CN108888613A - 和厚朴酚在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途 - Google Patents

和厚朴酚在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了和厚朴酚在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途。实验结果表明，和厚朴酚可以通过上调CFLAR、NRF2、PPARα的表达及CAT、GSH‑Px和HO‑1的活性，抑制JNK的磷酸化和CYP4A、CYP2E1的表达，从而预防MCD饮食诱导的肝脏脂肪变性和氧化应激损伤，对NASH的发生发展具有一定预防和治疗作用。

Description

和厚朴酚在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途
技术领域
本发明属于制药领域，涉及和厚朴酚的制药新用途，尤其是在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的新用途。
背景技术
非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪贮积变性和肝细胞炎症为特征的临床病理综合征。NASH的发生与脂质代谢紊乱及氧化应激密切相关。迄今为止，还没有有效的医疗干预措施能完全扭转这种疾病。
和厚朴酚(Honokiol，HNK)是传统中药厚朴的主要化学活性成分之一，据文献报道HNK具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、降低胆固醇及提高神经***敏感性等药理作用。但HNK对NASH是否有预防和治疗作用，目前尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是针对NASH作为全世界一个重要医学难题，目前为止还未被完全攻克，缺少临床治疗药物的技术现状，提供和厚朴酚在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的新用途。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
以雄性C57BL小鼠为实验对象，通过喂食胆碱和蛋氨酸缺乏饲料(MCD)建立NASH模型。实验设正常对照组(喂食模型对照MCS饮食)，模型组(喂食MCD饮食)和HNK给药低、高计量组(喂食MCD饮食)。给药组小鼠在造模期间每日灌胃HNK(10和20mg/kg)一次，正常对照组和模型组小鼠每日灌胃等体积生理盐水一次。六周后眼眶取血并脱颈处死，取肝脏保存。肝切片经HE染色和油红O染色观察组织病理学变化；试剂盒检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活力值，肝组织匀浆中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)的含量，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和氧化应激诱导性血红素加氧酶(HO-1)的活性；实时荧光定量PCR检测肝组织中酰基辅酶A氧化酶(ACOX)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)、肉碱棕榈酸转移酶1(CPT1α)、脂肪酸结合蛋白5(FABP5)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、甘油3磷酸酰基转移酶(GPAT)和微粒体甘油三酯转移蛋白酶(MTTP)；蛋白印迹法检测肝组织中CASP8和FADD样凋亡调节剂(CFLAR)、NF-E2相关因子2(NRF2)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、细胞色素P450 4A(CYP4A)和磷酸化的应激活化蛋白激酶/应激活化蛋白激酶(pJNK/JNK)的蛋白相对表达量。结果表明：
1.模型组小鼠肝脏出现了明显的大泡性肝细胞脂肪病变、肝细胞气球样变和小叶内炎症细胞浸润，给药组小鼠肝细胞脂肪堆积和炎症细胞浸润情况得到明显改善。
2.模型组小鼠血清ALT、AST的活力值相对于正常对照组明显提高；肝脏TC、TG和MDA的含量明显高于正常对照组，而CAT、GSH-PX和HO-1的活性明显低于正常对照组。给药组小鼠血清中的ALT、AST活性，以及肝脏中的TC、TG和MDA的含量明显低于模型对照组，而CAT、GSH-PX和HO-1的活性明显高于模型对照组。
