CN108884490A - 基因分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用了流式细胞术的可靠性高的基因分析方法。基因分析方法包括如下工序：染色工序，对细胞进行染色；分取工序，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析第1信息，并根据分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器中；扩增工序，扩增分取到容器中的细胞的DNA；分析工序，对经扩增的DNA进行基因分析；以及条件确定工序，根据在扩增工序中获取的第2信息和在分析工序中获取的第3信息中的至少一个信息，对提取条件进行再确定。

Description

基因分析方法
技术领域
本发明涉及一种基因分析方法。
背景技术
已知利用流式细胞术从试样液体分离并分取目标细胞的方法。
例如，专利文献1中记载有如下方法：利用流式细胞仪(流式细胞术中使用的装置)的分选功能，将由于染色体异常而产生的一部分细胞分离而成的微小细胞(小核)分离并回收为主核(亲核)和小核。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2000-157298号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
在流式细胞术中，通过从细胞获取前方散射光、侧方散射光以及荧光强度的信息来分选细胞，并针对目标细胞，在具有多个孔的容器中将一个细胞分取到一个孔中。将分取有细胞的容器旋转在PCR(Polymerase Chain Reaction(聚合酶链反应))装置中，扩增DNA(Deoxyribonucleic Acid(脱氧核糖核酸))并进行基因分析。
但是，在流式细胞术中，由于根据荧光强度的信息而分选目标细胞，因此存在由于染色的非特异性而导致错误分选的情况。并且，当分取细胞时，存在无法分选死细胞的情况。并且，还存在仅根据流式细胞术的荧光强度的信息很难进行分选的情况。例如，在流式细胞术中，虽然能够分选有核红细胞，但是很难将有核红细胞分选为来自母体的有核红细胞和来自胎儿的有核红细胞。
如上所述，当在流式细胞术中无法准确地分选目标细胞时，对之后的基因分析结果的可靠性会下降，并且包括会下达错误判断的问题。
本发明是鉴于这种情况而完成的，其目的在于提供一种利用了流式细胞术的可靠性高的基因分析方法。
用于解决技术课题的手段
根据本发明的一种方式，基因分析方法包括如下工序：染色工序，对细胞进行染色；分取工序，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析第1信息，并根据分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器中；扩增工序，扩增分取到容器中的细胞的DNA；分析工序，对经扩增的DNA进行基因分析；以及条件确定工序，根据在扩增工序中获取的第2信息和在分析工序中获取的第3信息中的至少一个信息，对提取条件进行再确定。
优选细胞的染色是通过抗原抗体反应进行的免疫染色。
优选第1信息是由免疫染色引起的荧光发光、前方散射光和侧方散射光中的至少一个信息。
优选在分取工序与扩增工序之间具备拍摄分取到容器中的细胞的摄像工序，并根据在摄像工序中获取的第4信息，对提取条件进行再确定。
优选第4信息包含细胞的荧光强度、形状、颜色和大小中的至少一个。
优选第2信息包含有无DNA扩增，第3信息包含有无目标细胞。
优选扩增工序包括聚合酶链反应。
优选基因分析选自由DNA微阵列法、数字PCR法、实时PCR法、测序法及其组合组成的组。
优选在染色工序之前具备提高溶剂中的细胞浓度的浓缩工序。
