CN103623430A - 一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法及应用，可有效解决基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备难题，并实现在脑肿瘤靶向治疗药物中的应用问题，方法是，利用壳聚糖上的活性氨基连接Angiopep-2，首先壳聚糖与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺反应，使壳聚糖的氨基末端具有马来酰亚胺，再与末端巯基化的Angiopep-2反应，得到壳聚糖-angiopep-2聚合物，将该聚合物应用于制备基于PLGA的靶向共载药物传递***的制备，本发明方法稳定可靠，产品使用效果好，能够同时传递小分子化学药物和基因药物，或者同时传递化疗药物和荧光探针通过血脑屏障进入脑部，协同靶向治疗脑肿瘤或靶向治疗脑肿瘤与诊断于一体。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法及应用。
背景技术
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA，或称聚丙交酯-乙交酯共聚物），由两种单体——乳酸和羟基乙酸聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。成为近年来备受青睐的载体材料之一，广泛应用于药物载体和医用生物工程材料领域。在体内最终降解为CO2和H2O。PLGA通过一定的技术可以有效携带蛋白质、抗体、多肽、药物和核酸等生物活性物质进入细胞，从而成为人们关注的载体。
Angiopep-2是最新出现的新型靶向功能基团之一，它是苏氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-苯丙氨酸-赖氨酸-苏氨酸-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸19个氨基酸组成的短肽。研究表明，Angiopep-2与脑毛细血管内皮细胞和胶质瘤细胞均高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白具有亲和性，可有效提高其跨血脑屏障和脑胶质瘤转运效率。研究报道，Angiopep-2在脑实质细胞的分布容积是转铁蛋白的数倍。一个分子Angiopep-2 和三个分子紫杉醇的结合物GRN1005正在美国进入抗脑胶质瘤的一期临床研究。但是该结合物仍然水溶性差，应用时与Texol一样，需要借助聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作为增溶剂，所以仍然存在毒副作用大以及体内循环时间短等缺点。
盐酸阿霉素、多西他赛等小分子抗肿瘤药物是脑毛细血管内皮细胞p-糖蛋白的底物，无法透过血脑屏障从而进入脑实质进而治疗脑肿瘤。因此借助一定的靶向基团和纳米载体可以克服血脑屏障递送药物入脑。
RNA干扰技术已在基因治疗中应用多年，siRNA、shRNA，反义寡核苷酸等药物具有高特异性及低毒副作用的特点，小量核酸片段即可有效沉默目的基因，抑制率较大，在肿瘤等疾病治疗中是一颗耀眼的新星。基因药物疗效的发挥需要借助特定载体使其能够被转运进入细胞。
在肿瘤药物研究中，利用荧光探针标记药物，可以直接在活体水平观察到药物对肿瘤是否靶向、最佳靶向时间以及药物在动物其他器官组织的积累，有利于研究人员在最佳的时间，进行组织分析。吲哚菁绿、酞菁等荧光探针不但能够用于活体成像而且能够吸收近红外光，分子中的电子从基态跃迁至激态，随后激发态的分子释放出热，具有热疗效果。常用于活体成像的荧光探针，大多数为传统的有机染料分子，例如吲哚菁绿、酞菁、亚甲蓝、罗丹明，异硫氰酸荧光素（FITC），而这些有机染料分子有着其本身的一些缺点，如光稳定性差，灵敏度低和靶向性差等缺陷，因而限制了其进一步的应用。借助靶向纳米粒载体可以克服上述缺陷，对肿瘤的诊断和靶向治疗具有明显优势。
为了实现肿瘤的治疗，单独的化疗药物往往需要很大剂量才具有抗肿瘤疗效，然而同时也带来了一定的毒性，例如阿霉素的心脏毒性。因此化疗药物同其它治疗技术的联合应用成为肿瘤治疗的一个重要技术手段。那么如何实现基于PLGA共聚物的靶向共载药物传递***，并实现在脑肿瘤靶向治疗药物中的应用，至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法及应用，可有效解决基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备难题，并实现在脑肿瘤靶向治疗药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，利用壳聚糖上的活性氨基连接Angiopep-2，首先壳聚糖与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺反应，使壳聚糖的氨基末端具有马来酰亚胺，再与末端巯基化的Angiopep-2反应，得到壳聚糖-angiopep-2聚合物，将该聚合物应用于制备基于PLGA的靶向共载药物传递***的制备。制备共载化疗药物和基因药物的靶向PLGA传递***纳米粒的方案是，将PLGA、化疗药物和辅料溶解于有机溶剂中，制备成油相；将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于无RNA（核糖核酸，以下同）酶的水中，制备成水相，油相加入水相中，磁力搅拌或旋蒸除去有机溶剂，经离心或透析除去游离药物，制成PLGA载药纳米粒，将基因药物加入纳米粒溶液中，得到基于PLGA共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒，该纳米粒可有效用于制备治疗脑肿瘤靶向的药物中。制备共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA传递***纳米粒的方案是，将PLGA、化疗药物、荧光探针和辅料溶解于有机溶剂中，制备成油相；将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于无RNA酶的水中，油相加入水相中，磁力搅拌或旋蒸除去有机溶剂，最后经离心或者透析除去游离药物，得到共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒。
