CN108913754A - ***端粒长度的检测试剂、试剂盒及应用与检测方法 - Google Patents

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CN108913754A CN201810831973.8A CN201810831973A CN108913754A CN 108913754 A CN108913754 A CN 108913754A CN 201810831973 A CN201810831973 A CN 201810831973A CN 108913754 A CN108913754 A CN 108913754A
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李丹
江南
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Abstract

本发明提供了***端粒长度的检测试剂、试剂盒及检测方法，属于生物医学检验领域。本发明提供的***端粒长度的检测试剂，能方便实际检测，且检测结果更可靠稳定；将***端粒长度的检测试剂应用到***端粒长度检测中和制备检测试剂盒中，都能方便得到准确可靠的结果，而检测试剂盒更加方便进行检测，检测方法操作简单，结果易于判定，易于临床推广使用，实用性较强。

Description

***端粒长度的检测试剂、试剂盒及应用与检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学检验领域，具体而言，涉及***端粒长度的检测试剂、试剂盒及应用与检测方法。
背景技术
研究发现，端粒的长度依靠端粒酶来维持，端粒酶在生殖细胞中高度表达，这可能是随着年龄的增加端粒在***细胞中的长度长于体细胞的原因(人体细胞中端粒约5-10kb，而生殖细胞中端粒约10-20kb)，端粒酶活性降低和端粒长度缩短会导致细胞凋亡以。
目前临床研究端粒长度常采用方法包括末端限制性片段、单个端粒长度分析、杂交保护分析法、荧光原位杂交、寡核苷酸引物原位DNA合成法、定量PCR等，这些方法对操作者技术和统计分析要求较高，并且检测时间长、不适用于大批量操作。
发明内容
本发明的第一目的在于提供***端粒长度的检测试剂，通过检测试剂能很好的检测***端粒的长度。
本发明的第二目的在于提供上述***端粒长度的检测试剂在端粒长度检测中的应用。
本发明的第三目的在于提供***端粒长度的检测试剂在制备***端粒长度的检测试剂盒中的应用。
本发明的第四目的在于提供***端粒长度的检测试剂盒，通过该检测试剂盒，能更方便的对***端粒长度进行检测。
本发明的第五目的在于提供***端粒长度的检测方法，通过本检测方法，能快速准确的检测***的端粒长度。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
***端粒长度的检测试剂，检测试剂主要包括对照微球和荧光标记探针；对照微球含有1×103-1×107个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；微球的直径为4-10μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2～7；荧光标记探针的含量为1-10μg/mL。
上述的***端粒长度的检测试剂在端粒长度检测中的应用。
上述的***端粒长度的检测试剂在制备***端粒长度的检测试剂盒中的应用。
***端粒长度的检测试剂盒，检测试剂盒包括对照微球和荧光标记探针；对照微球含有1×103-1×107个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；微球的直径为4-10μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2～7；荧光标记探针的含量为1-10μg/mL；还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；杂交缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA制成，杂交缓冲液的pH值6.5-7.8；洗涤缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA、0.01-0.1％Tween-20制成，洗涤缓冲液为pH值6.5-7.8；DNA染色液由0.05-0.19mol/L NaCl，2.3-7.8mmol/L KCl，2.4-5.6mmol/L Na2HPO4，0.5-2.0mmol/L KH2PO4、0.01-0.1％BSA、0.02-0.15μg/mL的碘化丙啶制成。
***端粒长度的检测方法，包括以下步骤：
取***样本离心，弃***得到***沉淀样本；用洗涤缓冲液稀释***沉淀样本，得到浓度为1×103-1×107个/mL***的稀释样本；