根据本发明的另一方式，基因分析方法包括如下工序：染色工序，对细胞进行染色；分取工序，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析第1信息，并根据分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器中；摄像工序，拍摄分取到容器中的细胞；扩增工序，扩增分取到容器中的细胞的DNA；分析工序，对经扩增的DNA进行基因分析；以及条件确定工序，根据在扩增工序中获取的第2信息、在分析工序中获取的第3信息和在摄像工序中获取的第4信息中的至少一个信息，对提取条件进行再确定。
发明效果
根据本发明的基因分析方法，能够实现利用了流式细胞术的可靠性高的基因分析。
附图说明
图1是表示第1实施方式的基因分析方法的步骤的流程图。
图2是流式细胞仪的概念图。
图3是选择出含有有核红细胞的区域的散点图。
图4是选择出认为出现红细胞的区域的散点图。
图5是选择出认为出现有核红细胞的区域的散点图。
图6是容器的立体图。
图7是容器的立体图。
图8是针对图5的散点图，根据扩增工序的第2信息对提取条件进行再确定之后的散点图。
图9是针对图8的散点图，根据分析工序的第3信息对提取条件进行再确定之后的散点图。
图10是表示第2实施方式的基因分析方法的步骤的流程图。
图11是图像摄像装置的概略结构图。
图12是针对图5的散点图，根据摄像工序的第4信息对提取条件进行再确定之后的散点图。
图13是针对图12的散点图，根据扩增工序的第2信息对提取条件进行再确定之后的散点图。
具体实施方式
以下，根据附图对本发明的优选实施方式进行说明。本发明通过以下优选实施方式进行说明。在不脱离本发明的范围的情况下，能够通过许多方法进行变更，并且能够利用除了实施方式以外的其他实施方式。因此，本发明的范围内的所有变更包含在专利要求范围内。
在此，图中，由相同记号表示的部分为具有相同功能的相同要素。并且，在本说明书中，当用“～”表示数值范围时，由“～”表示的上限、下限的数值也设为包含在数值范围内。
＜基因分析方法＞
(第1实施方式)
参考附图对第1实施方式的基因分析方法进行说明。另外，在本实施方式中，例示出试样液体中含有血细胞并且目标细胞是来自胎儿的有核红细胞的情况进行说明。
图1是第1实施方式的基因分析方法的流程图。如图1所示，基因分析方法至少具备染色工序(步骤S1)、分取工序(步骤S2)、扩增工序(步骤S3)、分析工序(步骤S4)以及条件确定工序(步骤S5)。
在染色工序(步骤S1)中，对细胞进行染色。在分取工序(步骤S2)中，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析第1信息，并根据分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器。在扩增工序(步骤S3)中，对分取到容器中的细胞的DNA进行扩增。在分析工序(步骤S4)中，对经扩增的DNA进行基因分析。在条件确定工序(步骤S5)中，根据在扩增工序中获取的第2信息和在分析工序中获取的第3信息中的至少一个信息，对提取条件进行再确定。以下，对各工序进行说明。
＜染色工序(步骤S1)＞
在本实施方式中具有对细胞进行染色的工序。通过对细胞进行染色，从而能够在后述流式细胞术中获取来自试样液体的细胞的第1信息。
细胞的染色优选为通过抗原抗体反应进行的免疫染色。抗原抗体反应是指抗体与具有互补性结构的抗原的特异性结合，免疫染色是指使连结有荧光色素的抗体与存在于细胞中的抗原结合。
免疫染色具有直接法和间接法，直接法是将荧光色素直接与抗体连结并使其与抗原进行反应的方法。另一方面，间接法是在能够与应检测抗原特异性结合的抗体(一次抗体)上不连结荧光色素，但在能够与该一次抗体特异性结合的抗体(二次抗体)上连结荧光色素而进行检测的方法。
