感膜及监测装置。本申请提供的制备方法或上述制备方法制得的生物传感膜及监测装置，稳定耐用，可以多次检测，尤其适用于作为活体监测装置的生物传感膜。

Description

一种生物传感膜的制备方法、生物传感膜及监测装置
技术领域
本申请涉及检测设备技术领域，特别是涉及一种生物传感膜的制备方法、生物传感膜及监测装置。
背景技术
电化学生物传感器是一种对生物物质敏感并能将其浓度转化为电信号进行检测的装置。电化学生物传感器包含能够识别目标物质的具有选择性的生物物质如氧化还原酶和抗体，以及将该识别信号转换为电信号的电极及其附属装置。例如，当氧化还原酶被用作目标识别物质时，其和电极之间的电子交换是生物传感装置的重要步骤。然而，通常情况下，氧化还原酶的氧化还原活性位点不与电极交换电子，酶的活性位点与电极之间的电子转移是大多数生物传感器的限制因素。为克服电子转移效率低的问题，可以在生物传感膜引入电化学性能优秀的氧化还原小分子化合物，在氧化还原酶与电极之间建立电子通道，使电子交换快速进行。
但引入氧化还原小分子化合物后，如何与氧化还原酶一起制成稳定的生物传感膜，并固定在电极上，能够稳定进行多次检测，特别是植入活体后还能够稳定进行多次检测，并保持检测结果的稳定，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的为提供一种生物传感膜的制备方法；本发明的第二个目的为提供一种上述制备方法制备的生物传感膜；本发明的第三个目的为提供上述制备方法制备的监测装置。本发明提供的制备方法或上述制备方法制得的生物传感膜及监测装置，稳定耐用，可以多次检测，尤其适用于作为活体监测装置的生物传感膜。
本发明提供的技术方案如下：
一种生物传感膜的制备方法，对氧化还原酶进行电化学活化修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜，其中，所述化学交联剂为戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚。
优选地，所述氧化还原酶为葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、过氧化氢酶中的任意一种或多种。
优选地，采用带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基或羧基的锇的络合物，对氧化还原酶进行电化学活化修饰。
优选地，所述对氧化还原酶进行电化学活化修饰的具体步骤为：将带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基的锇的络合物，与氧化还原酶在缓冲溶液中混匀，依次加入碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，2-6℃反应12-48h，超滤透析。
优选地，采用带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基锇的络合物，对氧化还原酶进行两次修饰，第一次修饰超滤切割分子量5000-50000，第二次修饰超滤切割分子量500-50000。
优选地，所述带游离氨基或羧基的锇的络合物具体为Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl或Os(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl；所述带游离氨基或羧基的钌的络合物具体为Ru(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl或Os(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl。
优选地，使用化学交联剂交联处理的具体步骤为：将修饰后的氧化还原酶，与化学交联剂在缓冲溶液中混匀，反应0.5-5h后，涂覆在电极表面，形成生物传感膜。
优选地，待交联处理后形成的生物传感膜干燥后，在其表面涂覆聚乙烯吡啶和Nafion混合醇溶液，形成具有生物相容性的生物传感膜。
上述任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
一种监测装置，包括传感器，所述传感器包括上述任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
本发明提供一种生物传感膜的制备方法，对氧化还原酶进行电化学活化修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜，其中，所述化学交联剂为戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚。本发明提供的制备方法，通过使用戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚作为化学交联剂，对修饰后的氧化还原酶进行处理，然后涂覆在电极表面，即可在电极表面形成生物传感膜。经戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚交联处理形成的生物传感膜，稳定耐用，可以多次检测，尤其适用于作为活体监测装置的生物传感膜。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中经Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl修饰的葡萄糖氧化酶和天然葡萄糖氧化酶的循环伏安图；
