CN108913808B - 用于控制小麦叶片衰老的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于控制小麦叶片衰老的引物、试剂盒及其应用，属于植物基因工程和小麦分子育种技术领域，能够解决在延缓许多作物衰老突变体中，作物农艺性状较差，很难被利用的问题。该技术方案包括根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老。本发明应用小麦TaNACS基因可以控制小麦叶片衰老过程，同时该基因的过表达或者基因沉默材料均不影响小麦其它农艺性状。

Description

用于控制小麦叶片衰老的引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和小麦分子育种技术领域，尤其涉及一种用于控制小麦叶片衰老的引物、试剂盒及其应用。

背景技术

衰老是植物发育的最后一个阶段，其不仅受温度、病害、胁迫等外因影响，同时还被基因调控，受体内激素水平的影响。叶片衰老与作物产量及品质息息相关，作物早衰或晚衰不利于完成其正常的生命周期，造成作物减产或者品质降低，严重影响农艺性状。因此，叶片衰老调控因子的发现及其应用是实现作物高产高品质的有效途径之一。

小麦是世界上重要的粮食作物之一，提高小麦产量是诸多育种家的目标。叶片早衰会缩短有效光合作用时间，使小麦减产；适时晚衰则可以有效提高小麦产量；但过度晚衰又会使小麦生育周期延长，不利于农业生产耕作。因此，小麦的衰老时间的调控是产量与品质提高的重要控制因素。虽然，在许多作物中均有延缓衰老突变体被研究，但多数农艺性状较差，很难被利用。因此，获得特异调控小麦衰老但不影响其它农艺性状的基因是解决延缓衰老提高小麦产量的关键策略之一。

发明内容

针对现有技术存在的不足之处，本发明提出用于控制小麦叶片衰老的的引物、试剂盒及其应用，其能够特异调控小麦衰老，同时不影响其它农艺性。

为解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：

根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，具体包括：

本发明还提出一种试剂盒，包含如上述技术方案所述的用于控制小麦叶片衰老的引物。

本发明还提出一种利用上述技术方案所述的引物控制小麦叶片衰老的方法，具体的，利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老。

作为优选，所述利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，具体包括：

将以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到的TaNACS基因产物通过重组连接到过表达载体上，形成TaNACS重组载体；

将所述TaNACS重组载体整合进入小麦基因组，筛选获得阳性转基因材料。

作为优选，所述利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老，具体包括：

将利用巢式PCR得到的RNAi片段连接到载体上，得到TaNACS基因RNAi最终载体；

将所述RNAi最终载体整合进入小麦基因组，筛选获得阳性转基因材料。

作为优选，所述利用巢式PCR得到RNAi片段，具体包括：

以TaNACS cDAN序列为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，获得初步的RNAi片段；

将上述初步的RNAi片段稀释50倍，以稀释后的初步的RNAi片段为模板，以SEQ IDNO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物进行第二轮PCR扩增，得到RNAi片段。

作为优选，所述利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老，还包括以下步骤：

以TaNACS重组载体及TaNACS基因RNAi最终载体的转基因材料的cDNA为模板，以SEQ ID NO.7为上游引物、SEQ ID NO.8为下游引物进行荧光定量PCR检测，鉴定阳性转基因材料。

作为优选，所述以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到TaNACS基因产物的扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于小麦TaNACS基因可以控制小麦叶片衰老过程，同时该基因的过表达或者基因沉默材料均不影响小麦其它农艺性状。

附图说明

图1为本发明实施例1所提供的TaNACS基因在转基因小麦中的表达情况示意图；

图2为本发明实施例2过量表达TaNACS基因的小麦表型分析示意图，其中，A为过量表达TaNACS基因小麦明显能够促进叶片衰老，B为对过量表达及对照小麦的叶片叶绿素测定结果，C为对过量表达及对照小麦的叶片光和效率测定结果；

图3为本发明实施例2中TaNACS基因沉默材料的小麦表型分析示意图，其中，A为TaNACS基因沉默小麦明显能够抑制叶片衰老，B为对TaNACS基因沉默小麦及对照的叶片叶绿素测定结果，C为对TaNACS基因沉默及对照小麦的叶片光合效率测定结果。

