CN108888608A - 一种载白藜芦醇的纳米载体的制备方法及其减脂护肝的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载白藜芦醇的纳米载体的制备方法及其减脂护肝的应用。将白藜芦醇加入已溶解在有机溶剂的有机大分子聚合物例如PLGA,进而进行超声乳化处理,然后通过挥发去除有机溶剂后,即可得到一种呈规则球形载有药物的纳米药物载体微粒。该纳米载体具有稳定性高、毒性小、高包封率、缓释药物、适用于口服的特点,此外,利用该纳米载体进行施药,可提高药物的生物利用率和溶解度,因而能够有效减少所需剂量,进一步降低副作用。而且有机大分子聚合物PLGA,能够有效吸收脂质成分,能够有效降低血脂和血液中的游离脂肪酸和甘油等。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其涉及一种载白藜芦醇的纳米载体的制备方法及其减脂护肝的应用。
背景技术
世界卫生组织将肥胖定义为一种危及人体健康的体内堆积脂肪过多或分布异常的疾病。肥胖是一种慢性的持续状态, 以身体脂肪过多为特点。肥胖在这个以瘦为美的时代,不仅不符合主流审美,还会影响身体健康,带来一系列的并发症,例如2型糖尿病、胆道疾病、异常脂质血症、抗胰岛素作用、睡眠窒息、呼吸困难、无休止的焦虑、冠心病、高血压、骨关节炎、各种癌症、生殖激素异常、***等。
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明确因素所致,以肝实质细胞脂肪变性和肝小叶内炎症为特征的临床病理综合征, 是遗传-环境-代谢应激相关性疾病,包括单纯性脂肪肝(nonalcoholicsimplefattyliver)及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis)和肝硬化。非酒精性脂肪肝病早期病情稳定,越早治疗越好。非酒精性脂肪性肝炎是病情转化的拐点和防治的重点, 容易发展成肝硬化。
肥胖的本质在于身体能量的摄入大于能量的消耗,最终导致脂肪的累积。非酒精性脂肪肝病的发病机制复杂,总的来说,也是由于身体胰岛素抵抗、氧化应激和脂质过氧化的原因,导致肝细胞受损然后脂肪沉积造成脂肪变性,进而继续恶化的一个过程。所以,在病症早期及时减少脂肪的聚集、促进脂肪的分解,对于减肥和护肝具有重大的意义。
白藜芦醇( Resveratrol)是一种非黄酮类多酚化合物,目前已在虎杖、葡萄、花生等至少72 种植物中发现白藜芦醇的存在,并且研究表明白藜芦醇具有多种药理活性,具有抗癌、抗炎、抗氧化、保护心血管等药理作用,具有广泛的应用价值,市场需求量大。但是鲜有人报道过白藜芦醇的减脂护肝的功效,而且作为一种天然成分,对人体副作用小。白藜芦醇难溶于水,易溶于有机溶剂(如丙酮、***、甲醇、乙酸乙酯、氯仿等),对光不稳定。它的这些性能使其溶解度低、生物利用度低、药物活性不稳定,限制的白藜芦醇的应用。因此急需一种方法来改进这些缺点,扩大白藜芦醇的应用。
纳米药物载体在药物递送中,能够最大限度地发挥药理作用,同时克服药物本身的局限性和缺点。纳米技术可大大提高各种疾病的治疗形式和诊断效率,在药物制造方面也展现出其独特的优势。纳米载体常被用于癌症的诊断和治疗,鲜少用于减脂方面。本发明采用纳米技术,将白藜芦醇包裹在纳米载体之中,从而改善其溶解度,提高生物利用率和药物本身的稳定性,从而更好地发挥药效,起到减脂护肝的作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种载白藜芦醇的缓释纳米载体。目的之二是提供这种纳米载体的制作方法。目的之三是提供这种载白藜芦醇的缓释纳米载体的新用途—减脂护肝。
本发明提供了一种制备载白藜芦醇的纳米载体。将白藜芦醇加入已溶解在有机溶剂的有机大分子聚合物例如PLGA,进而进行超声乳化处理,然后通过挥发去除有机溶剂后,即可得到一种呈规则球形载有药物的纳米药物载体微粒。该纳米载体具有稳定性高、毒性小、高包封率、缓释药物、适用于口服的特点。此外,利用该纳米载体进行施药,可提高药物的生物利用率和溶解度,因而能够有效减少所需剂量,进一步降低副作用。