本发明方法稳定可靠，产品使用效果好，可以作为药物共载体系，能够同时传递小分子化学药物和基因药物，或者同时传递化疗药物和荧光探针通过血脑屏障进入脑部，发挥协同靶向治疗脑肿瘤或靶向治疗脑肿瘤与诊断于一体之功效，是脑肿瘤治疗药物上的创新，有巨大的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
由上述发明内容部分的给出技术方案，本发明在具体实施时，是由以下步骤实现的：
（1）、壳聚糖-angiopep-2聚合物的制备，方法是：
a、将壳聚糖20mg加入体积浓度为20%的乙酸溶液8mL中，在功率为300-500W超声溶解30min，用5M（即5mol/L）NaOH溶液调pH值至6.0，得壳聚糖溶液；
b、在壳聚糖溶液中加入3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯5mg，在氮气保护下、30℃、100r/min磁力搅拌反应48h，反应完成后，反应液置于截留分子量为8KD-14KD的透析袋中在PBS中透析60h，除去未反应的3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯，得透析液；
c、然后在透析液中加入巯基化的Angiopep-2 2mg，在氮气保护下、35℃、100-200r/min搅拌反应24h，得Angiopep-2修饰的壳聚糖，再置于截留分子量为8KD-14KD的透析袋中透析48h，除去游离的Angiopep-2，在-80℃冷冻真空干燥72h，得壳聚糖-angiopep-2聚合物，于-20℃贮存备用；
所述的巯基化的Angiopep-2为羧基末端为半胱氨酸的angiopep-2或angiopep-2 与Traut’s反应得到的巯基化angiopep-2中的一种。所述的羧基末端连接有半胱氨酸的angiopep-2为，在合成angiopep-2时，一个分子angiopep-2羧基末端通过化学反应连接一个分子的半胱氨酸；所述的angiopep-2与Traut’s反应后得到的巯基化的angiopep-2为，将Angiopep-2 5mg溶于20mL超纯水中，加入10mg Traut's试剂，50℃超声1h，使得Angiopep-2的末端具有巯基，然后置于截留分子量为8KD-14kD的透析袋中在PBS中透析48h，除去游离的angiopep-2和Traut’s，透析液在-80℃冷冻真空干燥72h，得到巯基化的Angiopep-2；
（2）、制备共载化疗药物和基因药物的靶向PLGA纳米粒，方法是：
a、将PLGA共聚物、化疗药物和辅料溶解于有机溶剂中（PLGA共聚物的浓度为5mg-50mg/ml，化疗药物的浓度为1mg/ml-10mg/ml，辅料的体积浓度为0.5%-1%），制备成油相；
所述的有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一种或两种以上的组合物；所述的PLGA共聚物为聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯︰乙交酯的重量比为为25︰75、50︰50、75︰25中的一种，PLGA的分子量为17kD，50KD，100kD中的一种。所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、柔红霉素、5-氟尿嘧啶中的一种；所述的辅料为司盘80、吐温20、吐温80中的一种或两种以上的组合物；
b、将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值为6的无RNA酶水中，制备成水相（表面活性剂浓度为5mg/ml-50mg/ml，壳聚糖-angiopep-2的浓度为0.02mg/ml-2mg/ml）；
所述的pH值为6的无RNA酶水是，先将水中加入1‰体积的焦碳酸二乙酯，25℃、500r/min磁力搅拌12h，121℃、102.9kPa条件下灭菌30min，用乙酸调pH值为6，成pH值为6的无RNA酶水；所述的表面活性剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、胆酸钠、卵磷脂的一种或两种以上的组合物；
c、将油相滴加入水相中（水相与油相的体积比为4-10），得到荷载正电荷PLGA共聚物载药纳米粒，经搅拌或旋蒸除去有机溶剂，得除去有机溶剂后的PLGA共聚物载药纳米粒溶液；
d、将除去有机溶剂后的PLGA共聚物载药纳米粒溶液经离心除去游离药物，或透析除去游离药物，再将基因药物加入纳米粒溶液中，得共载化疗药物和基因药物的靶向药物传递***纳米粒；
（3）共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒，方法是：
a、将PLGA共聚物、化疗药物和辅料溶解于有机溶剂中（PLGA共聚物的浓度为5mg-50mg/ml，化疗药物的浓度为1mg/ml-10mg/ml，辅料的体积浓度为0.5%-1%），制备成油相；
所述的有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一种或两种以上的组合物；所述的PLGA共聚物为聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯︰乙交酯的重量比为为25︰75、50︰50、75︰25中的一种，PLGA的分子量为17kD，50KD，100kD中的一种。所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、柔红霉素、5-氟尿嘧啶的一种或两种以上的组合物；所述的辅料为司盘80、吐温20、吐温80中的一种或两种以上的组合物；所述的荧光探针为吲哚菁绿、酞菁、香豆素-6、异硫氰酸荧光素（FITC）、亚甲蓝、罗丹明中的一种。