具体实施方式

下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行详细、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明总的技术方案的部分具体实施方式，而非全部的实施方式。基于本发明的总的构思，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都落于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种用于控制小麦叶片衰老的引物，包括：

根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，具体包括：

在该实施例中，TaNACS基因是如SEQ ID NO.9所示的一段小麦基因片段。

根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，其中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2用于构建TaNACS重组过表达载体；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4用于获得初步的RNAi片段；SEQID NO.5、SEQ ID NO.6用于创制TaNACS基因RNAi最终载体；SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8用于TaNACS基因的荧光定量检测。

本发明实施例还提供了试剂盒，包含如上述实施例所述的用于控制小麦叶片衰老的引物。

本发明实施例还提供了利用上述实施例所述的引物控制小麦叶片衰老的方法，具体的，利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老。

在该实施例中，通过设计TaNACS基因较为特异的一段作为RNAi沉默工作片段，该片段长度在300-450bp之间，对TaNACS基因的沉默效果较好；在RNAi设计中，GC含量低于40％或者高于70％都不利于RNAi小分子RNA的形成，影响RNAi的效果，该实施例中设计得到的RNAi片段中GC含量为64％，非常符合RNAi中形成小分子RNA的条件。其中，RNAi沉默工作片段是如SEQ ID NO.10所示的一段基因片段。

在一优选实施例中，所述利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，具体包括：

将以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到的TaNACS基因产物通过重组连接到过表达载体上，形成TaNACS重组载体；

将所述TaNACS重组载体整合进入小麦基因组，筛选获得阳性转基因材料。

在该实施例中，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2对小麦cDNA进行PCR扩增得到TaNACS基因产物，优势在于：该引物中含有可以直接与最终过表达载体pCambia3301重组的接头序列，不需要经过中间载体步骤，直接利用重组酶infusion连接到过表达载体pCAMBIA3301中，高效省时；引物序列中GC含量都小于70％。

在一优选实施例中，所述利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老，具体包括：

将利用巢式PCR得到的RNAi片段连接到载体上，得到TaNACS基因RNAi最终载体；

将所述RNAi最终载体整合进入小麦基因组，筛选获得阳性转基因材料。

在一优选实施例中，所述利用巢式PCR得到RNAi片段，具体包括：

以TaNACS cDAN序列为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，获得初步的RNAi片段；

将上述初步的RNAi片段稀释50倍，以稀释后的初步的RNAi片段为模板，以SEQ IDNO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物进行第二轮PCR扩增，得到RNAi片段。

在该实施例中，利用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为引物进行PCR扩增，获得初步的RNAi片段，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物含有部分gataway引物接头，可以直接通过巢式PCR进行第二轮PCR,获得最终RNAi载体片段；同时，该引物可特异扩增TaNACS的RNAi片段，使该RNAi片段可特异针对TaNACS基因进行基因沉默。利用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6为引物进行PCR扩增，获得TaNACS基因RNAi最终载体，SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6引物普遍适用于gataway RNAi片段扩增，同时与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4构成巢式PCR引物组合，使RNAi片段扩增效率提高，有效降低非特异扩增。

在一优选实施例中，所述利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老，还包括以下步骤：

以TaNACS重组载体及RNAi最终载体转基因材料的cDNA为模板，以SEQ ID NO.7为上游引物、SEQ ID NO.8为下游引物进行荧光定量PCR检测，鉴定转基因材料。

在该实施例中，利用SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8为引物，以TaNACS重组载体及RNAi植株转基因材料的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，可以同时检测TaNACS基因过量表达和RNAi材料中TaNACS基因表达情况。

在一优选实施例中，所以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ IDNO.2为下游引物特异扩增得到TaNACS基因产物的扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于控制小麦叶片衰老的的引物、试剂盒及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

1、TaNACS基因克隆及过表达载体构建

以中国春小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物进行PCR扩增，模板浓度为50ng/ml，扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

将PCR扩增产物通过infusion重组酶连接到pCambia3301过表达载体(ubi驱动的过量表达)上，最终形成重组载体pCambia3301-TaNACS。