3.模型组小鼠肝脏中ACOX、PPARα、CPT1α、FABP5、SCD1、GPAT和MTTP的mRNA的表达量相对于正常对照组明显降低；给药组小鼠肝脏中ACOX、PPARα、CPTΙ、FABP5、SCD1、GPAT和MTTP的mRNA的表达量明显高于模型对照组。
4.模型组小鼠肝脏中CFLAR、NRF2的蛋白表达量明显低于正常对照组，CYP2E1、CYP4A和pJNK/JNK的蛋白表达量明显高于正常对照组；给药组小鼠肝脏中CFLAR和NRF2的蛋白表达量明显高于模型组，CYP2E1、CYP4A和pJNK/JNK的蛋白表达量明显低于模型组。
上述结果表明，MCD饮食会影响脂质代谢和氧化应激相关靶基因的mRNA和蛋白质的正常表达，导致肝脏脂质代谢紊乱和氧化应激损伤，从而引起肝细胞脂质变性和炎症细胞浸润。给药组小鼠上述指标都得到一定程度改善，表明HNK可以通过上调CFLAR、NRF2、PPARα的表达及CAT、GSH-Px和HO-1的活性，抑制JNK的磷酸化和CYP4A、CYP2E1的表达，从而预防MCD饮食诱导的肝脏脂肪变性和氧化应激损伤，对NASH的发生发展具有一定预防和治疗作用。
附图说明
图1小鼠肝脏HE染色和油红O染色结果。
图2肝脏中CFLAR、pJNK/JNK蛋白表达量的检测结果。
图3肝脏中NRF2、CYP2E1、CYP4A蛋白表达量的检测结果。
图4肝脏中SCD1的mRNA表达量检测结果。
图5肝脏中GPAT的mRNA表达量检测结果。
图6肝脏中MTTP的mRNA表达量检测结果。
图7肝脏中CPT1的mRNA表达量检测结果。
图8肝脏中FABP5的mRNA表达量检测结果。
图9肝脏中ACOX的mRNA表达量检测结果。
图10肝脏中PPARα的mRNA表达量检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
1实验方法
1.1小鼠造模和给药
将40只雄性C57BL小鼠随机平均分为正常对照组、模型组、模型灌胃HNK低剂量组、模型灌胃HNK高剂量组。正常对照组小鼠喂食蛋氨酸胆碱正常含量饲料(MCS)，模型组、模型灌胃HNK低剂量组、模型灌胃HNK高剂量组喂食蛋氨酸和胆碱缺乏饲料(MCD)。造模期间灌胃，灌胃体积按10mL/kg计算。模型灌胃HNK低剂量组给药剂量10mg/kg，模型灌胃HNK高剂量组给药剂量20mg/kg，正常组对照组和模型组灌胃生理盐水。
小鼠饲养六周，禁食不禁水12h后取血处死，用预冷的生理盐水对肝脏进行灌流，直到肝脏变成土黄色，然后摘除肝组织，清洗擦干后分装。取适当大小小鼠肝脏放入4％多聚甲醛溶液中，做肝脏组织病理学检测；剩余肝脏按实验要求分为生化指标检测组、蛋白表达量检测组和mRNA的表达量检测组，按相应方式保存肝脏。血液在常温下放置1h后，3500r常温下离心10min，取上层血清分装、-20℃保存。
1.2检测项目与方法
肝切片经HE染色和油红O染色观察组织病理学变化；试剂盒检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活力值，肝组织匀浆中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)的含量，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和氧化应激诱导性血红素加氧酶(HO-1)的活性；实时荧光定量PCR检测肝组织中酰基辅酶A氧化酶(ACOX)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)、肉碱棕榈酸转移酶1(CPT1α)、脂肪酸结合蛋白5(FABP5)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、甘油3磷酸酰基转移酶(GPAT)和微粒体甘油三酯转移蛋白酶(MTTP)；蛋白印迹法检测肝组织中CASP8和FADD样凋亡调节剂(CFLAR)、NF-E2相关因子2(NRF2)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、细胞色素P450 4A(CYP4A)和磷酸化的应激活化蛋白激酶/应激活化蛋白激酶(pJNK/JNK)的蛋白相对表达量。
1.3数据处理和分析
采用的数据均来自于三次独立的重复试验，数据结果采用SPSS 22.0统计软件进行分析，用mean±SD表示。组间差异采用t检验，与正常对照组对比(#P<0.05，##P<0.01)，与模型组对比(*P<0.05，**P<0.01)。