作为通过抗原抗体反应对细胞进行免疫染色的抗体，例如作为抗人CD抗体，能够例示抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD14抗体、抗CD25抗体、抗CD45抗体、抗CD71抗体以及抗CD127抗体等，作为荧光色素，可举出4’,6-二脒-2’-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI：4',6-diamidino-2-phenylindole)、碘化丙啶(PI：Propidium Iodide)、派洛宁Y(Pyronin Y)、异硫氰酸荧光素(FITC：fluorescein isothiocyanate)、藻红蛋白(PE：phycoerythrin)、别藻蓝蛋白(APC：allophycocyanin)、Texas Red(TR(注册商标))、Hoechst33342、7-氨基-放线菌素D(7-AAD)、2'-脱氧胞苷5’-三磷酸(Cy3)、磺基吲哚菁琥珀酰亚胺酯(Cy5)、DRAQ5(注册商标)、亮紫(Brilliant Violet)570以及亮紫421等。
如下制备试样液体。首先，准备含有目标细胞的分析对象试样。在分析对象试样中例如混合免疫染色中使用的荧光着色的抗体并进行培养，由此细胞被免疫染色。制备出含有通过抗原抗体反应而免疫染色的细胞的试样液体。
＜分取工序(步骤S2)＞
在分取工序中，使用用于实现流式细胞术的流式细胞仪10获取来自试样液体的细胞的第1信息，并根据已确定的提取条件对第1信息进行分析，并且根据分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器中。
提取条件例如通过观察散点图的分布并根据过去的见解来确定。
图2是流式细胞仪10的概念图。试样液体S中含有血细胞，该血细胞中含有通过抗原抗体反应而免疫染色的细胞C。
试样液体S从喷嘴102导入到流动池104中。鞘液L导入到流动池104中。在流动池104内通过鞘液L挤压试样液体S。通过挤压试样液体S，细胞C被排成一列。
例如激光从光源106照射到细胞C。通过激光的照射激发细胞C的免疫染色，细胞C发出通过免疫染色的荧光。通过检测器108检测该荧光发光的荧光强度。获取通过检测器108检测到的细胞C的荧光发光作为来自细胞的第1信息，并将其输入并存储到控制部120。控制部120具备：进行各种处理的运算部；以及存放各种程序和数据等的存储部等。
从光源106照射激光，并通过检测器110检测通过免疫染色且来自细胞C的前方散射光、侧方散射光。获取通过检测器110检测到的由来自细胞C的前方散射光、侧方散射光引起的荧光强度作为来自细胞的第1信息，并将其输入并存储到控制部120。
作为第1信息，例示出获取通过免疫染色的荧光发光、前方散射光和侧方散射光的信息的情况，但作为第1信息，获取由免疫染色引起的荧光发光、前方散射光和侧方散射光中的至少一个信息即可。
另外，通过作为第1信息获取的前方散射光测定测定对象的细胞的大小，并且通过侧方散射光和荧光发光测定测定对象物的细胞的结构等。
流动池104中形成施加有超声波且含有细胞C的液滴。控制部120根据上述检测结果使液滴带正电或负电。控制部120不使废弃的液滴带电。当通过偏转电极板112、114时，通过将带电液滴吸引到偏转电极板112、114中的任一个中，从而基本上将一个细胞分取到容器20中的一个孔中。
作为激发免疫染色的光源106，优选使用波长不同的多个激光光源。例如优选具备：具有405nm的波长的激光光源、具有488nm的波长的激光光源；具有561nm的波长的激光光源；以及具有683nm的波长的激光光源。通过使用波长不同的多个激光光源，能够得到多个荧光强度作为来自细胞的第1信息。
并且，为了同时检测荧光强度，优选使用荧光滤光片，该荧光滤光片截止激光光源的激发光，并且选择性地透射通过免疫染色的荧光色素的发光波长。
流式细胞仪10的控制部120中存储有分析程序，该分析程序用于根据来自细胞的第1信息(通过免疫染色的荧光发光、前方散射光和侧方散射光)，对检测结果进行分析。控制部120获取来自细胞的第1信息，并根据已确定的提取条件对第1信息进行分析。
例如，控制部120例如能够根据来自细胞的第1信息，制作将荧光发光、前方散射光和侧方散射光中的任一个作为纵轴或横轴的散点图(散布图)。由于根据来自细胞的第1信息制作散点图来分取目标细胞，因此能够将检测到的所有细胞分离成多个群。并且，在根据第1信息制作出的散点图上，通过指定区域(所谓的门控(gating))或将区域设为指定外部(所谓的门输出(gate out))，能够分离图上的所有细胞或者从群中分离其他群，从而能够缩小为含有目标细胞的群。