其中，(a)为经Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl修饰的葡萄糖氧化酶的循环伏安图，(b)为天然葡萄糖氧化酶的循环伏安图。
图2为本发明实施例中经Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl修饰的葡萄糖氧化酶和天然葡萄糖氧化酶的紫外-可见吸收光谱；
其中，(a)为天然葡萄糖氧化酶的紫外-可见吸收光谱；(b)为经Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl修饰的葡萄糖氧化酶的紫外-可见吸收光谱。
图3为本发明实施例中含有已修饰的葡萄糖氧化酶的生物传感膜在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中的循环伏安图和加入5.0mM葡萄糖后的循环伏安图；
其中，(a)为含有已修饰的葡萄糖氧化酶的生物传感膜在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中的循环伏安图；(b)为加入5.0mM葡萄糖后的循环伏安图。
图4为本发明实施例中葡萄糖在生物传感膜上的电化学催化氧化电流与葡萄糖浓度的关系示意图；
图5为本发明实施例中含有经过修饰的乳酸氧化酶的生物传感膜在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中的循环伏安图和加入5.0mM乳糖后的循环伏安图；
其中，(1)为经过修饰的乳酸氧化酶的生物传感膜在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中的循环伏安图；(2)为加入5.0mM乳糖后的循环伏安图。
图6为含有经过修饰的葡萄糖脱氢酶的生物传感膜在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中的循环伏安图和加入5.0mM葡萄糖后的循环伏安图；
其中，(1)为经过修饰的葡萄糖脱氢酶的生物传感膜在PBS(pH 7.4)缓冲溶液中的循环伏安图；(2)为加入5.0mM葡萄糖后的循环伏安图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
请如图1至图6所示，本发明实施例提供一种生物传感膜的制备方法，对氧化还原酶进行修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜，其中，所述化学交联剂为戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚。
本发明提供一种生物传感膜的制备方法，对氧化还原酶进行电化学活化修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜，其中，所述化学交联剂为戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚。本发明提供的制备方法，通过使用戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚作为化学交联剂，对修饰后的氧化还原酶进行处理，然后涂覆在电极表面，即可在电极表面形成生物传感膜。经戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚交联处理形成的生物传感膜，稳定耐用，可以多次检测，尤其适用于作为活体监测装置的生物传感膜。
优选地，所述氧化还原酶为葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、过氧化氢酶中的任意一种或多种。
本发明中，氧化还原酶具体为葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、过氧化氢酶中的任意一种或多种。上述氧化还原酶经电化学活化修饰后，再经过化学交联剂处理，都能够在电极表面形成稳定的生物传感膜，斌对目标物质进行检测。
优选地，采用带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基或羧基的锇的络合物，对氧化还原酶进行电化学活化修饰。
优选地，所述对氧化还原酶进行修饰的具体步骤为：将带游离氨基的钌的络合物或带游离氨基的锇的络合物，与氧化还原酶在缓冲溶液中混匀，依次加入碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，2-6℃反应12-48h，超滤透析。
优选地，采用带游离羧基的钌的络合物或带游离羧基锇的络合物，对氧化还原酶进行两次修饰，第一次修饰超滤切割分子量5000-50000，第二次修饰超滤切割分子量500-50000。
优选地，所述带游离氨基或羧基的锇的络合物Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl或Os(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl；的钌的络合物具体为Ru(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl或Os(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl。。
本发明中，对氧化还原酶进行修饰，优选采用带游离氨基的钌的络合物或带游离氨基的锇的络合物。更优选采用Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl或Ru(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl进行修饰。其中bpy是指2,2-联吡啶。