将稀释样本与对照微球混合，并分装得到第一稀释样本和第二稀释样本，第一稀释样本和第二稀释样本分别与50-500μL的杂交缓冲液混合，在第一稀释样本加入荧光标记探针，得到检测样本，第二稀释样本作为对照的空白样本；
将检测样本与空白样本进行热激、杂交后分别加入0.5-2mL的洗涤缓冲液，混匀预热、离心，去上清后分别加入0.5-2mL的洗涤缓冲液和0.01-0.05mL的DNA染色液进行避光染色，得到待检染色样本和待检空白样本；
将待检染色样本和待检空白样本分别进行流式细胞仪检测并计算得到样本端粒长度。
本发明的有益效果为：本发明提供的***端粒长度的检测试剂，能方便实际检测，且检测结果更可靠稳定；将***端粒长度的检测试剂应用到***端粒长度检测中和制备检测试剂盒中，都能方便得到准确可靠的结果，而检测试剂盒更加方便进行检测，检测方法操作简单，结果易于判定，易于临床推广使用，实用性较强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例提供的空白样检测的散点图；
图2为本发明实验例提供的待检样本的检测散点图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的***端粒长度的检测试剂、试剂盒及应用与检测方法进行具体说明。
***端粒长度的检测试剂，检测试剂主要包括对照微球和荧光标记探针；对照微球含有1×103-1×107个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；微球的直径为4-10μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2～7；荧光标记探针的含量为1-10μg/mL。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，检测试剂还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；杂交缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA制成，杂交缓冲液的pH值6.5-7.8；洗涤缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA、0.01-0.1％Tween-20制成，洗涤缓冲液为pH值6.5-7.8；DNA染色液由0.05-0.19mol/L NaCl，2.3-7.8mmol/L KCl，2.4-5.6mmol/L Na2HPO4，0.5-2.0mmol/L KH2PO4、0.01-0.1％BSA、0.02-0.15μg/mL的碘化丙啶制成。
上述的***端粒长度的检测试剂在端粒长度检测中的应用。
上述的***端粒长度的检测试剂在制备***端粒长度的检测试剂盒中的应用。
***端粒长度的检测试剂盒，检测试剂盒包括对照微球和荧光标记探针；对照微球含有1×103-1×107个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；微球的直径为4-10μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2～7；荧光标记探针的含量为1-10μg/mL；还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；杂交缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA制成，杂交缓冲液的pH值6.5-7.8；洗涤缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA、0.01-0.1％Tween-20制成，洗涤缓冲液为pH值6.5-7.8；DNA染色液由0.05-0.19mol/L NaCl，2.3-7.8mmol/L KCl，2.4-5.6mmol/L Na2HPO4，0.5-2.0mmol/L KH2PO4、0.01-0.1％BSA、0.02-0.15μg/mL的碘化丙啶制成。
***端粒长度的检测方法，包括以下步骤：
取***样本离心，弃***得到***沉淀样本；用洗涤缓冲液稀释***沉淀样本，得到浓度为1×103-1×107个/mL***的稀释样本；
将稀释样本与对照微球混合，并分装得到第一稀释样本和第二稀释样本，第一稀释样本和第二稀释样本分别与50-500μL的杂交缓冲液混合，在第一稀释样本加入荧光标记探针，得到检测样本，第二稀释样本作为对照的空白样本；
将检测样本与空白样本进行热激、杂交后分别加入0.5-2mL的洗涤缓冲液，混匀预热、离心，去上清后分别加入0.5-2mL的洗涤缓冲液和0.01-0.05mL的DNA染色液进行避光染色，得到待检染色样本和待检空白样本；