本实施方式中，第1信息的分析包括从来自细胞的第1信息到缩小为含有目标细胞的群为止的一系列处理，提取条件能够通过将用于制作散点图的纵轴或横轴的选择、适当地组合用于从群中分离其他群的门控、门输出等来确定。
图3至图5示出根据已确定的提取条件对第1信息进行分析的情况的一例。图3是选择出含有有核红细胞的区域的散点图。图4是选择了出现红细胞的区域的散点图。图5是选择了出现有核红细胞的区域的散点图。
图3是将侧方散射光的荧光强度作为纵轴、将前方散射光的荧光强度作为横轴的散点图。图3的散点图中显示出通过流动池且获取有第1信息的所有细胞。图3中，通过门控选择认为含有有核红细胞的区域W1，另一方面，从区域W1排除血小板。通过该门控，从所有细胞中分离含有有核红细胞的区域W1的群。
接着，图4是以在图3中选择出的区域W1的群为对象，并且将前方散射光的荧光强度作为纵轴、将CD45：亮紫421的荧光强度作为横轴的散点图。CD45是白细胞共同抗原，白细胞通过亮紫421被免疫染色。因此，通过对CD45阴性进行门控，可选择认为出现红细胞的区域W2。从其他群中分离认为出现红细胞的群。另外，区域W3是认为出现粒细胞的群，区域W4是认为出现淋巴细胞和单核细胞的群。
接着，图5是以在图4中选择出的区域W2的群为对象，并且将CD71：FITC的荧光强度作为纵轴、将DRAQ5：APC的荧光强度作为横轴的散点图。CD71：FITC的荧光强度与红细胞的幼弱性有关，DRAQ5：APC的荧光强度与细胞核有关。因此，通过对DRAQ5：APC阳性进行门控，可选择认为出现有核红细胞的区域W5。从其他群中分离认为出现有核红细胞的群。
本实施方式中，对于从上述分析结果通过区域W5选择出的认为出现有核红细胞的群，通过流式细胞仪10分取到容器20中。
接着，对分取细胞的容器20进行说明。图6和图7是容器20的立体图。
如图6所示，容器20具有：多个孔202，为了回收多个细胞而具有开口和底面；以及侧壁204，与多个孔202一体构成。多个孔202配置成行和列。为了指定各个孔202的位置，在容器20的孔202的开口侧显示有表示行的数值和表示列的字母。在图6中示出的容器20中，细胞回收到各个孔202中。为了指定容器20，在容器20的侧壁例如显示有条形码等识别标志206。
如图7所示，与图6不同形态的容器20具有：多个管208，具有用于回收多个细胞的开口和底面；以及支撑部件210，具备用于保持多个管208的多个孔212。如图7所示，在容器20中，管208发挥孔的功能。只要具有用于容纳细胞的开口和底面，则孔的形状等并没有限定。
多个孔212形成为行和列。为了指定各个孔212的位置，在容器20的形成有孔212的一侧显示有表示行的数值和表示列的字母。在图7中示出的容器20中，细胞回收到被支撑部件210保持的各个管208中。而且，为了指定容器20，在支撑部件210的侧壁例如显示有条形码等识别标志206。另外，管208例如可以是一个单位的管，也可以是连结有多个的管。并且，管208也可以是具有盖(未图示)的管。
如上所述，通过流式细胞仪10选择出的区域W5的细胞作为目标细胞而基本以一个单位细胞分取到容器20中的孔202或容器20的管208中。
控制部120优选将容纳有细胞的容器20的位置(孔202或管208)与来自该细胞的第1信息建立关联而进行存储。容纳有细胞的容器20的位置优选通过显示在容器20的行、列以及识别标志206来指定。
＜扩增工序(步骤S3)＞
在扩增工序中，对分取到容器中的细胞的DNA进行扩增。扩增工序优选包括聚合酶链反应。以下，以聚合酶链反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)为例来对扩增工序进行说明。