b、将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值为6的无RNA酶水中（表面活性剂浓度为5mg/ml-50mg/ml，壳聚糖-angiopep-2的浓度为0.02mg/ml-2mg/ml），制备成水相；
所述的pH值为6的无RNA的酶水是，先将水中加入1‰体积的焦碳酸二乙酯，25℃、500r/min磁力搅拌12h，用乙酸调pH值为6，121℃、102.9kPa条件下灭菌30min，成pH值为6的无RNA酶水；所述的表面活性剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、胆酸钠、卵磷脂的一种或两种以上的组合物；
c、将油相滴加入水相中（水相与油相的体积比为4-10），经搅拌或旋蒸除去有机溶剂，得除去有机溶剂的共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA共聚物载药纳米粒溶液，经离心除去游离药物，或透析除去游离药物，得最终的共载化疗药物和荧光探针的靶向药物传递***纳米粒；
共载化疗药物和基因的靶向PLGA共聚物纳米粒，作为药物，有效用于脑肿瘤治疗，实现共载化疗药物和基因的靶向PLGA共聚物纳米粒在治疗脑肿瘤药物中的应用；
共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA共聚物纳米粒，作为药物，有效用于化疗和荧光探针在脑肿瘤治疗、诊断中，实现共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA共聚物纳米粒在脑肿瘤治疗、诊断药物中的应用；
所述的脑肿瘤为U87、U251胶质瘤细胞，毛状星细胞瘤，星细胞瘤，分化不良星细胞瘤，多型性神经母细胞瘤中的一种。
为了进一步详细说明本发明的具体实施方案，特给出以下实施例：
实施例1
（1）、壳聚糖-angiopep-2聚合物的制备，方法是：
a、将壳聚糖20mg加入体积浓度为20%的乙酸溶液8mL中，在功率为500W超声溶解30min，用5M（即5mol/L）NaOH溶液调pH值至6.0，得壳聚糖溶液；
b、在壳聚糖溶液中加入3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯5mg，在氮气保护下、30℃、100r/min磁力搅拌反应48h，反应完成后，反应液置于截留分子量8kD-14kD的透析袋中在1000mL PBS中透析60h，除去未反应的3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯，得透析液；
c、称取Angiopep-2 5mg溶于20mL超纯水中，加入10mg Traut's试剂，超声1h，温度为50°C，使得Angiopep-2的末端具有巯基，置于截留分子量为8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，除去游离的angiopep-2 和Traut’s，透析液在-80℃冷冻真空干燥72h，得到巯基化的angiopep-2；
d、在步骤b中透析液中加入步骤c制备得到的巯基化的Angiopep-2 2mg，在氮气保护下、35℃、100-200r/min搅拌反应24h，得Angiopep-2修饰的壳聚糖，再置于截留分子量为8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，除去游离的Angiopep-2，在-80℃冷冻真空干燥72h，得壳聚糖-angiopep-2聚合物，于-20℃贮存。
实施例2
壳聚糖-angiopep-2聚合物的合成
1）称取壳聚糖20mg，加入8mL20%乙酸溶液，500W超声溶解，用5M NaOH调pH至6.0；
2）上述壳聚糖溶液中，加入3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯5mg，在氮气保护下加热30°C，100r/min磁力搅拌反应48h，反应完成后，反应液置于截留分子量8kD-14kD的透析袋中在1000mLPBS中透析除去未反应的3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯，透析60h；
3）取出透析袋中的溶液，加入末端为半胱氨酸的Angiopep-2（在合成Angiopep-2的时候羧基末端加一个半胱氨酸），在氮气保护下加热搅拌使其充分反应，Angiopep-2修饰的壳聚糖置于截留分子量为8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，以除去游离的Angiopep-2，最后-80°C冷冻干燥72h后，贮存于-20℃冰箱。
实例3
共载盐酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒的制备
1)称取100mgPLGA（聚丙交酯︰乙交酯=50︰50，分子量为17kD），溶解于10mL丙酮中，制备得到PLGA贮备液（10mg/mL），称取15mg盐酸阿霉素，溶解于5mL甲醇中，得到盐酸阿霉素贮备液（3mg/mL）；
2)称取1g 牛血清白蛋白，加入100mLpH值为6的无RNA酶水溶液中，溶解完全后，加入壳聚糖-Angiopep-2 62.5mg，超声溶解完全，作为水相；
3)取5mL盐酸阿霉素贮备液，加入10mLPLGA储备液（10mg/mL）中，超声1min，作为油相，把油相以1mL/min的速度逐滴在搅拌条件下（100rpm）加入60mL水相中，然后探头超声（功率200W，工作时间3s，间歇时间6s，工作次数20次）。在室温下磁力搅拌6h除去有机溶剂丙酮和甲醇。以12000rpm离心60min，弃去上清液得到纳米粒；
4)纳米粒pH值为6的无RNA酶水分散，-80℃冷冻干燥72h得到冻干的纳米粒。使用时用无RNA酶分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果，每一水平纳米粒溶液均配制3份，每份测量三次，取三次测量值的平均值作为测量结果，介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，所得结果为粒径为100～200nm，电位为+38mV～+18mv；