2实验结果
2.1病理学切片
运用肝组织切片染色的方法判断肝脏的脂肪堆积和炎症，结果如图1所示。图1A为HE肝组织染色结果，图中，MCS饲料喂养六周的正常组小鼠的肝脏具有典型的肝小叶结构，肝细胞排列有序，细胞边缘结构明显；模型组经过MCD饲料喂养6周，小泡和大泡性脂肪堆积严重，肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，且呈现气球样变，部分细胞坏死，有一定的炎症细胞出现；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg 6周，肝脏脂肪堆积明显减轻，坏死细胞和炎症细胞减少，且高剂量给药组相对于低剂量给药组预防效果更显著。在图1B为油红O染色结果，图中，可以清晰的观察到模型组中严重的脂肪堆积，而给药组小鼠肝中脂肪堆积情况呈现剂量依赖性的减轻。
2.2NASH小鼠生化指标的检测结果
2.2.1血清中的生化指标
肝脏细胞的损伤会将ALT和AST大量释放到血液中，导致血液中的AST和ALT急速增加，是判定肝细胞损伤的一个重要指标，本实验采用生化试剂盒检测血清中的酶活。如表1所示，MCD饲料喂食六周的模型组中ALT的活力值达到了1.34U/L，而正常对照组酶活力值为0.35U/L，模型组相对于正常组酶活力值增加显著(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg六周后，肝脏中的ALT的活力值相对于模型组有所下降；给药组小鼠灌胃HNK 20mg/kg六周后肝脏中的ALT的活力值相对于模型组明显降低(P<0.01)，而给药组肝脏中ALT的活力值和正常对照组相比差异显著(P<0.01)。结果表明，HNK对小鼠肝损伤导致的血清中ALT活力值的升高具有一定的预防效果，且具有明显的剂量依赖性。
当MCD饲料喂食六周后，模型组中AST的活力值达到了82.22U/L，相对于正常对照组的活力值45.68U/L明显增加(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，肝脏中的AST的活力值相对于模型组降低，而相对于正常组对照组差异显著(P<0.01)。结果表明，HNK对小鼠肝损伤导致的血清中AST活力值的升高具有一定的预防效果，且具有一定的剂量依赖性。
表1血清中ALT、AST的活力值
MCS MCD 10mg/kg 20mg/kg
Serum ALT(U/L) 0.35±0.06 1.34±0.35## 0.99±0.37## 0.66±0.24##**
Serum AST(U/L) 45.68±7.82 82.22±14.50## 74.13±16.81## 71.77±12.76##
n＝8.#p<0.05,##p<0.01vs MCS.*p<0.05,**p<0.01vs MCD.
2.2.2肝脏中的生化指标
2.2.2.1肝脏中TG、TC的含量
NASH小鼠的肝脏会发生较为严重的脂肪堆积，从而导致肝脏中TC、TG的含量增加，因而TC、TG的含量是检测肝脏脂类堆积的重要指标，本实验采用生化试剂盒检测肝脏中的TC、TG的含量。如表2所示，模型组经MCD饲料喂养六周后，肝脏中的TG含量增加至0.32mmd/L，正常对照组的肝脏中TG含量为0.17mmd/L，模型组的含量相对于正常对照组显著增加(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg六周后，小鼠肝脏中TG的含量相对于模型组有所降低；给药组小鼠灌胃HNK 20mg/kg六周后，肝脏中TG的含量相对于模型组显著降低(P<0.05)，而给药组肝脏中TG的含量和正常对照组相比差异显著(p<0.01)。结果表明，HNK能在一定程度上预防TG在肝脏中的积累，且具有一定的剂量依赖性。
如表2所示，模型组经MCD饲料喂养六周后，肝脏中的TC含量增加至0.18mmd/L，正常对照组肝脏中TC含量为0.09mmd/L，模型组中的含量相对于正常对照组显著增加(P<0.01)；给药组期间灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，给药组小鼠肝脏中TC的含量相对于模型组显著降低(P<0.01)，且给药组中TC的含量和正常对照组相比差异不明显。结果表明，HNK能显著地预防TC在肝脏中的积累。
表2肝脏中的TG、TC的含量
n＝8.#p<0.05,##p<0.01vs MCS.*p<0.05,**p<0.01vs MCD.