连接方法为：

(1)利用EcoRI和BamHI双酶切pCambia3301载体，片段回收后待用；

(2)建立连接体系：1.5μL酶切后的pCambia3301载体；2.5μL PCR片段；1μLinfusion酶：

(3)建立反应条件：50℃15min，冰上放置5分钟；转化大肠杆菌DH5a；进行阳性鉴定并测序鉴定。

将测序正确的重组载体转入到农杆菌中，为下一步小麦转化做准备。

2、创制TaNACS RNAi载体

以TaNACS cDAN序列为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，获得初步的RNAi片段；

以第一步获得的PCR产物稀释50倍为模板，以SEQ ID NO.5为上游引物、SEQ IDNO.6为下游引物进行PCR扩增，最终获得带有gateway接头的TaNACS基因RNAi片段；

中间载体获得：将第二轮扩增获得的片段利用BP酶连接到中间载体pDnor207上，体系为：pDonor207载体2μL，PCR片段2μL，BP酶1μL；25℃过夜重组反应；将重组好的载体命名为pDonor207-TaNACS，将重组好的载体转化大肠杆菌DH5a，阳性鉴定测序；

RNAi最终载体获得：利用LR重组反应获得TaNACS基因RNAi最终载体，体系为：pDonor207-TaNACS载体2μL，RNAi最终载体pandor 2μL，LR酶1μL；25℃过夜重组反应；将重组好的载体命名为pandor-TaNACS，将重组好的载体转化大肠杆菌DH5a，阳性鉴定测序。

3、转基因小麦获得

将获得的TaNACS过量表达及RNAi载体转化进入农杆菌LB4404中，通过阳性鉴定，获得阳性农杆菌，利用小麦胚转化方法，将含有TaNACS基因的过表达载体及针对TaNACS基因的RNAi载体的T-DNA整合进入小麦基因组，通过basta抗性筛选获得阳性转基因材料。

4、转基因材料鉴定

为了进一步明确TaNACS基因在转基因小麦中的表达情况，利用qRT-PCR方法，以TaNACS基因过量表达及RNAi植株cDNA为模板，以SEQ ID NO.7为上游引物、SEQ ID NO.8为下游引物进行PCR进行荧光定量PCR检测，检测结果见图1，结果表明，在RNAi株系中TaNACS基因表达明显下降；而过表达材料中TaNACS基因表达明显升高；这说明TaNACS基因的基因沉默和过表达效果明显，也为下一步获得生理数据及表型分析提供了可靠材料。

性能测试

过量表达转基因小麦种子用水浸透，在滤纸上持续光照下萌发一周，发芽后移入盆中生长，对照和转基因材料相同条件下管理，生长约100天后对表型进行初步分析，如图2A所示，过量表达TaNACS基因能够明显促进小麦叶片衰老；选取叶位相同的旗叶进行叶绿色含量测定，结果见图2C；同时进行光合效率测定，结果见图2B，发现与对照相比，过量表达TaNACS转基因材料叶绿素含量明显降低同时光和效率也下降，表明TaNACS基因能够促进小麦叶片早衰。

在TaNACS基因沉默材料表型分析中，将小麦种子(RNAi材料及野生型小麦种子)放在湿透的滤纸上，低温处理3天后，放在光下萌发一周，待种子萌发后下胚轴长至约2-3cm长度后，移入花盆中；生长约100天后，对转基因小麦及野生型进行叶片表型鉴定及衰老生理参数测定；结果见图3，结论为在小麦中沉默TaNACS基因能够延缓小麦叶片衰老进程；同时，TaNACS的基因沉默材料叶绿素含量较野生型高；光合效率较野生型高。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 用于控制小麦叶片衰老的引物、试剂盒及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcagcccgg ggatccatga tcatgtccga cccgg 35

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctttgtag tcgttaacga aacggagcaa cgtcccct 38

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacaaaaaag caggcttcga tcatgcaagg cggcgcca 38

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtacaagaaa gctgggtcga aacggagcaa cgtcccctg 39

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc 32

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctccatgag gctggatga 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgccggcgct cgacacggg 19