5)配制不同质量比的纳米粒和EGFR siRNA混合物，室温下孵育20min，通过琼脂糖凝胶电泳泳道条带亮度及位置确定纳米粒完全负载siRNA两者的比例，纳米粒和siRNA质量比为30～90时，纳米粒能够完全负载siRNA；
上述步骤5中的siRNA序列为：
Sense5′-3′ GUG UGU AAC GGA AUA GGU ATT
Ansense5′-3′ UAC CUA UUC CGU UAC ACA CTT。
实例4
共载多西他赛和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒的制备
1)称取150mgPLGA（聚丙交酯：乙交酯=50:50，分子量为17kD）和45mg多西他赛，溶解于15mL丙酮中，作为油相，PLGA浓度为10mg/mL，多西他赛浓度为3mg/mL；
2)称取1g 牛血清白蛋白，加入100mL pH值为6的无RNA酶水中，溶解完全后，用乙酸调节pH至6.0，加入壳聚糖-angiopep-2约62.5mg，超声溶解完全，作为水相；
3)取15mL油相以1mL/min的速度逐滴在搅拌条件下（100rpm）加入60mL水相中，然后探头超声（功率200W，工作时间3s，间歇时间6s，工作次数20次）。在室温下磁力搅拌6h除去有机溶剂丙酮和甲醇。以12000rpm离心60min，弃去上清液得到纳米粒；
4)纳米粒用pH值为6的无RNA酶水分散，-80℃冷冻干燥72h得到冻干的纳米粒。使用时用无RNA酶水分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果，每一水平纳米粒溶液均配制3份，每份测量三次，取三次测量值的平均值作为测量结果，介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，所得结果为粒径为100～200nm，电位为+38mV～+18mv；
5)配制不同质量比的纳米粒和siRNA混合物，室温下孵育20min，通过琼脂糖凝胶电泳泳道条带亮度及位置确定纳米粒完全负载siRNA两者的比例，纳米粒和siRNA质量比为30～90，纳米粒能够完全负载siRNA；
上述步骤5中的siRNA序列为：
Sense5′-3′ GUG UGU AAC GGA AUA GGU ATT
Ansense5′-3′ UAC CUA UUC CGU UAC ACA CTT。
实例5
共载多西他赛和香豆素-6的靶向PLGA纳米粒的制备
1)称取100mgPLGA（聚丙交酯：乙交酯=50:50，分子量为17kD）和30mg多西他赛，溶解于丙酮中，制备得到PLGA和多西他赛的贮备液，PLGA浓度为10mg/mL，多西他赛浓度为3mg/mL；
2)称取1mg香豆素-6，溶解于10mL丙酮中，得到香豆素-6贮备液（0.1mg/mL）；
3)称取1g 牛血清白蛋白，加入100mL 超纯水中，溶解完全后，用乙酸调节pH至6.0，加入壳聚糖-angiopep-2约62.5mg，超声溶解完全，作为水相；
4)取香豆素-6贮备液（0.1mg/mL）5mL，加入（1）中所制PLGA和多西他赛贮备液1mL中，500W超声1min，作为油相。把油相以1mL/min的速度逐滴在搅拌条件下（100rpm）加入60mL水相中，然后探头超声（功率200W，工作时间3s，间歇时间6s，工作次数20次）。在室温下磁力搅拌6h除去有机溶剂丙酮和甲醇，以12000rpm离心60min，弃去上清液得到纳米粒；
5)纳米粒用超纯水分散，-80℃冷冻干燥72h得到冻干的纳米粒。使用时用超纯水分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果，每一水平纳米粒溶液均配制3份，每份测量三次，取三次测量值的平均值作为测量结果，介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，所得结果为粒径为100～200nm，电位为+38mV～+18mv。
实例6
共载多西他赛和吲哚菁绿的靶向PLGA纳米粒的制备
1)称取100mgPLGA（聚丙交酯：乙交酯=50:50，分子量为17kD）和30mg 多西他赛，溶解于丙酮中，制备得到PLGA和多西他赛的贮备液，PLGA浓度为10mg/mL，多西他赛浓度为3mg/mL；
2)称取1mg吲哚菁绿，溶解于10mL甲醇中，得到吲哚菁绿贮备液（0.1mg/mL）；
3)称取1g 牛血清白蛋白，加入100mL 超纯水中，溶解完全后，用乙酸调节pH至6.0，加入壳聚糖-angiopep-2约62.5mg，超声溶解完全，作为水相；
4)取吲哚菁绿贮备液（0.1mg/mL）5mL，加入（1）中所制的PLGA贮备液和多西他赛贮备液10mL中，500W超声1min，作为油相，把油相以1mL/min的速度逐滴在搅拌条件下（100rpm）加入60mL水相中，然后探头超声（功率200W，工作时间3s，间歇时间6s，工作次数20次），在室温下磁力搅拌6h除去有机溶剂丙酮和甲醇，以12000rpm离心60min，弃去上清液得到纳米粒；
5)纳米粒用超纯水分散，-80℃冷冻干燥72h得到冻干的纳米粒。使用时用超纯水分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平纳米粒溶液均配制3份，每份测量三次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，所得结果为粒径为100～200nm，电位为+38mV～+18mv。
吲哚菁绿对近红外的吸光能力特别强，对于780nm的光，有文献报道，相同质量的吲哚菁绿吸收光的能力是单壁碳纳米管的7倍多，是纳米金棒的8500倍以上。本实施例中共载多西他赛和吲哚菁绿的PLGA靶向纳米粒可以有效的输送吲哚菁绿和多西他赛进入脑部，通过外部808nm激光发挥吲哚菁绿热疗效果，以期能够取得热疗和化疗联合***的作用。
共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒摄取进入脑肿瘤细胞U87MG或U251MG以及透过血脑屏障，实现脑肿瘤的治疗；
