CN108904490A - 赶黄草中二氢黄酮衍生物在制备抗肝细胞脂肪变性的药物中的应用 - Google Patents

赶黄草中二氢黄酮衍生物在制备抗肝细胞脂肪变性的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及赶黄草中二氢黄酮衍生物在制备抗肝细胞脂肪变性的药物中的应用。所述二氢黄酮衍生物的结构式如式Ⅰ‑1、Ⅰ‑2或Ⅰ‑3所示。本发明研究了赶黄草浸膏中3个二氢黄酮的抗肝细胞脂肪变性的作用。采用MCI柱将赶黄草浸膏分为5个组分，选取组分V中的3个特征性二氢黄酮得到乔松素(PCB)、乔松素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(PCBG)、5‑甲氧基‑乔松素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(MPG)，采用游离脂肪酸诱导HepG2细胞损伤模型考察PCBG、PCB、MPG对细胞活性、脂质含量、TC、TG、ALT、AST、MDA、SOD和GSH‑Px的水平的影响。结果表明赶黄草浸膏中3个特征二氢黄酮均具有抗肝细胞脂肪变性的活性。

Description

赶黄草中二氢黄酮衍生物在制备抗肝细胞脂肪变性的药物中 的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及赶黄草中二氢黄酮衍生物在制备抗肝细胞脂肪变性的药物中的应用。
背景技术
近年来非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)的全球发病率逐年增加，随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，NAFLD已成为我国常见的慢性肝病之一，在我国大中城市的发病率已达15％-25％。其中10％病人发展成非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)，近30％的病人可发展为肝硬化，甚至有些病人可发展为肝癌。目前普遍认为NAFLD是一种遗传-环境-代谢-应激相关性疾病，与肥胖、糖尿病、高脂血症、代谢综合征及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)密切相关。对NAFLD的治疗主要根据其发病机制针对疾病的不同病理环节，通过改善胰岛素抵抗、抗氧化、抗炎、保肝及降脂等方面促进肝内脂肪和炎症消失，防止肝细胞死亡和纤维化。通过研究证实，许多天然药物具有抗氧化、抗炎症或增加胰岛素敏感性的作用，对改善NAFLD疗效显著，因此开展中药有效部位和成分对于治疗非酒精性脂肪肝的研究能够充分体现中医药在治疗NAFLD方面的独特优势，结合长期临床实践经验，辅以严格的质量控制，将是未来创新药物的研发趋势。
赶黄草(Penthorum chinense Pursh.)又名水泽兰、水杨柳、扯根菜等，是虎耳草科(Saxifragaceae)扯根菜属植物扯根菜的地上部分，是苗族传统药物，主要分布于我国四川及云贵一带，以四川古蔺县为道地产地。其性温，味甘，具有清热解毒、活血化瘀、利水消肿、退黄、平肝的功效。以赶黄草为原料制成的赶黄草饮片、成药肝苏颗粒、肝苏胶囊等，具有降酶、保肝、退黄、健脾的功能。目前从赶黄草中分离得到了黄酮类、萜类等化学成分。赶黄草的保肝作用主要表现在对酒精性脂肪肝的保护作用、抗肝纤维化和治疗乙型肝炎等方面，肝苏颗粒已在临床上广泛用于改善慢性乙型肝炎和肝纤维化的症状。而对非酒精性脂肪肝的干预作用研究报道较少。
发明内容
本发明的目的是提供二氢黄酮衍生物的药物新用途。
本发明所提供的二氢黄酮衍生物的新用途是其在制备如下产品中的应用：
1)抗肝细胞脂肪变性的药物；
2)减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积的药物；
3)提高肝细胞的抗氧化能力的药物；
4)增强肝细胞抵抗损伤能力的药物；
5)预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物。
所述二氢黄酮衍生物，其结构式如式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3所示：
式Ⅰ-1所示化合物的名称为乔松素，简称PCB；
式Ⅰ-2所示化合物的名称为乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷，简称PCBG；
式Ⅰ-3所示化合物的名称为5-甲氧基-乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷，简称MPG。
上述式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3所示化合物可从赶黄草中提取得到。
所述提取包括：采用MCI柱将赶黄草浸膏分离为水提取部位、组分II、组分III、组分IV及组分V，进一步分离组分V，得到乔松素、乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷和5-甲氧基-乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
所述赶黄草浸膏可购自四川古蔺肝苏药业有限公司，也可通过包括下述步骤的方法制备得到：