含有已分取的细胞的容器20放置到PCR装置中。放置到PCR装置中的容器可以是分取有在流式细胞仪10中使用的细胞的容器20，或者也可以是从容器20移动了细胞的PCR用容器。分取到容器中的细胞是指在分取工序中分取到容器中的细胞，并且在扩增工序中对该细胞进行扩增即可，并非表示使用分取工序的容器的细胞。但是，当放置到PCR装置中的容器与在流式细胞仪10中使用的容器20不同时，将分取工序中的来自细胞的第1信息与分取有细胞的容器20的位置信息在放置到PCR装置的容器中建立关联而例如存储于控制部120。
在PCR装置中，第一，将反应液加热至94℃左右，将温度保持30秒至1分钟，并将双链DNA分离为单链。第二，将反应液迅速冷却至60℃左右，将该单链DNA和引物加热(退火)至规定的温度，并对单链DNA和引物进行加热。第三，使DNA聚合酶与引物进行反应，不发生单链DNA与引物的分离，并加热至适合DNA聚合酶活性的温度(60～72℃左右)。使该状态持续DNA进行合成所需的时间(取决于扩增的长度，但通常为1～2分钟)。
将第一至第三作为一个循环，并通过执行多个循环例如20个循环，能够扩增特定的DNA片段。通常，如果将PCR处理进行n次循环，则能够从一个双链DNA将目标部分扩增为2n倍。
另外，上述扩增步骤是示出聚合酶链反应的一例的步骤，并不限定于此。
在扩增工序中，获取与扩增结果有关的第2信息。例如，优选作为第2信息，获取目标细胞的DNA是否经扩增，即优选获取扩增的有无作为第2信息。根据扩增的有无，能够判断已分取的细胞是活细胞还是死细胞。将来自细胞的第1信息与在扩增工序中获取的第2信息建立关联而例如输入并存储于控制部120。
与有无DNA扩增相关的第2信息优选能够通过对DNA片段使用琼脂糖凝胶进行电泳来获取。能够通过电泳确认DNA的有无，或者根据DNA尺寸确认DNA扩增的有无。
＜分析工序(步骤S4)＞
在分析工序中，对经扩增的DNA进行基因分析。基因分析优选选自由DNA微阵列法、数字PCR法、实时PCR法、测序法及其组合组成的组中。作为基因分析，并没有特别限定，而且可以使用nCounter***(System)(NanoString公司)。在本实施方式中，从分析的精度和速度、能够一次处理的试样数的多少等方面考虑，优选使用所谓的下一代测序仪法。
DNA微阵列法是通过在基板上高密度地配置细胞的DNA片段并与板上的DNA序列进行杂交，从而对在细胞内表达的基因信息进行分析的方法。
数字PCR法是将对象样品分配到多个孔中，分别并行地执行PCR，并且在扩增结束时对阳性反应的数量进行计数的方法。
在本实施方式中，下一代测序仪是指与利用到Sanger法的毛细管测序仪(称为第一代测序仪)进行比较而分类的测序仪。下一代测序仪包括第二代、第三代、***。目前最普及的下一代测序仪是如下原理的测序仪，即，捕获与通过DNA聚合酶的互补链合成或通过DNA连接酶的互补链结合联动的荧光或发光而确定碱基序列的原理。具体而言，可举出MiSeq(Illumina公司)、HiSeq2000(Illumina公司，HiSeq为注册商标)、Roche454(Roche公司)等。
当利用下一代测序仪对在扩增工序中得到的DNA的扩增产物进行分析时，可以使用全基因组测序、外来体测序以及扩增子测序。
作为对准通过下一代测序仪得到的序列数据的手段，可举出Burrows-Wheeler对准器(Aligner)(BWA)，优选通过BWA将序列数据映射到已知的人类基因组序列。作为对基因进行分析的手段，可举出SAMtools和BEDtools，优选通过这些分析手段对基因多态性、基因突变以及染色体数目进行分析。
通过对经扩增的DNA进行基因分析，获取与基因分析结果有关的第3信息。例如，优选作为第3信息获取已分取的细胞是否为目标细胞，即优选获取目标细胞的有无作为第3信息。将来自细胞的第1信息与在分析工序中获取的第3信息例如建立关联而输入并存储于控制部120。
＜条件确定工序(步骤S5)＞
在条件确定工序中，根据在扩增工序中获取的第2信息和在分析工序中获取的第3信息中的至少一个信息，对分取工序中的提取条件进行再确定。
提取条件的再确定是通过改变在分取工序中确定的提取条件来进行确定的步骤，其包括改变在分取工序中确定的提取条件的情况和不改变在分取工序中确定的提取条件的情况。提取条件包括将用于制作散点图的纵轴或横轴的选择、适当地组合用于从群中分离其他群的门控、门输出等。