对氧化还原酶进行电化学活化修饰的具体步骤为：将带游离氨基的钌的络合物或带游离氨基的锇的络合物，与氧化还原酶在缓冲溶液中混匀，依次加入碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，2-6℃反应12-48h，超滤透析。更优选的是，采用带游离羧基的钌的络合物或带游离羧基锇的络合物，对氧化还原酶进行两次修饰，第一次修饰超滤切割分子量5000-50000，第二次修饰超滤切割分子量500-50000。
具体而言，采用带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基或羧基锇的络合物，对氧化还原酶进行两次电化学活化修饰的可采用以下步骤：
将带有游离氨基的钌的络合物，或带有游离氨基的锇的络合物，与氧化还原酶(如葡萄糖氧化酶)在PBS缓冲溶液进行充分混合，然后依次加入碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，充分混合后，2-6℃反应12-48h。然后利用超滤袋透析，切割分子量5000-50000，对第一次修饰后的氧化还原酶进行分离和提纯。然后在提纯后的氧化还原酶溶液中加入游离羧基的钌的络合物，或带有游离羧基的锇的络合物，然后依次加入碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，充分混合后2-6℃反应12-48h，反应结束后，再次利用超滤袋透析，切割分子量500-50000，对第二次修饰后的氧化还原酶进行分离和提纯。其中，使用的带有游离氨基或羧基的钌的络合物，或带有游离氨基或羧基的锇的络合物，其浓度优选为0.1-50mg/ml，更优选为1-20mg/ml。使用的碳化二亚胺浓度优选为0.1-50mmol/L，更优选0.1-25mmol/L。使用的N-羟基琥珀酰亚胺的浓度优选为0.01-5mmol/L。经分光光度法分析，可以证实氧化还原酶已被成功地修饰。
优选地，使用化学交联剂交联处理的具体步骤为：将修饰后的氧化还原酶，与化学交联剂在缓冲溶液中混匀，反应0.5-5h后，涂覆在电极表面，形成生物传感膜。
优选地，待交联处理后形成的生物传感膜干燥后，在其表面涂覆聚乙烯吡啶和Nafion混合醇溶液，形成具有生物相容性的生物传感膜。
本发明中，使用化学交联剂交联处理的具体步骤为：将修饰后的氧化还原酶，与化学交联剂在缓冲溶液中混匀，反应0.5-5h后，涂覆在电极表面，形成生物传感膜。优选待交联处理后形成的生物传感膜干燥后，在其表面涂覆聚乙烯吡啶和Nafion混合醇溶液，形成具有生物相容性的生物传感膜。
具体而言，将修饰后的氧化还原酶，与化学交联剂反应可采用以下步骤：
将修饰后的氧化还原酶，在PBS缓冲溶液中，与戊二醛溶液或聚乙二醇二缩水甘油醚溶液进行充分混合，反应0.5-5h、优选0.5-3h后，用滴落涂布法或浸渍提拉法将化学交联后的氧化还原酶涂覆在电极表面，制成生物传感膜。待电极上的生物传感膜完全干燥后，再用滴落涂布法或浸渍提拉法将聚乙烯吡啶和Nafion混合醇溶液涂覆在生物传感膜表面，制成具有生物相容性的生物传感膜。优选地，使用的化学交联剂戊二醛溶液或聚乙二醇二缩水甘油醚溶液的浓度为0.1-5％。使用的修饰后的氧化还原酶的浓度优选为5-150mg/ml。使用的聚乙烯吡啶溶液的浓度优选为20-300mg/ml。使用的Nafion混合醇溶液的浓度优选为0.1-5％，优选使用聚乙烯吡啶和Nafion混合乙醇溶液，即，将聚乙烯吡啶和Nafion在乙醇中溶解并混合得到的聚乙烯吡啶和Nafion混合乙醇溶液。
经过化学交联后，氧化还原酶仍然保持着它们的直接电化学作用。实验表明葡萄糖氧化酶的在生物传感膜中不仅保持了其对葡萄糖的催化氧化性能，其通过直接电化学对葡萄糖的催化氧化效率比天然葡萄糖氧化酶通过氧气对葡萄糖的催化氧化效率提高140倍。
上述任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
一种监测装置，包括传感器，所述传感器包括上述任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
本发明提供上述任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。还提供一种监测装置，包括传感器，所述传感器包括上述任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
所述监测装置，优选为植入式持续监测装置，能够在植入生命体内(如人体内)稳定运行，并能长时间多次检测目标物质。植入式持续监测装置，是将固定了生物传感膜的传感器植入皮下，并通过接收器或移动设备实时接收传感器传回的数据，以实现对目标物质浓度的长期持续监测。例如，可以开发血糖的植入式监测装置，在对血糖进行监测的同时，还能配合胰岛素泵的产品，及时补充胰岛素，以调节体内血糖含量。
实施例1
将1-20mg/ml的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl，与葡萄糖氧化酶在PBS缓冲溶液进行充分混合，然后依次加入0.1-25mmol/L碳化二亚胺和0.01-5mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺，充分混合后，4℃反应24h。然后利用超滤袋透析，切割分子量5000-50000，对第一次修饰后的氧化还原酶进行分离和提纯。然后在提纯后的氧化还原酶溶液中加入1-20mg/ml的Os(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl，然后依次加入0.1-25mmol/L碳化二亚胺和0.01-5mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺，充分混合后4℃反应24h，反应结束后，再次利用超滤袋透析，切割分子量500-50000，对第二次修饰后的氧化还原酶进行分离和提纯。葡萄糖氧化酶在经过修饰后，其催化活性中心就可以直接与电极进行非常快速电子交换(如附图1所示)。利用分光光度法进行分析，证实葡萄糖氧化酶已被成功地修饰(如附图2所示)。