将赶黄草地上部分加水煎煮，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15-1.18(60-65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收乙醇并浓缩成相对密度为1.30-1.32的稠膏，即得。
所述水提取部位、组分II、组分III、组分IV及组分V分别通过下述操作获得：采用MCI柱将赶黄草浸膏依次用水、体积浓度20％的乙醇溶液、体积浓度40％的乙醇溶液、体积浓度60％的乙醇溶液及体积浓度85％的乙醇溶液进行洗脱，分别收集洗脱液，得到水提取部位、组分II、组分III、组分IV及组分V。
所述组分V通过下述操作进一步分离得到式Ⅰ-1所示化合物、式Ⅰ-2所示化合物和式Ⅰ-3所示化合物：将组分V中Fr.30流份经甲醇反复重结晶得到PCBG；将Fr.32和Fr.35用半制备高效液相色谱制得MPG和PCB；
其中，制备色谱条件为：色谱柱：Hibar 250-10column(10×250mm，5μm)；流动相：A-乙腈，B-水；梯度洗脱：0-10min 20％A，10-50min 20％-50％A，50-60min50％A；流速：3mL/min。
上述由赶黄草浸膏分离得到的组分V及其在制备下述产品中的应用也属于本发明的保护范围：
1)抗肝细胞脂肪变性的药物；
2)减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积的药物；
3)提高肝细胞的抗氧化能力的药物；
4)增强肝细胞抵抗损伤能力的药物；
5)预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物。
本发明还提供一种抗肝细胞脂肪变性的药物、减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积的药物、提高肝细胞的抗氧化能力的药物、增强肝细胞抵抗损伤能力的药物，和/或预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物，所述药物包含上述式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3所示二氢黄酮衍生物。
本发明研究了赶黄草浸膏中3个二氢黄酮的抗肝细胞脂肪变性的作用。采用MCI柱将赶黄草浸膏分为5个组分，选取组分V中的3个特征性二氢黄酮得到乔松素、乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、5-甲氧基-乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷，采用游离脂肪酸诱导HepG2细胞损伤模型考察PCBG、PCB、MPG对细胞活性、脂质含量、TC、TG、ALT、AST、MDA、SOD和GSH-Px的水平的影响。结果表明赶黄草浸膏中3个特征二氢黄酮均具有抗肝细胞脂肪变性的活性。
附图说明
图1为赶黄草浸膏及不同浓度乙醇洗脱部位的HPLC色谱图，其中：A-赶黄草浸膏；B-组分II；C-组分III；D-组分IV；E-组分V。
图2为赶黄草各组分对FFA诱导的HepG2细胞模型的细胞存活率，其中：A-组分II；B-组分III；C-组分IV；D-组分V。
图3为HepG2细胞油红O染色镜下图(400×)，其中：A：正常组；B：模型组；C：FFA-II；D：FFA-III；E：FFA-IV；F：FFA-V。
图4为油红O染色测定HepG2细胞脂质含量，与正常组比较，**p<0.01；与模型组比较，Δp<0.05，△△p<0.01。
图5为HepG2细胞中(A)TG、(B)TC、(C)AST和(D)ALT水平，HepG2细胞中(A)TG、(B)TC、(C)AST和(D)ALT水平。
图6为HepG2细胞中MDA含量，与空白组比较，**p<0.01；与模型组比较，Δp<0.05，△△p<0.01。
图7为不同浓度PCBG、PCB和MPG对FFA诱导的HepG2细胞模型的细胞抑制率。
图8为油红O染色不同组别镜下图(400×)及脂质含量。
图9为HepG2细胞中(A)TC、(B)TG、(C)ALT和(D)AST水平，结果以mean±SD显示，##P<0.01vs control,*P<0.05vs model,**P<0.01vs model。
图10为HepG2细胞中(A)SOD、(B)MDA和(C)GSH-Px水平，结果以mean±SD显示，#P<0.05vs control,##P<0.01vs control,*P<0.05vs model,**P<0.01vsmodel。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、实验材料
1.1试剂
MCI GEL CHP/CHPMG树脂(聚苯乙烯基反相树脂)，三菱精细化学；乙腈(色谱纯)，美国FISHER试剂公司；95％乙醇，国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水，娃哈哈纯净水；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基、PBS溶液(pH 7.4)及0.25％胰蛋白酶含EDTA，美国Gibco公司；MTT、油酸(OA)、棕榈酸(PA)、牛血清白蛋白(BSA)、细胞级二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；BCA蛋白含量检测试剂盒，KeyGEN BioTECH公司；油红O染色试剂盒、甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(TC)测试盒、谷丙转氨酶(ALT)测试盒、谷草转氨酶(AST)测试盒、丙二醛(MDA)含量测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒，南京建成生物公司；超纯水，实验室Mili-Q纯水机制备；其它试剂均为分析纯。