在分取工序中，例如获取包含通过免疫染色的荧光发光、前方散射光和侧方散射光中的至少一个的第1信息，根据已确定的提取条件分析第1信息，从分析结果分取认为是目标细胞的细胞。因此，仅根据普通的第1信息，很难进行分离出非目标细胞(例如，死细胞)的分取和难以分离成多个群的细胞等的分取。
本实施方式中，在分取工序之后与第1信息建立关联而在扩增工序和分析工序中获取第2信息和第3信息中的至少一个。经由扩增工序和分析工序，能够判断已分取的细胞是否为目标细胞。优选第2信息包含有无基因扩增的信息，因此能够判断已分取的细胞是活细胞还是死细胞。并且，第3信息包含基因信息，因此能够判断已分取的细胞是否为目标细胞。
由于第2信息和第3信息中的至少一个与第1信息建立关联，因此根据第2信息和第3信息，能够反馈到在分取工序中确定的提取条件。因此，能够以更高的概率对能够分取目标细胞的提取条件进行再确定。
图8是针对图5的散点图，根据扩增工序的第2信息对提取条件进行再确定之后的散点图。与在扩增工序中获取的第2信息建立关联的第1信息例如反馈到流式细胞仪10的控制部120。控制部120能够根据所反馈的第2信息，对提取条件进行再确定。
根据再确定的提取条件对第1信息进行分析的结果，重新选择出区域W6。推测反映出基于区域W5中的第2信息的结果的区域W6是出现许多未扩增的细胞(死细胞)的区域。通过对区域W6进行门输出，选择出新的区域W7。推测区域W7中出现许多作为有核红细胞的活细胞。
可以理解，通过根据第2信息对提取条件进行再确定，能够以高概率从其他群中分离出现许多作为有核红细胞的活细胞的区域W7。
图9是针对图8的散点图，根据分析工序的第3信息对提取条件进行再确定之后的散点图。与在分析工序中获取的第3信息建立关联的第1信息例如反馈到流式细胞仪10的控制部120。控制部120能够根据所反馈的第3信息，对提取条件进行再确定。
根据再确定的提取条件对第1信息进行分析的结果，重新选择出区域W8、区域W9。推测反映出基于区域W7中的第3信息的结果的区域W8是出现许多来自母体的有核红细胞的区域，区域W9是出现许多来自胎儿的有核红细胞的区域。可以理解，通过根据第3信息对提取条件进行再确定，能够以高概率从其他群中分离出现许多目标细胞(为来自胎儿的有核红细胞的情况)的区域W9。
在本实施方式中，对根据第2信息和第3信息对提取条件进行再确定的情况进行了说明，但也可以是根据第2信息和第3信息中的至少一个信息对提取条件进行再确定的情况。通过根据至少一个信息对提取条件进行再确定，能够以更高的概率分取目标细胞，因此能够实现可靠性高的基因分析方法。
(第2实施方式)
接着，参考附图对第2实施方式的基因分析方法进行说明。另外，在本实施方式中，例示出试样液体中含有血细胞并且目标细胞是来自胎儿的有核红细胞的情况进行说明。
图10是第2实施方式的基因分析方法的流程图。如图10所示，基因分析方法至少具备染色工序(步骤S21)、分取工序(步骤S22)、摄像工序(步骤S23)、扩增工序(步骤S24)、分析工序(步骤S25)以及条件确定工序(步骤S26)。
在染色工序(步骤S21)中，对细胞进行染色。在分取工序(步骤S22)中，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析第1信息，并根据分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器。在摄像工序(步骤S23)中，拍摄分取到容器中的细胞。在扩增工序(步骤S24)中，对分取到容器中的细胞的DNA进行扩增。在分析工序(步骤S25)中，对经扩增的DNA进行基因分析。在条件确定工序(步骤S26)中，根据在扩增工序中获取的第2信息、在分析工序中获取的第3信息和在摄像工序中获取的第4信息中的至少一个信息，对提取条件进行再确定。
以下，对各工序进行说明。另外，对于与第1实施方式相同的工序，有时会省略其说明。
能够对第2实施方式的基因分析方法的染色工序(步骤S21)和分取工序(步骤S22)实施与第1实施方式相同的染色工序(步骤S1)和分取工序(步骤S2)。接着对摄像工序(步骤S23)进行说明。