将待检染色样本和待检空白样本分别进行流式细胞仪检测并计算得到样本端粒长度。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，离心的速度为200g-1000g，时间为5-30min；对照微球的浓度为1×103-1×107个/mL。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，荧光标记探针的终浓度为0.1-0.5μg/mL；热激的温度为75-85℃，时间为4-20min。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，杂交的温度为22-28℃，时间为3-24h；预热的温度为35-50℃，时间为5-20min；避光染色的温度为4-28℃，时间为5-60min。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，流式细胞仪的激发波长为488nm，接收波长为525nm和575nm。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供***端粒长度的检测试剂，该检测试剂主要包括对照微球和荧光标记探针。
对照微球含有1×103个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；微球的直径为4μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2；荧光标记探针的含量为1μg/mL。
还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；杂交缓冲液由50％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1％BSA制成，杂交缓冲液的pH值6.5；洗涤缓冲液由50％甲酰胺，20mmol/LTris-HCl，0.1％BSA、0.01％Tween-20制成，洗涤缓冲液为pH值6.5；DNA染色液由0.05mol/LNaCl，2.3mmol/L KCl，2.4mmol/L Na2HPO4，0.5mmol/L KH2PO4、0.01％BSA、0.02μg/mL的碘化丙啶制成。
因此可以将该***端粒长度的检测试剂应用到***端粒长度的检测中；也可以应用于制备***端粒长度检测的检测试剂盒。
本实施例提供一种***端粒长度的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述***端粒长度的检测试剂。
实施例2
本实施例提供***端粒长度的检测试剂，该检测试剂主要包括对照微球和荧光标记探针。
对照微球含有1×107个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝10000；微球的直径为10μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝7；荧光标记探针的含量为10μg/mL。
还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；杂交缓冲液由80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，1％BSA制成，杂交缓冲液的pH值7.8；洗涤缓冲液由80％甲酰胺，20mmol/LTris-HCl，1％BSA、0.1％Tween-20制成，洗涤缓冲液为pH值7.8；DNA染色液由0.19mol/LNaCl，7.8mmol/L KCl，5.6mmol/L Na2HPO4，2.0mmol/L KH2PO4、0.1％BSA、0.15μg/mL的碘化丙啶制成。
因此可以将该***端粒长度的检测试剂应用到***端粒长度的检测中；也可以应用于制备***端粒长度检测的检测试剂盒。
本实施例提供一种***端粒长度的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述***端粒长度的检测试剂。
实施例3
本实施例提供***端粒长度的检测试剂，该检测试剂主要包括对照微球和荧光标记探针。
对照微球含有5×105个/mL的有探针标记的微球，探针为(TTAGGG)n，n＝3000；微球的直径为7μm；荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝5；荧光标记探针的含量为6μg/mL。
还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；杂交缓冲液由70％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.7％BSA制成，杂交缓冲液的pH值7.1；洗涤缓冲液由60％甲酰胺，20mmol/LTris-HCl，0.7％BSA、0.1％Tween-20制成，洗涤缓冲液为pH值7.2；DNA染色液由0.11mol/LNaCl，5.5mmol/L KCl，3.2mmol/L Na2HPO4，1.1mmol/L KH2PO4、0.07％BSA、0.08μg/mL的碘化丙啶制成。