1.2实验细胞
人的肝癌细胞系HepG2细胞，购自American Type Culture Collection(ATCC)。
1.3实验样品
赶黄草浸膏购自四川古蔺肝苏药业有限公司，由该公司高级工程师张丽鉴定为赶黄草Penthorum chinense Pursh.的地上部分的提取物，其制备方法为：取赶黄草1000g，切碎，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15-1.18(60-65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤三次，合并洗液与滤液，回收乙醇并浓缩成相对密度为1.30-1.32的稠膏。浸膏现存于首都医科大学基础科研楼中药药效物质基础研究实验室，编号为:111138。
乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷(PCBG)、乔松素(PCB)、5-甲氧基-乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷(MPG)(首都医科大学中医药学院自制。经UV、1H-NMR、13C-NMR、IR、MS鉴别确定其化学结构，采用HPLC-UV法，在280nm波长处检测，峰面积归一化计算纯度均大于98％)。
1.4实验仪器
ESCD AC2-4S1超净生物安全柜(美国Thermo公司)，371型二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司)，MSL-3020高压灭菌器(日本SANYO公司)，XDTD-8222恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，W-01B数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)，血球计数板(上海求精生化公司)，Transferpette-S单道可调移液枪(0.1-1μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(0.5-10μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(10-100μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(20-200μL)、Transferpette-S单道可调移液枪(100-1000μL)(德国Brand公司)，5100-0001型程序降温盒(美国Thermo公司)，LWD300-38LTI三目倒置相差显微镜(上海测维光电公司)，SpectraMax Plus 384全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)，Millex GV 0.22μm针头滤器(美国Millipore公司)，ECLIPSE 80i高级研究型显微镜(日本Nikon公司)，ME235S十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，KQ5200DV数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，25mL细胞培养瓶、96孔培养板、6孔培养板(美国Corning公司)，15mL离心管、50mL离心管、2mL冻存管(美国Corning公司)，TDL-60B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，BCD-254冰箱(德国SIEMENS公司)，ULT-2186-4-v49超低温冰箱(美国Thermo公司)，Primo Vert倒置显微镜(德国Carl Zeiss公司)。
2、实验方法及结果
2.1活性部位筛选
2.1.1赶黄草浸膏不同洗脱部位的制备
用体积浓度50％乙醇溶液溶解赶黄草浸膏，经MCI柱分别采用水、体积浓度20％乙醇溶液、体积浓度40％乙醇溶液、体积浓度60％乙醇溶液和体积浓度85％乙醇溶液进行洗脱，得到20％洗脱部位(组分II)、40％洗脱部位(组分III)、60％洗脱部位(组分IV)和85％洗脱部位(组分V)。
用高效液相色谱法测定赶黄草浸膏、组分II、组分III、组分IV、组分V，如图1。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent SB C18柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以0.2％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱梯度为0-65min，10％-50％B；柱温30℃；流速1.0mL/min；检测波长为280nm。
2.1.2赶黄草浸膏各组分的体外活性筛选
分别称取组分II、组分III、组分IV和组分V 6.8mg、12mg、13.2mg和16mg，用100μLDMSO溶解为68mg/mL、120mg/mL、132mg/mL、160mg/mL的母液，使用前用含0.5％BSA的DMEM完全培养基稀释至使用浓度，过0.22μm滤膜。