2.2.2.2肝脏中MDA的含量和CAT、GSH-Px、HO-1的活力值
脂质过氧化是NASH小鼠肝损伤的一个重要因素，MDA作为过氧化的重要产物，是肝损伤的标志性指标之一；而CAT、GSH-Px和HO-1是抗氧化体系的重要组成。本实验采用生化试剂盒检测肝脏中MDA的含量，CAT和GSH-Px的活力值，采用ELISA试剂盒检测HO-1的活力值。实验期间采用MCD饲料喂食C57BL小鼠六周，造模期间每日灌胃HNK低、高两个剂量。
如表3所示，经MCD饲料喂食六周后，模型组小鼠肝脏中MDA的含量为6.15nmol/mgprot，而正常对照组小鼠肝脏中MDA的含量为0.91nm/mgprot，模型组MDA的含量相对于正常对照组显著增加(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，MDA的含量相对于模型组显著降低(P<0.05)，而给药组小鼠肝脏中MDA的含量和正常对照组相比差异明显(P<0.01)。结果表明，HNK可以在一定程度上预防小鼠体内MDA的产生，缓解体内的过氧化情况。
MCD饲料喂食六周后，如表3所示，模型组小鼠肝脏中CAT的活力值为0.44U/mgprot，而正常对照组小鼠肝脏中CAT的活力值为1.08U/mgprot，模型组小鼠肝脏中CAT的活力值相对于正常组显著降低(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，肝脏中CAT的活力值相对于模型组显著升高(P<0.01)，且给药组小鼠肝脏中CAT的活力值和正常对照组相比差异不明显。数据结果表明，HNK可以显著预防肝脏中CAT活力值的降低，保持机体清除过氧化氢的能力。
如表3所示，经MCD饲料喂食六周后，模型组小鼠肝脏中GSH-Px的活力值为189.57U/mgprot，而正常对照组小鼠肝脏中GSH-Px的活力值为324.39U/mgprot，模型组小鼠肝脏中GSH-Px的活力值相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK10mg/kg六周后，GSH-Px的活力值相比于模型组有所增加，相对于正常对照组差异显著(P<0.05)；而灌胃HNK 20mg/kg六周后，GSH-Px的活力值相比于模型组显著增加(P<0.01)，相对于正常对照组差异不明显。数据结果表明，HNK能成剂量依赖性的显著预防肝脏中GSH-Px活力值的降低，从而保持机体抗氧化损伤的能力。
如表3所示，经MCD饲料喂食六周后，模型组小鼠肝脏中HO-1的活力值为1.34U/mgprot，而正常对照组小鼠肝脏中HO-1的活力值为3.42U/mgprot，模型组小鼠肝脏中HO-1的活力值相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，小鼠肝脏中HO-1的活力值相对于模型组显著升高(P<0.01)，且相对于正常对照组有所增加。数据结果表明，HNK能成剂量依赖性的显著预防肝脏中HO-1活力值的降低，从而保持机体抗血红素代谢的稳定。
表3肝脏中MDA的含量和CAT、GSH-Px、HO-1的活力值
n＝8.#p<0.05,##p<0.01vs MCS.*p<0.05,**p<0.01vs MCD.