共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒抑制体外肿瘤细胞U87MG或U251MG，实现脑肿瘤的治疗；
共载化疗药物和基因药物或共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒抑制体内肿瘤A，实现脑肿瘤的治疗；所述肿瘤A为所述的脑肿瘤为U87、U251胶质瘤细胞，毛状星细胞瘤，星细胞瘤，分化不良星细胞瘤，多型性神经母细胞瘤中的一种。
上述共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒摄取进入脑肿瘤细胞U87MG或U251的评价采用激光共聚焦显微镜，观察脑肿瘤细胞U87MG或者U251MG经过共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒作用1h，2h，3h后细胞内的荧光分布情况。
上述共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒透过血脑屏障能力的评价采用激光共聚焦显微和活体成像技术。小鼠尾静脉注射共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒1h，2h，3h后取出脑组织，制备冷冻切片，直接在活体成像仪中观察药物在脑部的分布情况。或者用1μg/mL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色15min，用pH7.4的PBS冲洗两次，自然晾干，在激光共聚焦显微镜下观察脑组织中药物分布情况。
上述共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒透过血脑屏障能力的评价可以采用活体成像技术。小鼠尾静脉注射共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒，注射1h，2h，3h后，将小鼠麻醉，置于活体成像仪中观察药物在脑中的分布情况。脑部荧光越多越亮，药物透过血脑屏障的能力越强。
本发明方法稳定可靠，所得产品质量好，具有能够同时传递小分子化学药物和基因药物，或者同时传递化疗药物和荧光探针通过血脑屏障进入脑部，发挥协同靶向治疗脑肿瘤或靶向治疗脑肿瘤与诊断于一体之功效，共载化疗药物和基因药物的靶向PLGA纳米粒或者共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒可以将更多的药物递送进入脑部，使得不能透过血脑屏障的药物能够透过血脑屏障，降低药物在外周的分布，提高脑部药物浓度，增加药物应用的安全性，并经试验取得了有益的技术效果，有关试验资料如下：
1、载药***转运进入U87 MG细胞的考察
由于流式细胞仪测定siRNA转染率要求药物具有荧光，因此在实施本实例的过程中，实例3中载药***中的siRNA改为羧基荧光素(FAM)标记的siRNA，碱基组成和实例3中的EGFR siRNA相同。
将U87 MG细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的MEM培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，用有血无抗体调整细胞悬液浓度，6孔板每孔加入2 mL，铺板使待测细胞调密度至2×105个/孔。置于5% CO2，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(6孔平底板)。弃去培养基，用无血无抗培养基清洗细胞孔2次，加入共载盐酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒，其中盐酸阿霉素的浓度为3.6μg/mL，siRNA浓度为50nmol/L。培养5h后，每个孔用PBS清洗两次，用不含EDTA的胰酶消化细胞2min，加入含有血清的培养基终止消化，收集细胞，1000rpm离心5min，弃去上清，用PBS垂悬细胞，用BD AccuriTM C6流式细胞仪进行检测。数据分析应用Flow Jo7.6.1软件首先进行荧光补偿，然后在FL2和FL1通道分别分析细胞对盐酸阿霉素和siRNA的转染率。
实验结果表明，载药***中siRNA的转染率为79%，盐酸阿霉素的转染率为85%。
2、纳米粒***透过血脑屏障进入脑部的情况试验
取正常BALB/c-nu小鼠，尾静脉注射实例5中共载多西他赛和香豆素-6的靶向PLGA纳米粒（香豆素-6剂量0.16mg/kg）。在预定时间点（注射后1h，2h和3h）采用水合氯醛麻醉小鼠后剪开胸腔，动作要快，经左心室***头皮针连接的20mL注射器，头皮针磨钝，从以身体纵轴45℃方向进针，针尖***升主动脉内，可以看见，动作要轻柔，同时剪开右心儿，推入20mL 生理盐水推完以后迅速的换4 ℃多聚甲醛20mL。剪开头皮，取出脑，用OCT胶包埋，置于-20℃预冷，固定脑组织，在-20℃用冷冻切片机切片，切片厚度5μm，置于载玻片上。用1μg/mL的DAPI避光染色15min，用pH7.4的PBS清洗三次以除去多余的DAPI。在激光共聚焦纤维镜下观察纳米粒进入脑部的情况并拍照。
脑组织切片中的绿色荧光亮点越多，颜色越深，细胞核周围的亮点越多越深，纳米粒透过血脑屏障的量越多。结果表明，在1h，2h，3h，载药***在脑部均有分布，并且2h和3h纳米粒在脑部的分布明显增多。2h和3h脑内纳米粒的分布没有明显差异。
3、纳米粒体外抗肿瘤实验
将U87MG 脑胶质瘤细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将U87MG细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的MEM培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。置于5% CO2，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入实例3中的共载盐酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒，其中盐酸阿霉素浓度浓度为0.18μg/mL，0.36μg/mL，0.78μg/mL，EGFR siRNA的浓度为50nmol/L，以不加入本发明的药物转运***为对照组，设置复孔为4～6个。细胞板置于5%CO2培养箱中孵育48 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在565 nm处测定每孔的OD值。抑制率的计算公式：抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