本发明提供了载白藜芦醇的缓释纳米载体的新用途—减脂护肝。PLGA作为有机大分子,由于其具有亲脂性,在施药过程发现分解的甘油被吸收了,这可以进一步促进脂肪的分解,减少甘油和游离脂肪酸,避免出现高血脂的情况。而且用纳米载体包裹白藜芦醇,提高了其本身的溶解度、生物利用率、稳定性还有在体内的半衰期,能够长期有效的缓慢释放药物,使其维持在有效药物浓度,从而起到减脂护肝的功效。
一种载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,包括如下步骤:
(1)将药物与溶解在有机溶剂的有机大分子聚合物混合,超声以获得混合溶液即油相;所述的药物为白藜芦醇。
(2)将所述混合溶液与含有乳化剂的水溶液,即水相进行乳化超声处理,以便获得水包油乳液;
(3)将所述水包油乳液依次进行搅拌(以去除有机溶剂)、离心和洗涤处理,获得载白藜芦醇的纳米载体。
上述方法中,所述的有机大分子聚合物选自PLGA、PEG、PLGA-PEG中的一种。
上述方法中,所述有机溶剂选自丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种以上。
上述方法中,步骤(1)和步骤(2)中,所述超声的功率在100~500w,超声时间为1~10min。
上述方法中,所述乳化剂选自BSA、PVA、CTAB、吐温80中的一种。
上述方法中,步骤(3)中,所述搅拌时间为3~24h,离心速度为8000~14000rpm,洗涤次数为2~5次。
一种载白藜芦醇的纳米载体应用于减脂护肝,所述载白藜芦醇的纳米载体具有减脂、护肝的新用途。
上述应用中,所述载白藜芦醇的纳米载体应用于减肥和护肝产品中,起到减少脂肪累、积促进脂肪分解的作用。
一种载白藜芦醇的纳米载体具有稳定性高、毒性小、高包封率、缓释药物、适用于口服的特点。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
1.白藜芦醇是天然药物,所以对于人体的毒副作用很小,而且其具有很强的生物活性--具有减脂、抗癌、抗炎、抗氧化、保护心血管等生理作用,具有广泛的应用价值,市场需求量大。
2.由于白藜芦醇自身的特性--它难溶于水,易溶于有机溶剂(如丙酮、***、甲醇、乙酸乙酯、氯仿等),对光不稳定。它的这些性能使其溶解度低、生物利用度低、药物活性不稳定,限制的白藜芦醇的应用。本发明提供了一种制备载白藜芦醇的纳米载体,通过载体将其包封能够大大的提高白藜芦醇的水溶性,光稳定性,以及应用过程中它的生物利用度和药物活性。
3.本发明提供的该纳米载体具有制作过程简单,稳定性高、毒性小、高包封率、缓释药物、适用于口服的特点。此外,利用该纳米载体进行施药,可提高药物的生物利用率和溶解度,因而能够有效减少所需剂量,进一步降低副作用。
4.本发明提供了载白藜芦醇的缓释纳米载体的新用途—减脂护肝。通过研究,发现该纳米载体能够降低脂肪细胞中的脂肪含量,也能够降低脂肪肝细胞模型中脂肪的含量,所以可以该载体可以应用于减脂护肝方面。
附图说明
图1为白藜芦醇(Res),PLGA和用PLGA包载白藜芦醇的纳米载体(Res-PLGA-NPS)的红外光谱图;
图2为Res-PLGA-NPS的粒径分布图;
图3为Res-PLGA-NPS的Zeta电位分布图;
图4为Res-PLGA-NPS的扫描电镜图;
图5为Res-PLGA-NPS中Res的体外释放曲线;
图6为不同浓度Res-PLGA-NPS对诱导为脂肪肝细胞的HepG2细胞的油红O染色图;
图7为Res-PLGA-NPS对诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞的油红O染色图。
具体实施方式
实施例1
一、载白藜芦醇的纳米粒的制备:
10mgPLGA溶于1ml二氯甲烷和丙酮(体积比二氯甲烷:丙酮=3:2),形成均匀的PLGA溶液(10mg/ml)。向PLGA溶液中加入8mg的白藜芦醇溶于乙醇,并在100w下超声1min产生s/o初级乳液,然后将初级乳液缓慢注入到5ml 1%的BSA溶液中,并在100w下超声1min形成最终的s/o/w乳液。为了分散最终的s/o/w乳液,加入10ml去离子水,磁力搅拌4h以去除残留的有机溶剂。收集纳米粒,在14000rmp下离心30min去除上清液,以得到NPS。然后加去离子水洗三遍,10000rpm下离心20min。最后冷冻干燥,放4℃以备用。