取对数生长期的HepG2细胞，以5×104cell/孔的密度接种于96孔板中，培养24h待细胞贴壁稳定生长后，加入0.8mM FFA造模，同时分别给予细胞不同浓度的赶黄草各组分，使终浓度分别为组分II 8.5,17,34,85,170,340μg/mL，组分III 10,50,100,300,600μg/mL，组分IV 33,66,165,330,660μg/mL，组分V 10,50,100,200μg/mL。同时设置空白对照组和模型组，每组均设6个平行复孔，37℃、5％CO2继续培养24h后，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，混匀，于37℃、5％CO2继续培养4h后，吸弃孔中培养基，加入100μL DMSO溶解，混匀，用MTT比色法测定细胞增殖情况(以490nm下吸光度OD值表示)。结果如图2所示。最终设置给药浓度分别为：组分II 17μg/mL；组分III 300μg/mL；组分IV 66μg/mL；组分V 100μg/mL。
将1.8×1.8cm的无菌盖玻片放入6孔板内，制作细胞爬片。取对数生长期的HepG2细胞，以2×105cell/孔的密度接种于装有盖玻片的6孔板中，培养24h待细胞贴壁稳定生长后，对照组加入0.5％BSA的DMEM完全培养基，模型组加入0.8mM FFA，给药组分别加入0.8mMFFA和组分II 17μg/mL、组分III 300μg/mL、组分IV 66μg/mL、组分V 100μg/mL，37℃、5％CO2继续培养24h。按照油红O染色试剂盒的说明书操作，封片后镜下观察细胞红色脂滴的情况，各组脂质分布如图3所示。用PBS洗2-3次，每孔用0.5mL异丙醇溶解脂滴，振荡5min，待摇匀后，酶标仪510nm下检测(以吸光度OD值表示)，以模型组吸光度为100％，各组脂质含量结果见图4。
取对数生长期的HepG2细胞，以1×106cell/孔的密度接种于直径为10cm的培养皿中，培养24h待细胞贴壁稳定生长后，对照组加入0.5％BSA的DMEM完全培养基，模型组加入0.8mM FFA，给药组分别加入0.8mM FFA和组分II 17μg/mL、组分III 300μg/mL、组分IV 66μg/mL、组分V 100μg/mL，37℃、5％CO2继续培养24h。收集细胞，用1mL PBS缓冲液溶解，超声破碎法冰浴破碎3次，每次10s。BCA法测定细胞的蛋白含量，按照甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(TC)测试盒、谷丙转氨酶(ALT)测试盒、谷草转氨酶(AST)测试盒及丙二醛(MDA)试剂盒方法进行测定。
0.8mM FFA诱导HepG2细胞24h后，细胞悬液中TC和TG含量明显增加，ALT和AST水平也明显升高，与正常对照组相比较，差异具有统计学意义(p<0.01)；给予赶黄草各组分干预的各组，细胞悬液中TC和TG含量较模型组均有所下降，以组分II和组分III给药组较为显著(p<0.05)；细胞悬液中ALT和AST水平较模型组均有所下降(p<0.01)，其中以组分IV和组分V给药组最为显著。结果见图5。
0.8mM FFA诱导HepG2细胞24h后，细胞悬液中MDA含量明显增加，与正常对照组相比较，差异具有统计学意义(p<0.01)；给予赶黄草各组分干预后，各组细胞悬液中MDA含量较模型组均有所下降，以组分V给药组较为显著(p<0.01)。见图6。
将组分V中Fr.30流份经甲醇反复重结晶得到PCBG；将Fr.32和Fr.35用半制备高效液相色谱制得MPG和PCB。制备色谱条件为色谱柱：Hibar 250-10column(10×250mm，5μm)；流动相：A-乙腈，B-水；梯度洗脱：0-10min 20％A，10-50min20％-50％A，50-60min 50％A；流速：3mL/min。
5-甲氧基-乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷(MPG)：
白色针状结晶(甲醇-丙酮)，ESI-MS m/z 433.1488[M+H]+,1H NMR(600MHz,CD3OD)δ:5.47(1H,dd,J＝12.6,3.0Hz,H-2),3.04(1H,dd,J＝16.8,12.6Hz,H-3α),2.77(1H,dd,J＝16.8,3.0Hz,H-3β),6.38(1H,d,J＝1.8Hz,H-6),6.41(1H,d,J＝2.4Hz,H-8),7.49(2H,d,J＝7.8Hz,H-2',6'),7.39(3H,m,H-3',4',5'),5.01(1H,d,J＝7.8Hz,H-1”),3.20-4.00(5H,m,H-2”,3”,4”,5”,6”)，3.87(3H，s，MeO)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δ:80.6(C-2),46.7(C-3),192.2(C-4),164.0(C-5),98.3(C-6),166.0(C-7),95.6(C-8),166.4(C-9),107.8(C-10),140.6(C-1'),127.5(C-2',6'),129.8(3',4',5'),101.8(C-1”),74.9(C-2”),78.1(C-3”),71.6(C-4”),78.7(C-5”),62.7(C-6”)，56.7(MeO).
乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷(PCBG):
白色针状结晶(甲醇-丙酮)，ESI-MS m/z 417[M-H]-,1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:5.66(1H,dd,J＝12.6,3.0Hz,H-2),3.15(1H,dd,J＝16.8,12.6Hz,H-3α),2.86(1H,dd,J＝16.8,3.0Hz,H-3β),6.17(1H,d,J＝2.4Hz,H-6),6.21(1H,d,J＝2.4Hz,H-8),7.54(2H,d,J＝8.4Hz,H-2',6'),7.43(3H,m,H-3',4',5'),4.98(1H,d,J＝9.0Hz,H-1”),3.70(5H,m,H-2”,3”,4”,5”,6”)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:79.1(C-2),42.7(C-3),197.3(C-4),163.0(C-5),97.1(C-6),165.8(C-7),96.0(C-8),163.4(C-9),103.8(C-10),139.0(C-1'),127.2(C-2',6'),129.1(3',4',5'),100.1(C-1”),73.5(C-2”),76.8(C-3”),70.0(C-4”),77.5(C-5”),61.0(C-6”).
乔松素(PCB):
白色羽状结晶(甲醇)，ESI-MS m/z 255[M-H]-,1H NMR(600MHz,MeOD)δ:5.46(1H,dd,J＝12.6,3.0Hz,H-2),3.09(1H,dd,J＝16.8,12.6Hz,H-3α),2.78(1H,dd,J＝16.8,3.0Hz,H-3β),5.60(1H,d,J＝2.4Hz,H-6),5.92(1H,d,J＝2.4Hz,H-8),7.49(2H,m,H-2',6'),7.36～7.41(3H,m,H-3',4',5')；13C NMR(150MHz,MeOD)δ:80.7(C-2),44.4(C-3),197.5(C-4),164.9(C-5),97.4(C-6),168.6(C-7),96.5(C-8),165.7(C-9),103.6(C-10),140.6(C-1'),129.9(C-2',6'),129.8(3',4'),127.5(C-5')。
3.1PCBG、PCB和MPG抗肝细胞脂肪变性活性
用含0.5％BSA的DMEM完全培养基将PCBG、PCB和MPG的储备液稀释至1mM，用0.22μm滤膜过滤。
取对数生长期的HepG2细胞，以5×104cell/孔的密度接种于96孔板中，培养24h待细胞贴壁稳定生长后，分别加入0.8mM FFA和一定体积的1mM PCBG、PCB和MPG使终浓度为10，50，100，250μM，每组均设6个平行复孔，于37℃、5％CO2继续培养24h后，每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，混匀，于37℃、5％CO2继续培养4h后，吸弃孔中培养基，加入100μL DMSO溶解，混匀，用MTT比色法测定细胞增殖情况(以490nm下吸光度OD值表示)，结果如图7所示。最终分别设置高、中、低给药浓度为：PCBG 10,1,0.1μM；PCB 100,10,1μM；MPG 100,10,1μM。
将1.8×1.8cm的无菌盖玻片放入6孔板内，制作细胞爬片。取对数生长期的HepG2细胞，以2×105cell/孔的密度接种于装有盖玻片的6孔板中，培养24h待细胞贴壁稳定生长后，对照组加入0.5％BSA的DMEM完全培养基，模型组加入0.8mM FFA，给药组分别加入0.8mMFFA和高、中、低剂量的PCBG、PCB和MPG，37℃、5％CO2继续培养24h。按照油红O染色试剂盒的说明书操作，封片后镜下观察细胞红色脂滴的情况。用PBS洗2-3次，每孔用0.5mL异丙醇溶解脂滴，振荡5min，待摇匀后，酶标仪510nm下检测(以吸光度OD值表示)，以模型组吸光度为100％，各组脂质含量结果见图8。
取对数生长期的HepG2细胞，以1×106cell/孔的密度接种于直径为10cm的培养皿中，培养24h待细胞贴壁稳定生长后，对照组加入0.5％BSA的DMEM完全培养基，模型组加入0.8mM FFA，给药组分别加入0.8mM FFA和高、中、低剂量的PCBG、PCB和MPG，37℃、5％CO2继续培养24h。收集细胞，用1mL PBS缓冲液溶解，超声破碎法冰浴破碎3次，每次10s。BCA法测定细胞的蛋白含量，按照甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(TC)测试盒、谷丙转氨酶(ALT)测试盒、谷草转氨酶(AST)测试盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒方法进行测定。