结果表明，药物作用48h后，载药***对U87细胞的细胞抑制率分别为43%（盐酸阿霉素浓度为0.18μg/mL，EGFR siRNA浓度为50nmol/L），65%（盐酸阿霉素浓度为0.36μg/mL，EGFR siRNA浓度为50nmol/L），76%（盐酸阿霉素浓度为0.78μg/mL，EGFR siRNA浓度为50nmol/L）。
4、载药***在脑肿瘤治疗中的应用
所有的动物实验都依照郑州大学伦理委员会评估和认可的指南进行。
1)在超净台中用戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉BALB/c-nu裸鼠。
2)首先用碘伏消毒待手术区，用手术剪在前颅处剪开头皮，在颅骨前约3mm，右约2mm进针5mm，拔出1mm，以1μl/min的速度注射U87MG肿瘤细胞悬液10μl（1×107）。注射后，停留10min，拔出针。
3)缝合手术切口，用碘伏消毒手术区。在IVC动物房饲养7天后，分为四组，组别分别为生理盐水组，载盐酸阿霉素的靶向PLGA纳米粒组，载EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒组，共载盐酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒组，其中盐酸阿霉素剂量为3mg/kg，EGFR siRNA的剂量为1.2mg/kg。隔一天给药一次，给药5次，记录动物的存活期，利用GraphPad Prism 5.0计算各组动物的中位生存期。
实验结果，生理盐水组，载盐酸阿霉素的靶向PLGA纳米粒组，载EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒组，共载盐酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒组动物的中位生存期分别为18±0.8天，2.1±2.0天，19±3.0天，28±2.7天。实验结果表明，共载盐酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒组能够显著提高动物的中位生存期（与生理盐水相比P<0.05），而载盐酸阿霉素的靶向PLGA纳米粒，载EGFR siRNA的靶向PLGA纳米粒组的动物中位生存期与生理盐水相比均没有显著性差异。
上述表明，本发明提供了一种基于PLGA的靶向药物共载传递***、制备方法以及在脑肿瘤治疗中的应用。本发明的基于PLGA的靶向药物共载传递***，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。基于PLGA的靶向药物传递***，Angiopep-2作为靶头，该纳米粒载药***可以透过血脑屏障，测试结果表明无论是体外还是体内都可以很好的抑制肿瘤细胞以及肿瘤组织的发生和发展，具有很好抗脑肿瘤的效果。预期可以用于联合装载化疗药物和基因药物或者联合装载化疗药物和荧光探针，是脑肿瘤治疗药物上的一大创新。与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：
1）本发明的Angiopep-2修饰的壳聚糖作为一种新型的载体材料和PLGA共同制备荷正电的PLGA纳米粒载药***，可以同时装载各种化疗药物和基因药物，具有广谱性。
2）本发明提供的基于PLGA的靶向纳米粒载药***所用材料均生物可降解，无毒副作用，生物相容性好，具有缓释和靶向性，价廉易得，产品质量好，使用安全，成本低，仅是同类药物成本的1/3。
3）本发明提供的基于PLGA的靶向纳米粒载药***可以透过血脑屏障，体内外都具有抗脑胶质瘤的效果。
4）本发明提供的共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒不但可以实现脑肿瘤的靶向治疗，而且可以实现活体肿瘤靶向示踪，经临床116名脑肿瘤患者应用，除1人无明显效果外，其余均取得了不同程度的有益疗效，有效率达99%以上，其效果之好是未曾料到的，有实际的临床意义，经济和社会效益巨大。
Claims (8)
1.一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法，其特征在于，利用壳聚糖上的活性氨基连接Angiopep-2，首先壳聚糖与3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺反应，使壳聚糖的氨基末端具有马来酰亚胺，再与末端巯基化的Angiopep-2的巯基反应，得到壳聚糖-angiopep-2聚合物，将该聚合物用于基于PLGA的靶向共载药物传递***的制备，制备共载化疗药物和基因药物的靶向PLGA纳米粒的方法是，PLGA、化疗药物和辅料溶解于有机溶剂中，制备成油相；将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于加有无RNA酶水中，成水相，油相加入水相中，磁力搅拌或旋蒸除去有机溶剂，经离心或透析除去游离药物，制成PLGA载药纳米粒，将基因药物加入纳米粒溶液中，得到基于PLGA共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒；制备共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒的方法是，将PLGA、化疗药物、荧光探针和辅料溶解于有机溶剂中，制备成油相；将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于无RNA酶的水中，油相加入水相中，磁力搅拌或旋蒸除去有机溶剂，经离心或者透析除去游离药物，得到共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒。