因此可以将该***端粒长度的检测试剂应用到***端粒长度的检测中；也可以应用于制备***端粒长度检测的检测试剂盒。
本实施例提供一种***端粒长度的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述***端粒长度的检测试剂。
实施例4
本实施例还提供***端粒长度的检测方法，本实施例以实施例3的检测试剂对样本进行检测，该检测方法包括以下步骤：
1.1取***样本以200g的速度离心处理30min，弃***得到***沉淀样本；
1.2用洗涤缓冲液稀释***沉淀样本至浓度为1×103个/mL***的稀释样本，与1×103个/mL对照微球混合，分装得到第一稀释样本和第二稀释样本；
1.3第一稀释样本和第二稀释样本分别加入50μL的杂交缓冲液，第一稀释样本中加入荧光标记探针，荧光标记探针的浓度为0.1μg/mL得到检测样本，第二稀释样本作为空白样本；
1.4将检测样本和空白样本分别于75℃热激20min后，于22℃混合杂交24h；
1.5在步骤1.4处理完的检测样本和空白样本中分别加入0.5mL的洗涤缓冲液，混匀后35℃预热20min，然后200g离心10min，去上清；并重复操作1-5次；然后加入0.5mL的洗涤缓冲液；
1.6在步骤1.5处理结束后再加入0.01mL的DNA染色液混匀，并在4℃避光染色60min；得到待检染色样本和待检空白样本；
1.7染色后的***样本用配备488nm激发器、525nm和575nm接收器的流式细胞仪上样收集荧光数据，进行***端粒长度检测；
1.8通过检测待检染色样本平均荧光强度占对照管待检空白样本平均荧光强度的比例，根据对照管微球的(TTAGGG)n标签长度，计算检测管相对端粒长度。
实施例5
本实施例还提供***端粒长度的检测方法，本实施例以实施例3的检测试剂对样本进行检测，该检测方法包括以下步骤；
1.1取***样本以1000g的速度离心处理5min，弃***得到***沉淀样本；
1.2用洗涤缓冲液稀释***沉淀样本至浓度为1×107个/mL***的稀释样本，与1×107个/mL对照微球混合，分装得到第一稀释样本和第二稀释样本；
1.3第一稀释样本和第二稀释样本分别加入500μL的杂交缓冲液，第一稀释样本中加入荧光标记探针，荧光标记探针的浓度为0.5μg/mL得到检测样本，第二稀释样本作为空白样本；
1.4将检测样本和空白样本分别于85℃热激4min后，于28℃混合杂交3h；
1.5在步骤1.4处理完的检测样本和空白样本中分别加入2mL的洗涤缓冲液，混匀后50℃预热5min，然后1000g离心5min，去上清；并重复操作1-5次；然后加入2mL的洗涤缓冲液；
1.6在步骤1.5处理结束后再加入0.05mL的DNA染色液混匀，并在28℃避光染色5min；得到待检染色样本和待检空白样本；
1.7染色后的***样本用配备488nm激发器、525nm和575nm接收器的流式细胞仪上样收集荧光数据，进行***端粒长度检测；
1.8通过检测待检染色样本平均荧光强度占对照管待检空白样本平均荧光强度的比例，根据对照管微球的(TTAGGG)n标签长度，计算检测管相对端粒长度。
实施例6
本实施例还提供***端粒长度的检测方法，本实施例以实施例3的检测试剂对样本进行检测，该检测方法包括以下步骤；
1.1取***样本以700g的速度离心处理20min，弃***得到***沉淀样本；
1.2用洗涤缓冲液稀释***沉淀样本至浓度为5×105个/mL***的稀释样本，与5×105个/mL对照微球混合，分装得到第一稀释样本和第二稀释样本；
1.3第一稀释样本和第二稀释样本分别加入200μL的杂交缓冲液，第一稀释样本中加入荧光标记探针，荧光标记探针的浓度为0.3μg/mL得到检测样本，第二稀释样本作为空白样本；
1.4将检测样本和空白样本分别于80℃热激12min后，于25℃混合杂交15h；
1.5在步骤1.4处理完的检测样本和空白样本中分别加入1.1mL的洗涤缓冲液，混匀后40℃预热14min，然后800g离心7min，去上清；并重复操作1-5次；然后加入1.2mL的洗涤缓冲液；
1.6在步骤1.5处理结束后再加入0.03mL的DNA染色液混匀，并在17℃避光染色20min；得到待检染色样本和待检空白样本；
1.7染色后的***样本用配备488nm激发器、525nm和575nm接收器的流式细胞仪上样收集荧光数据，进行***端粒长度检测；
1.8通过检测待检染色样本平均荧光强度占对照管待检空白样本平均荧光强度的比例，根据对照管微球的(TTAGGG)n标签长度，计算检测管相对端粒长度。
实验例
本实验例利用实施例6提供的***端粒长度的检测方法对***样本进行检测。检测结果如图1和图2所示，图1中是未加探针的空白样本和空白对照检测，图2是加了探针的检测样本和对照样本的检测结果。
从图1和图2的检测结果所示，未加探针的样本在荧光强度比加了探针的样本低一个量级，说明探针的检测效果明显；且可以明显的判断出样本和对照的区别。
