CN108913655B - 基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法。该方法是将培养至30天左右的由多能干细胞分化而成的心肌细胞重悬后接种至12孔板，每孔1.5×106细胞。约24小时细胞贴壁，可开始进行佛波醇‑12‑肉豆蔻酸酯‑13‑乙酸酯加药实验，按照1μM浓度进行诱导，作用4天。本发明可基于多能干细胞技术建立稳定的人源性心肌肥大模型，形态与功能均符合心肌细胞肥大特征，操作方便，且造模成功率高。
Description
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法，可用于心肌肥大的机制研究及其治疗和预防药物的研发。
背景技术：
肥厚性心肌病是最为常见的心脏病之一，在普通人群中的发病率为0.2-0.5％，我国至少有两百万肥厚性心肌病患者，其主要病理变现为心肌肥大。心肌肥大是由各种触发心肌工作量增加的疾病而引起，如高血压、瓣膜功能不全、心肌梗塞、遗传性疾病、内分泌失调等，是心肌工作超负荷的一种适应性反应，最终导致心力衰竭、恶性心律失常甚至心源性猝死，严重危害人类健康。目前进行心肌肥大研究所应用的模型包括：小鼠和大鼠模型、离体心脏Langendorff模型、非灵长类动物或无限增殖细胞系中分离的心肌细胞模型。然而，这些非人源性疾病模型与人类在各种生理***上存在很大差异(例如人心肌细胞的搏动频率是60次/分，而小鼠的搏动频率是400-600次/分)，很多研究结果不能直接应用于人类。因此，如何建立一个“人源性”心肌细胞模型对于心肌肥大的研究十分重要。
人多能干细胞(包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞)的出现为转化医学和再生医学提供了强大的动力和革命性的模式转变，拉近了干细胞用于临床疾病治疗的距离，在疾病模型建立、疾病分子机制研究以及新药研发等方面具有巨大的潜在价值。与人成体干细胞相比，人多能干细胞的一个明显优势在于它的多能性，而正是这种多能性，赋予了它可以分化成为人体内任意一种细胞的能力，如心肌细胞、血管细胞、神经细胞、肝脏细胞等。对于心血管疾病研究而言，人原代心肌细胞是最理想的细胞资源，然而很难获取，且体外培养条件苛刻，因此其应用受到很大限制。应用心肌分化技术，可以将人多能干细胞分化成为心肌细胞，这些多能干细胞来源的心肌细胞携带人类基因组、具有“人源性”生理内环境、获取相对容易并可体外长期培养，是目前已知的与人原代心肌细胞最为相似的细胞资源。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法，以解决现有造模技术中缺乏“人源性”心肌肥大模型的问题，为心肌肥大的机制研究及其治疗和预防药物研发提供可靠的人源性模型。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法包括如下步骤：
1)多能干细胞定向分化获得心肌细胞；
2)吸尽心肌细胞陈旧培养基，杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗，每孔加入1ml的胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃培养箱消化，使用DMEM/F12培养基中和消化液并收集细胞悬液至离心管中，离心后加入心肌细胞培养基(RPMI+B27+Insulin)，以1:8-1:12的比例接种到基质胶(Matrigel)包被的12孔板，每孔1.5×106个细胞，24小时贴壁；
3)进行PMA加药实验，每孔加入终浓度为1μM的PMA溶液1.2ml，作用4天，获得心肌肥大模型。
优选的，所述的多能干细胞为胚胎干细胞或者诱导多能干细胞。
优选的，所述的步骤1)具体为：
采用小分子化合物诱导的2D单层分化方案，其基本技术路线是第0-1天完成胚胎干细胞向中胚层的诱导转化，第1-3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转化，第4-7天完成中胚层向心肌细胞的诱导转化，第7天之后主要是心肌细胞的成熟过程。首先将多能干细胞如H9胚胎干细胞按1:8-1:12的比例接种至6孔板中，每日更换培养基，当细胞密度达到80％左右可进行分化操作，在第0天，吸尽陈旧培养基，心肌分化培养基(RPMI+B27-Insulin)清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的分化培养基2ml，2天后更换成心肌分化培养基，每孔2ml，第3天，每孔加入含5μM的IWR的心肌分化培养基2ml，继续培养2天。第5天更换成心肌分化培养基。第7天以后更换成心肌细胞培养基，此时如果分化效果良好可看到成片跳动的心肌细胞。
优选的，所述的心肌分化培养基(RPMI+B27-Insulin)中，B27-Insulin占总培养基总量的2％。
优选的，所述的心肌细胞培养基(RPMI+B27+Insulin)中，B27+Insulin占总培养基总量的2％。
优选的，所述步骤2)离心条件为:1000rpm/min，离心5分钟。
附图说明
图1为基于多能干细胞技术建立心肌肥大模型的方法步骤简图。
图2为未处理组和PMA诱导组心肌细胞大小比较的柱状图。
图3为未处理组和PMA诱导组心肌细胞中多核细胞比例比较的柱状图。