2.3肝脏中相关蛋白表达量的检测结果
2.3.1肝脏中CFLAR、pJNK/JNK的蛋白表达量
NASH小鼠的肝损伤会导致体内相关蛋白的表达发生变化，本实验通过WB的方式，检测相关蛋白的相对表达量。通过喂食雄性C57BL小鼠MCD饮食，造模期间每日灌胃HNK低、高两个剂量，六周后制备蛋白样品通过WB检测CFLAR、pJNK/JNK的蛋白相对表达量。
如图2所示，模型组喂食MCD饲料六周后，CFLAR的表达量不断降低，于正常对照组相比明显降低(P<0.05)；造模期间灌胃HNK 10mg/kg六周后，CFLAR的蛋白表达量相对于模型组有所升高，而相对于正常对照组差异不明显；造模期间灌胃HNK 20mg/kg六周后，CFLAR的蛋白表达量相对于模型组显著升高(P<0.05)，而相对于正常对照组差异不明显。数据分析结果表明，HNK能成剂量依赖性的预防因肝脏损伤而导致的CFLAR蛋白表达量的降低。模型组喂食MCD饲料六周后，pJNK/JNK的相对表达量的比值和正常对照组相比升高明显(P<0.05)；造模期间灌胃HNK 10mg/kg六周后，pJNK/JNK的相对表达量的比值相对于模型组明显降低(P<0.05)，而相对于正常对照组差异不明显；灌胃HNK20mg/kg六周后，pJNK/JNK的表达量相对于模型组显著降低(P<0.05)，而相对于正常对照组差异明显(P<0.05)。数据结果表明，HNK可以剂量依赖性的降低pJNK/JNK蛋白表达量的比值，从而防止磷酸化过高导致的肝脏损伤。
2.3.2肝脏中NRF2、CYP2E1、CYP4A的蛋白表达量
制备蛋白样品通过WB检测NRF2、CYP2E1、CYP4A的蛋白相对表达量。如图3所示，模型组喂食MCD饲料六周后，NRF2的蛋白表达量不断降低，于正常对照组相比降低明显(P<0.01)；造模期间灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，NRF2的蛋白表达量相对于模型组显著升高(P<0.01)，而相对于正常对照组差异不明显。数据结果分析表明，HNK可以剂量依赖性的升高NRF2的蛋白表达量，从而稳定机体内抗氧化蛋白的表达水平。模型组喂食MCD饲料六周后，CYP2E1的蛋白表达量和正常对照组相比明显升高(P<0.01)；造模期间灌胃HNK 10mg/kg六周后，CYP2E1的蛋白表达量相对于模型组有所降低，且相对于正常对照组差异不显著；造模期间灌胃HNK 20mg/kg六周后，CYP2E1的蛋白表达量相对于模型组显著降低(P<0.05)，而相对于正常对照组差异不明显。数据结果表明，HNK成剂量依赖性的预防肝脏损伤导致的CYP2E1的蛋白表达量的提高，从而稳定小鼠体内的氧化平衡。模型组喂食MCD饲料六周，CYP4A的蛋白表达量和正常对照组相比升高明显(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，CYP4A的蛋白相对表达量相对于模型组明显降低(P<0.05)，而相对于正常对照组差异不明显。HNK能显著预防肝脏损伤导致的CYP4A蛋白表达量的提高，从而稳定小鼠体内的氧化平衡。
2.4肝脏中相关mRNA表达量的检测结果
2.4.1肝脏中脂转运相关mRNA的表达量
脂肪酸的转运异常是小鼠NASH的一个重要特征，可以用来了解肝脏中脂类的代谢情况。实验采用RT-qPCR检测肝脏中脂肪酸代谢相关的mRNA的表达量。
模型组喂食MCD饲料六周后，如图4所示，SCD1的mRNA的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg、20mg/kg六周后，SCD1的表达量相对于模型组明显升高(P<0.05)，而相对于正常对照组差异显著(P<0.01)。表明HNK可以上调SCD1mRNA的表达量，预防缓解胆碱和蛋氨酸缺乏引起的TG在肝脏中的积累。从数据结果来分析，两个给药组之间的差异明显，具有一定的剂量依赖性。