二、测试方法
1、纳米粒的表征
1.1红外光谱
采用FTIR方法通过红外吸收光谱鉴定化合物的结构和组成相关的官能团。用ATR附件在波长为4000-400cm-1下检测Res,PLGA,Res-PLGA-NPS的红外光谱。
1.2粒径和Zeta电位
使用Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instrument,Worcestershire,UK)通过动态光散射(DLS)测定NUC-PLGA-NPS的粒径和Zeta电位。
1.3扫描电镜
使用Scanning electron microscopy (SEM)测量干燥的Res-PLGA-NPS的形态和大小。将一滴Res-PLGA-NPS的悬浮液滴置于酒精处理过的干净硅片上并在室温(RT)下干燥。
2、体外释放
将10mg的Res-PLGA-NPS溶解在去5ml离子水中,然后吸取4ml于透析袋中,将其放置于PH为7.4的PBS。在37℃,100rpm的摇床中连续摇动进行体外释放,并在预定的时间间隔后取样,每次抽取1ml,再补充1ml相应PH的PBS溶液。用Res的PBS溶液(含有1.5%SDS的PBS溶液)的标曲来测定相应释放液中Res的含量。
3、油红O染色
为了直观的表现Res-PLGA-NPS对3T3-L1细胞、HepG2细胞脂肪变性后的脂肪沉积的影响(OA诱导24h后,再与Res-PLGA-NPS共同孵育24h,选择未处理的细胞作为对照),采用油红O染色的方法来检测。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤细胞三次,并用4%多聚甲醛溶液在室温固定15min。随后,用PBS洗涤细胞三次以除去的剩余多聚甲醛溶液,用新鲜制备的油红O染料(在体积比为3:2的双蒸水中稀释)工作溶液在RT下染色30min,最后用60% 异丙醇洗2遍以去除浮色,PBS洗3遍后用PBS浸润。在显微镜下拍照观察。
三、结果:
图1为白藜芦醇(Res),PLGA和用PLGA包载白藜芦醇的纳米载体(Res-PLGA-NPS)的红外光谱图。由图可以看出PLGA的特征峰在1757cm-1处,它代表的是C = O键的收缩振动。白藜芦醇(Res)由于醇基而在3290cm-1处显示出其特征吸收带代表O-H的伸缩,964.7cm-1的吸收峰代表反式烯烃键,对于C = C伸缩芳环其吸收峰为1583cm-1,对于C-O伸缩其吸收峰为1144cm-1。在Res-PLGA-NPS的红外光谱中,可以看到在1757cm-1处和964.7cm-1,1583cm-1,1144cm-1处都有明显的吸收峰,说明PLGA成功的包载了白藜芦醇(Res)。
图2为Res-PLGA-NPS的粒径分布图。由图可知,Res-PLGA-NPS的平均粒径为178.4nm,其PDI为0.116,说明制备的该纳米载体粒径小,而且分散度和稳定性都很好。
图3为Res-PLGA-NPS的Zeta电位分布图。由图可知,Res-PLGA-NPS的Zeta电位为-20.3mV,显示为负电荷,而且Zeta电位的绝对值数值越大,说明该体系越稳定,越不容易团聚。所以,-20.3mV可以说明该纳米粒溶液体系较稳定。
图4为Res-PLGA-NPS的扫描电镜图。由图可以清晰的看出,该纳米载体呈球形,而且平均粒径在100多纳米左右。
图5为Res-PLGA-NPS中Res的体外释放曲线。图中显示白藜芦醇在24h内存在初始突释现象,释放率达到了45%左右,那是因为有一部分药物在载体表面或者在载体的表层壳内,这一部分容易释放,导致初始突释现象。后面药物缓慢释放,到216h时释放到65%左右,起到了缓释的效果。
图6为不同浓度Res-PLGA-NPS对诱导为脂肪肝细胞的HepG2细胞的油红O染色图。先将HepG2细胞用油酸诱导脂肪变性,然后加入不同浓度Res-PLGA-NPS共同孵育,再进行油红O染色。如图6可看出,Res-PLGA-NPS对脂肪的抑制作用成浓度依赖性,而且具有显著性。