综上所述，本发明实施例提供的***端粒长度的检测试剂、检测试剂盒应用到***端粒长度的检测中，能明显区分，检测得到相应数据，操作简单、结果易于判定、检测结果准确、稳定可靠、重复性好，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.***端粒长度的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂主要包括对照微球和荧光标记探针；所述对照微球含有1×103-1×107个/mL的有探针标记的微球，所述探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；所述微球的直径为4-10μm；所述荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2～7；所述荧光标记探针的含量为1-10μg/mL。
2.根据权利要求1所述的***端粒长度的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；所述杂交缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA制成，所述杂交缓冲液的pH值6.5-7.8；所述洗涤缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA、0.01-0.1％Tween-20制成，所述洗涤缓冲液为pH值6.5-7.8；所述DNA染色液由0.05-0.19mol/L NaCl，2.3-7.8mmol/L KCl，2.4-5.6mmol/LNa2HPO4，0.5-2.0mmol/L KH2PO4、0.01-0.1％BSA、0.02-0.15μg/mL的碘化丙啶制成。
3.如权利要求1或2所述的***端粒长度的检测试剂在端粒长度检测中的应用。
4.如权利要求1或2所述的***端粒长度的检测试剂在制备***端粒长度的检测试剂盒中的应用。
5.***端粒长度的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括对照微球和荧光标记探针；所述对照微球含有1×103-1×107个/mL的有探针标记的微球，所述探针为(TTAGGG)n，n＝100～10000；所述微球的直径为4-10μm；所述荧光标记探针为FITC-(CCCTAA)n，n＝2～7；所述荧光标记探针的含量为1-10μg/mL；还包括杂交缓冲液、洗涤缓冲液和DNA染色液；所述杂交缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA制成，所述杂交缓冲液的pH值6.5-7.8；所述洗涤缓冲液由50-80％甲酰胺，20mmol/L Tris-HCl，0.1-1％BSA、0.01-0.1％Tween-20制成，所述洗涤缓冲液为pH值6.5-7.8；所述DNA染色液由0.05-0.19mol/L NaCl，2.3-7.8mmol/L KCl，2.4-5.6mmol/LNa2HPO4，0.5-2.0mmol/L KH2PO4、0.01-0.1％BSA、0.02-0.15μg/mL的碘化丙啶制成。
6.***端粒长度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
取***样本离心，弃***得到***沉淀样本；用洗涤缓冲液稀释所述***沉淀样本，得到浓度为1×103-1×107个/mL***的稀释样本；
将所述稀释样本与对照微球混合，并分装得到第一稀释样本和第二稀释样本，所述第一稀释样本和所述第二稀释样本分别与50-500μL的杂交缓冲液混合，在所述第一稀释样本加入荧光标记探针，得到检测样本，所述第二稀释样本作为对照的空白样本；
将所述检测样本与所述空白样本进行热激、杂交后分别加入0.5-2mL的洗涤缓冲液，混匀预热、离心，去上清后分别加入0.5-2mL的所述洗涤缓冲液和0.01-0.05mL的DNA染色液进行避光染色，得到待检染色样本和待检空白样本；
将所述待检染色样本和所述待检空白样本分别进行流式细胞仪检测并计算得到样本端粒长度。
7.根据权利要求6所述的***端粒长度的检测方法，其特征在于，所述离心的速度为200g-1000g，时间为5-30min；所述对照微球的浓度为1×103-1×107个/mL。
8.根据权利要求6所述的***端粒长度的检测方法，其特征在于，所述荧光标记探针的终浓度为0.1-0.5μg/mL；所述热激的温度为75-85℃，时间为4-20min。
9.根据权利要求6所述的***端粒长度的检测方法，其特征在于，所述杂交的温度为22-28℃，时间为3-24h；所述预热的温度为35-50℃，时间为5-20min；所述避光染色的温度为4-28℃，时间为5-60min。
10.根据权利要求9所述的***端粒长度的检测方法，其特征在于，所述流式细胞仪的激发波长为488nm，接收波长为525nm和575nm。
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