<210> 9

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgatcatgt ccgacccggc catgctgccg ccgggcttcc ggttccaccc gacggacgag 60

gagctcatcc tacactacct ccgcaaccgc gccgccgaat cgccctgccc cgtctccatc 120

atcgccgacg tagatatcta caagttcgac ccatgggccc tgccatccaa ggctagctac 180

ggggacaggg agtggtactt cttcacgccg agggaccgta agtaccccaa cggtgtccgg 240

ccgaaccgcg ccgcgggttc cggctactgg aaggccaccg gcaccgacaa gcccatccgc 300

tgcagcgcca ccggcgagag cgtcggcgtc aagaaggccc tcgtcttcta caagggccgc 360

ccgcccaagg gcatcaaaac caactggatc atgcacgagt accgcctcgc tgccgccgac 420

gcacacgccg ccaacaccta ccgccccatg aagttccgca acgcctccat gaggctggat 480

gactgggtgc tgtgccggat ctacaagaag accagccaag tgtcgccgat ggcggtgccg 540

ccgctgtccg accacgagct tgacgagcct tctggcgctg acgcctaccc cgtgtcgagc 600

gccggcatga tcatgcaagg cggcgccagc ggctacccgc tgcaggccgc ggccgtcggc 660

acacagagga tgcccaagat cccgtccata tcagagttgc tcaacgagta ctcgctggcg 720

cagctcttcg aggacagcgg acacgcgctg atggcgcggc acgatcagca cgccgccctc 780

ctcggtcacc ccatcatgag ccaattccat gtgaacagca tgccgcagct tgggcagatg 840

gattcgtcag cctcaacgtc ggtggcaggc gagggtgccg ccgggaagcg caagaggccg 900

tcggaggacg gtgaccgtaa cgggtcgacg agccagccag cggcggcggt gacgggcaag 960

aagcccaaca gttcttgctt gggtgcaaca acgttccaaa caggcaacaa caccttgcag 1020

gggacgttgc tccgtttcta a 1041

<210> 10

<211> 430

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatcatgcaa ggcggcgcca gcggctaccc gctgcaggcc gcggccgtcg gcacacagag 60

gatgcccaag atcccgtcca tatcagagtt gctcaacgag tactcgctgg cgcagctctt 120

cgaggacagc ggacacgcgc tgatggcgcg gcacgatcag cacgccgccc tcctcggtca 180

ccccatcatg agccaattcc atgtgaacag catgccgcag cttgggcaga tggattcgtc 240

agcctcaacg tcggtggcag gcgagggtgc cgccgggaag cgcaagaggc cgtcggagga 300

cggtgaccgt aacgggtcga cgagccagcc agcggcggcg gtgacgggca agaagcccaa 360

cagttcttgc ttgggtgcaa caacgttcca aacaggcaac aacaccttgc aggggacgtt 420

gctccgtttc 430

Claims (5)

1.用于控制小麦叶片衰老的引物，其特征在于，根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，具体包括：

。

2.试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的用于控制小麦叶片衰老的引物。

3.利用权利要求1所述的引物控制小麦叶片衰老的方法，其特征在于，包括利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，以及利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老；

其中，所述利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，具体包括：

将以中国春小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到的TaNACS基因产物通过重组连接到过表达载体上，形成TaNACS重组载体；

将所述TaNACS重组载体整合进入小麦基因组，筛选获得阳性转基因材料；

所述利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老，具体包括：

以TaNACS cDNA序列为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，获得初步的RNAi片段；

将上述初步的RNAi片段稀释50倍，以稀释后的初步的RNAi片段为模板，以SEQ ID NO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物进行第二轮PCR扩增，得到RNAi片段，进而将所述RNAi片段连接到载体上，得到TaNACS基因RNAi最终载体；

将所述RNAi最终载体整合进入小麦基因组，筛选获得阳性转基因材料。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括鉴定阳性转基因材料的步骤，具体为：

以TaNACS重组载体及TaNACS基因RNAi最终载体转基因材料的cDNA为模板，以SEQ IDNO.7为上游引物、SEQ ID NO.8为下游引物进行荧光定量PCR检测，鉴定阳性转基因材料。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到TaNACS基因产物的扩增程序为：

95℃ 3 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，33个循环；72℃ 10 min。

Images