如图5所示，模型组喂食MCD饲料六周后，GPAT的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.05)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg六周后，GPAT的mRNA的表达量相对于模型组有所提高，而相对于正常对照组差异明显(P<0.05)；给药组小鼠灌胃HNK 20mg/kg六周后，GPAT的mRNA的表达量相对于模型组显著提高(P<0.05)，而相对于正常对照组差异不明显。表明HNK成剂量依赖性的上调GPAT mRNA的表达量，预防缓解胆碱和蛋氨酸缺乏引起的TG在肝脏中的积累。
如图6所示，模型组喂食MCD饲料六周后，MTTP mRNA的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg六周后，MTTP的表达量相对于模型组明显升高(P<0.05)，而相对于正常对照组差异显著(P<0.01)；灌胃HNK 20mg/kg六周后，MTTP的表达量相对于模型组显著升高(P<0.01)，相对于正常对照组差异明显(P<0.05)。数据结果表明，HNK可以剂量依赖性的预防MCD饮食导致的MTTP mRNA的表达量的降低，从而稳定TG转化为VLDL的效率，预防和缓解胆碱和蛋氨酸缺乏引起的TG在肝脏中的积累。
2.4.2肝脏中脂氧化相关mRNA的表达量
脂肪酸的氧化异常是小鼠NASH的一个重要致病因素，脂质的过氧化会导致肝脏细胞的损伤，实验采用RT-qPCR检测肝脏中脂肪酸代谢相关的mRNA的表达量，从而用来判断NASH小鼠的状态。
模型组喂食MCD饲料六周后，如图7所示，模型组中CPT1mRNA的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；HNK灌胃10mg/kg六周后，CPT1mRNA的表达量相对于模型组有所升高，相对于正常对照组差异明显(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 20mg/kg六周后，CPT1MRNA的表达量相对于模型组显著升高(P<0.01)，相对于正常对照组差异不明显。表明HNK可以剂量依赖性的预防肝脏损伤导致的CPT1mRNA的表达量降低，稳定机体转运脂肪酸到线粒体中进行氧化，从而预防脂类在肝脏中的积累。
如图8所示，模型组经MCD喂食六周后，FABP5mRNA的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；给药组灌胃HNK 10mg/kg六周，FABP5mRNA的表达量相对于模型组显著升高(P<0.01)，相对于正常对照组差异显著(P<0.01)；HNK灌胃20mg/kg六周，FABP5mRNA的表达量相对于模型组显著升高(P<0.01)，相对于正常对照组差异显著(P<0.05)。表明HNK可以剂量依赖性的预防肝脏损伤导致的FABP5mRNA的表达量的降低，稳定机体对脂类的利用效率，预防脂类在肝脏中的积累。
如图9所示，模型组经MCD喂食六周后，ACOX mRNA的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；给药组小鼠灌胃HNK 10mg/kg六周，ACOX的表达量相对于模型组变化不明显，相对于正常对照组差异显著(p<0.01)；灌胃HNK 20mg/kg六周，ACOX mRNA的表达量相对于模型组明显升高(P<0.01)，相对于正常对照组差异不显著。表明HNK可以剂量依赖性的预防肝脏损伤导致的ACOX mRNA表达量降低，从而稳定脂肪酸的氧化，预防血液中TG含量的增加。