图7为Res-PLGA-NPS对诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞的油红O染色图。先将的3T3-L1前脂肪细胞用“鸡尾酒”法诱导为成熟的脂肪细胞,再加入Res-PLGA-NPS共同孵育,最后进行油红O染色。由图中可以看出,加入Res-PLGA-NPS后,可以明显抑制脂肪细胞中甘油三酯的堆积,说明Res-PLGA-NPS具有减脂的作用。
实施例2
载白藜芦醇的纳米粒的制备:
30mgPLGA溶于3ml二氯甲烷和丙酮(体积比为二氯甲烷:丙酮=3:2),形成均匀的PLGA溶液(10mg/ml)。向PLGA溶液中加入9mg的白藜芦醇(白藜芦醇溶于乙醇),并在200w下超声2min产生s/o初级乳液,然后将初级乳液缓慢注入到10 ml 1%的BSA溶液中,并在200w下超声4min形成最终的s/o/w乳液。为了分散最终的s/o/w乳液,加入10ml去离子水,磁力搅拌4h以去除残留的有机溶剂。收集纳米粒,在14000rmp下离心30min去除上清液,以得到NPS。然后加去离子水洗三遍,10000rpm下离心20min。最后冷冻干燥,放4℃以备用。
实施例3
载白藜芦醇的纳米粒的制备:
50mgPLGA溶于5ml二氯甲烷和丙酮(体积比为二氯甲烷:丙酮=3:2),形成均匀的PLGA溶液(10mg/ml)。向PLGA溶液中加入10mg的白藜芦醇(白藜芦醇溶于乙醇),并在250w下超声2min产生s/o初级乳液,然后将初级乳液缓慢注入到15ml 1%的BSA溶液中,并在250w下超声4min形成最终的s/o/w乳液。为了分散最终的s/o/w乳液,加入15ml去离子水,磁力搅拌4h以去除残留的有机溶剂。收集纳米粒,在14000rmp下离心30min去除上清液,以得到NPS。然后加去离子水洗三遍,10000rpm下离心20min。最后冷冻干燥,放4℃以备用。
Claims (8)
1.一种载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将药物与溶解在有机溶剂的有机大分子聚合物混合,超声以获得混合溶液即油相;所述的药物为白藜芦醇;
(2)将所述混合溶液与含有乳化剂的水溶液,即水相进行乳化超声处理,以便获得水包油乳液;
(3)将所述水包油乳液依次进行搅拌、离心和洗涤处理,获得载白藜芦醇的纳米载体。
2.根据权利要求1所述载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,其特征在于,所述的有机大分子聚合物选自PLGA、PEG、PLGA-PEG中的一种。
3.根据权利要求1所述载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂选自丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种以上。
4.根据权利要求1所述载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,其特征在于,步骤(1)和步骤(2)中,所述超声的功率在100~500w,超声时间为1~10min。
5.根据权利要求1所述载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,其特征在于,所述乳化剂选自BSA、PVA、CTAB、吐温80中的一种。
6.根据权利要求1所述载白藜芦醇的纳米载体的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述搅拌时间为3~24h,离心速度为8000~14000rpm,洗涤次数为2~5次。
7.权利要求1所述制备方法制备得到的载白藜芦醇的纳米载体应用于减脂护肝,其特点在于,所述载白藜芦醇的纳米载体具有减脂、护肝的新用途。
8.根据权利要去7所述载白藜芦醇的纳米载体的应用,其特征在于,所述载白藜芦醇的纳米载体应用于减肥和护肝产品中,起到减少脂肪累、积促进脂肪分解的作用。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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