0.8mM FFA诱导HepG2细胞24h后，细胞悬液中TC和TG含量明显增加，ALT和AST水平也明显升高，与空白对照组相比较，差异具有统计学意义(p<0.01)；给予高中低浓度PCBG、PCB和MPG干预的各组，细胞悬液中TC和TG含量较模型组均有所下降，以PCBG高中剂量组较为显著(p<0.05)；细胞悬液中ALT和AST水平较模型组均有所下降(p<0.01)，结果具有统计学差异。见图9。
0.8mM FFA诱导HepG2细胞24h后，细胞悬液中MDA含量明显增加(p<0.01)，SOD活性有所降低(p<0.01)，GSH-Px水平也明显降低(p<0.05)，与空白对照组相比较，差异具有统计学意义；给予高中低浓度PCBG、PCB和MPG干预的各组，细胞悬液中MDA含量较模型组均明显下降(p<0.01)，以高剂量MPG组最为显著；SOD活性有所上升(p<0.05)，GSH-Px水平明显升高(p<0.01)，以高剂量MPG组最为显著。结果见图10。
上述实验结果表明，赶黄草浸膏中PCB、PCBG、MPG三个二氢黄酮能够减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积，提高细胞的抗氧化能力，增强肝细胞抵抗损伤能力。

Claims (9)

1.式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3所示二氢黄酮衍生物在制备如下产品中的应用：
1)抗肝细胞脂肪变性的药物；
2)减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积的药物；
3)提高肝细胞的抗氧化能力的药物；
4)增强肝细胞抵抗损伤能力的药物；
5)预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3所示二氢黄酮衍生物从赶黄草中提取得到。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述提取包括：采用MCI柱将赶黄草浸膏分离为水提取部位、组分II、组分III、组分IV及组分V，进一步分离组分V，得到乔松素、乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷和5-甲氧基-乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述赶黄草浸膏通过包括下述步骤的方法制备得到：
将赶黄草地上部分加水煎煮，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15-1.18的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收乙醇并浓缩成相对密度为1.30-1.32的稠膏，即得。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述水提取部位、组分II、组分III、组分IV及组分V分别通过下述操作获得：采用MCI柱将赶黄草浸膏依次用水、体积浓度20％的乙醇溶液、体积浓度40％的乙醇溶液、体积浓度60％的乙醇溶液及体积浓度85％的乙醇溶液进行洗脱，分别收集洗脱液，得到水提取部位、组分II、组分III、组分IV及组分V。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述组分V通过如下操作进一步分离得到式Ⅰ-1所示化合物、式Ⅰ-2所示化合物和式Ⅰ-3所示化合物：将组分V中Fr.30流份经甲醇反复重结晶得到PCBG；将Fr.32和Fr.35用半制备高效液相色谱制得MPG和PCB；
其中，制备色谱条件为：色谱柱：Hibar 250-10column(10×250mm，5μm)；流动相：A-乙腈，B-水；梯度洗脱：0-10min 20％A，10-50min 20％-50％A，50-60min 50％A；流速：3mL/min。
7.权利要求3中所述的由赶黄草浸膏分离得到的组分V。
8.权利要求7所述的由赶黄草浸膏分离得到的组分V在制备如下产品中的应用：
1)抗肝细胞脂肪变性的药物；
2)减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积的药物；
3)提高肝细胞的抗氧化能力的药物；
4)增强肝细胞抵抗损伤能力的药物；
5)预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物。
9.一种抗肝细胞脂肪变性的药物、减少游离脂肪酸造成的肝细胞的脂质蓄积的药物、提高肝细胞的抗氧化能力的药物、增强肝细胞抵抗损伤能力的药物或预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物，其特征在于：所述药物包含权利要求1中式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3所示二氢黄酮衍生物；
或，所述药物包含权利要求7所述的由赶黄草浸膏分离得到的组分V。
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