如图10所示，模型组经MCD喂食六周后，PPARαmRNA的表达量相对于正常对照组显著降低(P<0.01)；治疗组小鼠灌胃HNK 10mg/kg六周，PPARαmRNA的表达量相对于模型组有所升高，相对于正常对照组差异显著(P<0.01)；灌胃HNK 20mg/kg六周，PPARαmRNA的表达量相对于模型组明显升高(P<0.05)，相对于正常对照组差异显著(P<0.01)。数据结果表明，HNK可以剂量依赖性的预防肝脏损伤导致的PPARαmRNA表达量的降低，稳定PPARα上调脂类转运和氧化相关的mRNA转录的能力，从而预防NASH小鼠肝脏中脂类的积累。
3分析
目前，全世界遭受NASH困扰的病人已达数亿，给很多家庭带来了无尽的困扰，对社会的稳定和发展产生了极大地挑战。虽然有几种药物，如：奥贝胆酸，已经在临床实验上被证明对改善NASH有一定的效果，但直至现在，改善病人的生活方式和减轻肥胖病人的体重仍是NASH的唯一可靠的治疗选择。实验中采用MCD喂食C57BL雄性小鼠六周，创建NASH动物模型，该模型能快速的模拟出NASH病人肝脏的脂肪积累和肝细胞损伤等的典型状态，相对于本次实验是比较理想的模型状态。模型中小鼠正常的氧化应激和脂肪代谢相关基因的表达紊乱，HNK显著减轻了NASH小鼠的症状，表明HNK在治疗NASH方面具有一定的潜力。
由于NASH的发病机理复杂，包括多种复杂的重新编程分子网络。因此，对于NASH的治疗战略是抓住一个关键的上游因素，这个因素涉及到多种致病途径，同时还能最终抑制多种病理特征。据文献报道，CFLAR是脂肪性肝炎及其代谢紊乱的关键抑制因子，CFLAR通过破坏凋亡信号调节激酶1(ASK1)的N-末端介导的二聚化来阻断ASK1的活化。CFLAR的这种干扰是通过直接结合到ASK1区域并间接的抑制TRAF6结合到ASK1来实现的，而ASK1在细胞因子及应急诱导凋亡过程中起关键作用。应激活化蛋白激酶(JNK)信号通路是ASK1通路的一个重要分支，ASK1的活性被抑制，会影响JNK的磷酸化，pJNK能促进细胞的分化、凋亡和应激反应。目前的实验结果表明，通过阻止ASK1二聚化，调节CFLAR的表达能有效的缓解小鼠的脂肪性肝炎。本次实验中WB的结果表明，小鼠在MCD造模六周后，其体内CFLAR的蛋白表达量明显降低，而pJNK的表达量明显升高，肝脏中JNK磷酸化的水平增强，会加剧肝脏细胞的分化、衰老、凋亡和氧化应激的反应程度。给药组小鼠肝脏的WB和组织病理学检测结果显示，CFLAR的蛋白相对表达量明显升高，JNK的磷酸化水平降低。表明HNK可能通过上调CFLAR的表达水平，进而干扰了ASK1的活性，同时抑制相关细胞因子刺激JNK磷酸化，最终保护肝脏细胞免受损伤。
NRF2是细胞内调节抗氧化应激的一个关键性的转录因子，可以诱导抗氧化相关基因的表达，从而增强细胞的保护防御能力。生理条件下NRF2会与kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)在细胞质中结合，从而不断地泛素化降解，导致其无法进入细胞核中发挥转录活性。但当机体受到亲电子物质、氧化应激等的作用时，可使Keap1构象发生改变，Nrf2与Keap1解离后活化。活化后的NRF2能够进入细胞核内与抗氧化反应元件(ARE)结合，启动下游Ⅱ相解毒酶、泛素酶、抗氧化酶以及蛋白酶体的基因表达。MCD饮食导致模型组小鼠肝脏中NRF2的蛋白表达量降低，NRF2表达量的降低导致与其密切相关的下游的抗氧化蛋白类、解毒酶类和泛素酶类的基因表达量降低，后期生化检测的结果也证实了这种推论。