2.根据权利要求1所述的基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）、壳聚糖-angiopep-2聚合物的制备，方法是：
a、将壳聚糖20mg加入质量浓度为20%的乙酸溶液8mL中，在功率为300-500W超声溶解30min，用5M NaOH溶液调pH值至6.0，得壳聚糖溶液；
b、在壳聚糖溶液中加入3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯5mg，在氮气保护下、30℃、100r/min磁力搅拌反应48h，反应完成后，反应液置于截留分子量为8KD-14KD的透析袋中在PBS中透析60h，除去未反应的3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯，得透析液；
c、然后在透析液中加入巯基化的Angiopep-2 2mg，在氮气保护下、35℃、100-200r/min搅拌反应24h，得Angiopep-2修饰的壳聚糖，再置于截留分子量为8KD-14KD的透析袋中透析48h，除去游离的Angiopep-2，在-80℃冷冻真空干燥72h，得壳聚糖-angiopep-2聚合物，于-20℃贮存备用；
所述的巯基化的Angiopep-2为羧基末端为半胱氨酸的angiopep-2或angiopep-2 与Traut’s反应后得到的巯基化angiopep-2中的一种；所述的羧基末端连接有半胱氨酸的angiopep-2为，在合成angiopep-2时一个分子angiopep-2羧基末端通过化学反应连接一个分子的半胱氨酸；所述的angiopep-2与Traut’s反应后得到的巯基化的angiopep-2为，将Angiopep-2 5mg溶于20mL超纯水中，加入10mg Traut's试剂，50℃超声1h，使得Angiopep-2的末端具有巯基，然后置于截留分子量为8KD-14kD的透析袋中在PBS中透析48h，除去游离的angiopep-2和Traut’s，透析液在-80℃冷冻真空干燥72h，得到巯基化的Angiopep-2；
（2）、制备共载化疗药物和基因药物的靶向PLGA纳米粒，方法是：
a、将PLGA共聚物、化疗药物和辅料溶解于有机溶剂中，PLGA共聚物的浓度为5mg-50mg/ml，化疗药物的浓度为1mg/ml-10mg/ml，辅料的体积浓度为0.5%-1%，制备成油相；
所述的有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一种或两种以上的组合物；所述的PLGA共聚物为聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯︰乙交酯的重量比为为25︰75、50︰50、75︰25中的一种，PLGA的分子量为17kD，50KD，100kD中的一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、柔红霉素、5-氟尿嘧啶中的一种；所述的辅料为司盘80、吐温20、吐温80中的一种或两种以上的组合物；
b、将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值为6的无RNA酶水中，制备成水相，表面活性剂浓度为5 -50mg/ml，壳聚糖-angiopep-2的浓度为0.02 -2mg/ml；
所述的pH值为6的无RNA酶水是，先将水中加入1‰体积的焦碳酸二乙酯，25℃、500r/min磁力搅拌12h，用乙酸调节pH为6，121℃、102.9kPa条件下灭菌30min；所述的表面活性剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、胆酸钠、卵磷脂的一种或两种以上的组合物；
c、将油相滴加入水相中，水相与油相的体积比为4-10，得到荷载正电荷PLGA共聚物载药纳米粒，经搅拌或旋蒸除去有机溶剂，得除去有机溶剂后的PLGA共聚物载药纳米粒溶液；
d、将除去有机溶剂后PLGA共聚物载药纳米粒溶液经离心除去游离药物，或透析除去游离药物，再将基因药物加入纳米粒溶液中，得共载化疗药物和基因药物的靶向药物传递***纳米粒；
（3）共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA纳米粒，方法是：
a、将PLGA共聚物、化疗药物和辅料溶解于有机溶剂中，PLGA共聚物的浓度为5-50mg/ml，化疗药物的浓度为1 -10mg/ml，辅料的体积浓度为0.5-1%，制备成油相；
所述的有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一种或两种以上的组合物；所述的PLGA共聚物为聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯︰乙交酯的重量比为为25︰75、50︰50、75︰25中的一种，PLGA的分子量为17kD，50KD，100kD中的一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、柔红霉素、5-氟尿嘧啶的一种或两种以上的组合物；所述的辅料为司盘80、吐温20、吐温80中的一种或两种以上的组合物；所述的荧光探针为吲哚菁绿、酞菁、香豆素-6、异硫氰酸荧光素（FITC）、亚甲蓝、罗丹明中的一种；
b、将表面活性剂和壳聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值为6的无RNA酶水中，表面活性剂浓度为5 -50mg/ml，壳聚糖-angiopep-2的浓度为0.02 -2mg/ml，制备成水相；
所述的pH值为6的无RNA的酶水是，先将水中加入1‰体积的焦碳酸二乙酯，25℃、500r/min磁力搅拌12h，用乙酸调pH值为6，121℃、102.9kPa条件下灭菌30min，成pH值为6的无RNA酶水；所述的表面活性剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、胆酸钠、卵磷脂的一种或两种以上的组合物；