图4为未处理组和PMA诱导组心肌细胞中心肌肥大标志物ANF荧光强度比较的柱状图。
图5为未处理组和PMA诱导组心肌细胞中心肌肥大标志物ANF基因表达比较的柱状图。
具体实施方式
1)多能干细胞定向分化获得心肌细胞：首先将多能干细胞如H9胚胎干细胞按1:8-1:12的比例接种至6孔板(Corning)中，每日更换干细胞培养基mTeSR(STEM CELLTechnology)，当细胞密度达到80％左右可进行分化操作。在第0天，吸尽陈旧培养基，心肌分化培养基(RPMI+B27-Insulin)(Gibco)清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR(Medchem Axon)的分化培养基2ml，2天后更换成心肌分化培养基，每孔2ml，第3天，每孔加入含5μM的IWR(Medchem Axon)的心肌分化培养基2ml，继续培养2天。第5天更换成心肌分化培养基。第7天以后更换成心肌细胞培养基(RPMI+B27+Insulin)(Gibco)，此时如果分化效果良好可看到成片跳动的心肌细胞。
2)心肌肥大模型的建立：选用分化后培养至30天左右的心肌细胞，吸尽陈旧培养基，以杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)(Gibco)清洗，每孔加入1ml的胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco)，37℃培养箱消化，使用DMEM/F12培养基(Gibco)中和消化液并收集细胞悬液至离心管中，离心后加入心肌细胞培养基(RPMI+B27+Insulin)(Gibco)，以1:8-1:12的比例接种到基质胶(Matrigel)(BD)包被的12孔板(Corning)，每孔1.5×106个细胞，24小时贴壁，进行PMA加药实验，每孔加入终浓度为1μM的PMA(Sigma Aldrich)溶液1.2ml，作用4天，获得心肌肥大模型(图1)。
3)心肌肥大模型的鉴定：PMA诱导后的心肌细胞通过免疫染色和荧光定量PCR实验进行形态和功能的鉴定。应用心肌特异性标志物TNNT2(Abcam)和α-actinin(Abcam)进行心肌细胞免疫染色，结果显示，与未处理组相比，PMA诱导组心肌细胞大小显著增大(图2)，多核细胞显著增加(图3)；应用心肌特异性标志物TNNT2(Abcam)和心肌肥大特异性标志物心房钠尿因子(Atrial natriurelic factor，ANF)共染色，结果显示：PMA诱导组心肌细胞中的ANF信号显著增强(图4)；荧光定量PCR实验结果显示：PMA诱导组心肌细胞中的ANF基因表达显著上调(图5)。以上实验结果证实了经PMA诱导后的心肌细胞具有明确的心肌肥大特征。
4)心肌肥大模型的应用：本发明研究结果表明，应用多能干细胞技术可以建立可靠的“人源性”心肌肥大模型，本发明的研究可以解决现有造模技术中缺乏“人源性”心肌肥大模型的问题，为心肌肥大的机制研究及其治疗和预防药物研发提供可靠的人源性模型。
Claims (1)
1.一种基于多能干细胞技术建立“人源性”心肌肥大模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）多能干细胞定向分化获得心肌细胞：首先将H9胚胎干细胞按1:8-1:12的比例接种至6孔板中，每日更换干细胞培养基mTeSR，当细胞密度达到80%时进行分化操作，在第0天，吸尽陈旧干细胞培养基mTeSR，心肌分化培养基清洗一遍，每孔加入8 μM的CHIR和2 ml心肌分化培养基，2天后更换成心肌分化培养基，每孔2 ml，第3天，每孔加入5 μM的IWR和2 ml心肌分化培养基，继续培养2天，第5天更换成心肌分化培养基，第7天以后更换成心肌细胞培养基，
2）心肌肥大模型的建立：选用分化后培养至30天的心肌细胞，吸尽陈旧培养基，以杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗，每孔加入1 ml的胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃培养箱消化，使用DMEM/F12培养基中和消化液并收集细胞悬液至离心管中，离心后加入心肌细胞培养基，以1:8-1:12的比例接种到基质胶Matrigel包被的12孔板，每孔1.5×106个细胞，24小时贴壁，进行PMA加药实验，每孔加入终浓度为1 μM的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）溶液1.2 ml，作用4天，获得心肌肥大模型；
所述步骤1）和2）中所使用的心肌分化培养基为基础培养基RPMI加不含胰岛素的B27，其中，不含胰岛素的B27占总培养基总量的2%；
所述步骤1）和2）中所使用的心肌细胞培养基为基础培养基RPMI加含有胰岛素的B27，含有胰岛素的B27占总培养基总量的2%。
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Non-Patent Citations (4)
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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