模型组中肝脏中CAT、GSH-Px和HO-1的活力值显著低于正常组，这些生物防御体制的关键酶的表达量下降，导致小鼠肝脏清除自由基的能力受损，不能及时和彻底的消除这些损伤因子，这种情况的长期出现，最终导致了模型组小鼠肝脏的细胞损伤和死亡，以及炎症因子在肝小叶内的积累。实验结果的数据表明，HNK可能通过显著地上调NRF2的表达保护细胞免受自由基的攻击，NRF2作用的增强刺激到其抗氧化体系的下游蛋白CAT、GSH-Px和HO-1的表达，抗氧化酶活性的增强缓解了小鼠肝脏细胞的损伤和死亡状况，清除部分肝小叶内积累的炎症因子。
作为细胞内自由基产物的主要来源，CYP2E1和CYP4A已被证明会促进脂肪性肝炎的进展。在MCD饮食小鼠的肝脏中CYP2E1和CYP4A会过度表达，由此产生过多的自由基，自由基和脂质会发生过氧化反应，其过氧化产物为MDA。MDA对线粒体呼吸链上的关键酶都有不同程度的损伤作用，会导致线粒体功能紊乱和氧化中间产物的累计，进一步影响细胞结构和功能。同时MDA还会影响膜上转运蛋白和受体蛋白，导致膜的通透性变大和对信号分子的识别能力降低，最终导致细胞的破碎死亡。模型组的检测结果证实了上述论断，模型组小鼠肝脏细胞死亡和炎症因子累计明显加重。
从数据结果分析，模型组中PPARαmRNA的表达量明显低于正常组，肝脏中TC和TG的含量增加。PPARα在调节脂肪形成和抑制肝星状细胞(HSC)中纤维生成起关键作用，HSC的激活和转化被认为是造成和发展肝纤维化的两个主要原因。MCD饮食导致PPARα的转录下调，使HSC的功能激活，并且导致下游ACOX、FABP5和CPT1α异常表达。ACOX可以促进脂肪酸在过氧化小体中的β氧化,其功能的发挥可以降低血清和肝脏中的TG。FABP5是脂肪酸结合蛋白家族中的一员，它的空间结构使它可以高亲和力的结合长链脂肪酸，并将其转运至目标区域如：线粒体、内质网和细胞核等胞内细胞器，从而调节脂肪酸的进一步氧化或酯化。CPT1α是CPT1的一个亚型，CPT1是一种负责线粒体内脂肪酸游离(FFA)β-氧化的基本酶，能控制FFA进入线粒体的通量，是脂质代谢的关键酶之一。上述三种酶的表达量下降，影响了脂类转运、氧化和贮存的整个过程，最终导致TC和TG在肝脏中的大量积累。HNK通过上调模型组小鼠PPARαmRNA的表达量，从而增加其反应体系中下游ACOX、FABP5和CPT1α基因的转录，进而改善肝脏中脂类的代谢情况。从数据的结果分析可以看出，相关mRNA表达量的增加以及肝脏中TC和TG含量的减少，应证了上述论断。
作为脂类合成的关键酶，SCD1和GPAT调节脂类在机体内的平衡。当肝脏细胞中FFA过多，SCD1和GPAT的活性增加催化相关代谢反应将FFA转化为TG，其反应体系下游蛋白MTTP能催化TG等脂类转化为乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)，使其经肠上皮细胞和肝细胞分泌出来，最终调节脂类在体内的平衡。从实验结果推断，HNK显著上调了SCD1、GPAT和MTTP的mRNA的表达水平，调节了由MCD饮食导致的小鼠机体内SCD1、GPAT和MTTP的mRNA表达水平的紊乱，一定程度上减轻了肝脏中TC和TG的积累。总之，用HNK处理显著改善了经MCD诱导的NASH小鼠的机能紊乱。通过提高氧化呼吸链上蛋白的活性和表达量，在一定程度上稳定了线粒体的功能，减少了氧化应激和炎症反应。通过减少有害物质的产生并提高脂肪转运和合成相关蛋白的活性和表达量，进而保护机体膜的通透性，并且调控了脂肪转运和合成体系，减少了脂肪在机体内的异常积累。从我们的数据推断，HNK作为治疗NASH的候选药物是极有前途的。

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