将5-150mg/ml修饰后的氧化还原酶，在PBS缓冲溶液中，与0.1-5％戊二醛溶液进行充分混合，反应0.5-3h后，用滴落涂布法或浸渍提拉法将化学交联后的氧化还原酶涂覆在电极表面，制成生物传感膜。待电极上的生物传感膜完全干燥后，再用滴落涂布法或浸渍提拉法将含有20-300mg/ml聚乙烯吡啶和0.1-5％Nafion混合醇溶液涂覆在生物传感膜表面，制成具有生物相容性的生物传感膜。经过戊二醛化学交联处理后，上述修饰后的葡萄糖氧化酶仍然保持着直接电化学作用，制成的生物传感膜在电极上呈现出良好的电化学性能(附图3中(a))。当在PBS缓冲溶液中加入5.0mM的葡萄糖后，生物传感膜的循环伏安图清晰地展示了一个典型的电化学催化过程(附图3中(b)).进一步的实验表明葡萄糖氧化酶的在生物传感膜中不仅保持了其对葡萄糖的催化氧化性能，其通过直接电化学对葡萄糖的催化氧化效率比天然葡萄糖氧化酶通过氧气对葡萄糖的催化氧化效率提高140倍。
在此基础上，我们上述生物传感膜应用于植入式持续葡萄糖监测***。初步试验结果表明其工作曲线在2.0到32mM之间呈良好的线性(如附图4所示)，是目前线性范围最宽的持续葡萄糖监测***。其稳定性也得到了显著的改善，在连续两个星期的试验中，灵敏度没有明显的变化。
不仅是葡萄糖氧化酶，其它氧化还原酶如乳酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶等均可被成功地修饰，并和戊二醛化学交联。
含有经过修饰的乳酸氧化酶，和含有修饰后的葡萄糖脱氢酶的生物传感膜在电极上都呈现出良好的电化学性能(如附图5所示)。当在PBS缓冲溶液中加入5.0mM的乳糖或葡萄糖后，生物传感膜的循环伏安图清晰地展示了典型的电化学催化过程(如附图6所示)。这一结果表明它们在生物传感膜中保持了其通过直接电化学的催化氧化性能。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种生物传感膜的制备方法，其特征在于，采用带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基或羧基的锇的络合物对氧化还原酶进行电化学活化修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜，其中，所述化学交联剂为戊二醛或聚乙二醇二缩水甘油醚；
使用化学交联剂交联处理的具体步骤为：将修饰后的氧化还原酶，与化学交联剂在缓冲溶液中混匀，反应0.5-5h后，涂覆在电极表面，形成生物传感膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化还原酶为葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、过氧化氢酶中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述对氧化还原酶进行电化学活化修饰的具体步骤为：将带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基或羧基的锇的络合物，与氧化还原酶在缓冲溶液中混匀，依次加入碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，2-6℃反应12-48h，超滤透析。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用带游离氨基或羧基的钌的络合物或带游离氨基或羧基的锇的络合物，对氧化还原酶进行两次电化学活化修饰，第一次修饰超滤切割分子量500-50000，第二次修饰超滤切割分子量5000-50000。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，带游离氨基的锇的络合物具体为Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl，带游离羧基的锇的络合物具体为Os(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl；带游离氨基的钌的络合物具体为Ru(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl，带游离羧基的钌的络合物具体为Ru(bpy)2(4-咪唑丁酸)Cl。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，待交联处理后形成的生物传感膜干燥后，在其表面涂覆聚乙烯吡啶和Nafion混合醇溶液，形成具有生物相容性的生物传感膜。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
8.一种监测装置，包括传感器，其特征在于，所述传感器包括根据权利要求1-6中任意一项所述的制备方法制得的生物传感膜。
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