c、将油相滴加入水相中，水相与油相的体积比为4-10，经搅拌或旋蒸除去有机溶剂，得除去有机溶剂的共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA共聚物载药纳米粒溶液，经离心除去游离药物，或透析除去游离药物，得共载化疗药物和荧光探针的靶向药物传递***纳米粒。
3.根据权利要求1所述的基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖-angiopep-2聚合物的制备，方法是：
a、将壳聚糖20mg加入质量浓度为20%的乙酸溶液8mL中，在功率为500W超声溶解30min，用5M NaOH溶液调pH值至6.0，得壳聚糖溶液；
b、在壳聚糖溶液中加入3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯5mg，在氮气保护下、30℃、100r/min磁力搅拌反应48h，反应完成后，反应液置于截留分子量8kD-14kD的透析袋中在1000mL PBS中透析60h，除去未反应的3-马来酰亚胺丙酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯，得透析液；
c、称取Angiopep-2 5mg溶于20mL超纯水中，加入10mg Traut's试剂，超声1h，温度为50℃，使得Angiopep-2的末端具有巯基，置于截留分子量为8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，除去游离的angiopep-2 和Traut’s，透析液在-80℃冷冻真空干燥72h，得到巯基化的angiopep-2；
d、在步骤b中透析液中加入步骤c制备得到的巯基化的Angiopep-2 2mg，在氮气保护下、35℃、100-200r/min搅拌反应24h，得Angiopep-2修饰的壳聚糖，再置于截留分子量为8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，除去游离的Angiopep-2，在-80℃冷冻真空干燥72h，得壳聚糖-angiopep-2聚合物，于-20℃贮存。
4.根据权利要求1所述的基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖-angiopep-2聚合物的制备，方法是：
1）称取壳聚糖20mg，加入8mL20%乙酸溶液，500W超声溶解，用5M NaOH调pH至6.0；
2）上述壳聚糖溶液中，加入3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯5mg，在氮气保护下加热30°C，100r/min磁力搅拌反应48h，反应完成后，反应液置于截留分子量8kD-14kD的透析袋中在1000mLPBS中透析除去未反应的3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酸亚胺酯，透析60h；
3）取出透析袋中的溶液，加入末端为半胱氨酸的Angiopep-2，在氮气保护下加热搅拌使其充分反应，Angiopep-2修饰的壳聚糖置于截留分子量为8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，以除去游离的Angiopep-2， -80°C冷冻干燥72h，贮存于-20℃冰箱。
5.根据权利要求1所述的基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法，其特征在于：
1)称取100mgPLGA，聚丙交酯︰乙交酯=50︰50，分子量为17kD，溶解于10mL丙酮中，制备得到PLGA贮备液10mg/mL，称取15mg盐酸阿霉素，溶解于5mL甲醇中，得到盐酸阿霉素贮备液3mg/mL；
2)称取1g 牛血清白蛋白，加入100mL含有体积1‰DEPC的水溶液中，溶解完全后，用乙酸调节pH至6.0，加入壳聚糖-Angiopep-2 62.5mg，超声溶解完全，作为水相；
3)取5mL盐酸阿霉素贮备液，加入10mLPLGA储备液中，超声1min，作为油相，把油相以1mL/min的速度逐滴在100rpm搅拌条件下加入60mL水相中，然后探头超声，功率200W，工作时间3s，间歇时间6s，工作次数20次，在室温下磁力搅拌6h除去有机溶剂丙酮和甲醇，以12000rpm离心60min，弃去上清液得到纳米粒。
6.根据权利要求1所述的基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒的制备方法，其特征在于：
1)称取150mgPLGA，聚丙交酯：乙交酯=50:50，分子量为17kD，和45mg多西他赛，溶解于15mL丙酮中，作为油相，PLGA浓度为10mg/mL，多西他赛浓度为3mg/mL；
2)称取1g 牛血清白蛋白，加入100mL DEPC水中，溶解完全后，用乙酸调节pH至6.0，加入壳聚糖-angiopep-2约62.5mg，超声溶解完全，作为水相；
3)取15mL油相以1mL/min的速度逐滴在100rpm搅拌条件下加入60mL水相中，然后探头超声，功率200W，工作时间3s，间歇时间6s，工作次数20次，在室温下磁力搅拌6h除去有机溶剂丙酮和甲醇，以12000rpm离心60min，弃去上清液得到纳米粒。
7.权利要求1所述方法制备的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒，在治疗脑肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的靶向共载药物传递***纳米粒在治疗脑肿瘤药物中的应用，其特征在于，共载化疗药物和基因的靶向PLGA共聚物纳米粒在治疗脑肿瘤药物中的应用，或共载化疗药物和荧光探针的靶向PLGA共聚物纳米粒在脑肿瘤治疗、诊断药物中的应用。
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