＜摄像工序(步骤S23)＞
在摄像工序中，拍摄分取到容器中的细胞。拍摄细胞是指以细胞为对象进行拍摄，并且包括拍摄目标细胞、目标外细胞以及非细胞异物(灰尘、细胞碎片)的情况。在摄像工序中，为了拍摄分取到容器20中的细胞，优选使用图像摄像装置30。作为图像摄像装置30，可举出具备摄像装置的荧光显微镜。
图11是图像摄像装置30的概略结构图。图像摄像装置30能够拍摄回收到容器20中的细胞C。图像摄像装置30构成为通过拍摄细胞C，能够得到来自细胞的第4信息。在此，来自细胞的第4信息中包含来自细胞的荧光强度、细胞的形状、颜色和大小中的至少一个。荧光强度是指由激发光激发且通过免疫染色的荧光色素的荧光发光。细胞的形状是指包含细胞的外部和内部的形态。细胞的颜色是指细胞本身的颜色。细胞的大小是指包含二维观察细胞而得的面积、三维观察细胞而得的体积等。
在本实施方式中，对针对分取到容器20中的细胞，在摄像工序中从与容器20的孔202的开口相反的一侧(即背面)拍摄细胞的情况进行说明。
图像摄像装置30具备：激发用第1光源302，用于测定细胞C的荧光；载置台304，用于载置容器20；透镜306，从载置台304分开而配置在与容器20相反的一侧；滤光片组，由激发滤光片308、分色镜310以及荧光滤光片312构成；第2光源314，配置在容器20的孔202的一侧，并且将用于测定透射光的光照射到容器20；以及摄像装置316，拍摄细胞C。
另外，摄像装置316，配置在与分取有细胞C的容器20中的孔202的开口(表面)相反的一侧。即，摄像装置316能够从容器20的背面拍摄细胞C。来自第1光源302的激发光从容器20的背面照射到孔202，并且来自第2光源314的光从容器20的表面照射到孔202。
为了从容器20的背面侧照射激发光或透射容器20而接收来自细胞的荧光和透射光，优选容器20的材料为透明、不会自发荧光并且不会散射。
图像摄像装置30优选能够获取拍摄到荧光发光的细胞C的图像和通过明场拍摄到细胞C的图像。
作为第1光源302，例如能够使用高压汞灯、高压氙气灯、发光二极管、激光二极管、钨丝灯、卤素灯、白色发光二极管等。在使用这些光源的情况下，通过激发滤光片308也能够仅透射目标波长。能够对免疫染色的细胞C的荧光色素照射目标激发波长的光。另外，作为第2光源314，能够使用与第1光源302相同的光源。
对通过摄像装置316，针对通过细胞C的免疫染色的荧光强度获取图像的情况进行说明。从第1光源302照射的光通过激发滤光片308仅透射目标波长区域的光。透射了激发滤光片308的光通过分色镜310反射到容器20的方向。通过分色镜310反射的光透射透镜306，并照射在回收到孔202中的细胞C。照射到细胞C的光设为会激发免疫染色的细胞C的荧光色素的波长区域。免疫染色的细胞C被激发光激发，并且发出与照射的激发波长不同波长的荧光。通过细胞C的免疫染色的荧光经由透镜306、分色镜310以及荧光滤光片312而被摄像装置316拍摄，从而获取图像。如果对激发光与由该激发光发出的荧光进行比较，则由于荧光的波长比激发光的波长长，因此通过分色镜310能够将激发光的波长的光反射到容器20侧，并且能够将荧光的波长的光透射到摄像装置316侧。并且，荧光滤光片312能够仅透射荧光而不透射激发光。因此，在摄像装置316中，能够拍摄通过免疫染色的荧光发光的细胞C。利用荧光滤光片312，并且通过仅透射荧光，被摄像装置316拍摄的图像不会影响激发光，因此能够获取准确的图像。
本实施方式的图像摄像装置30为了将容器20移动到任意的位置(例如，X方向、Y方向以及Z方向)而具备载置台304和驱动装置(未图示)。通过载置台304和驱动装置，能够将容器20的特定的孔202移动到观察位置。驱动装置优选能够使载置台304向X方向、Y方向以及Z方向移动。
当细胞C通过多个荧光色素被免疫染色时，通过更换不同的滤光片组(激发滤光片308、分色镜310以及荧光滤光片312)，能够拍摄发出不同荧光的细胞C，从而能够获取细胞C的图像。
作为摄像装置316，只要能够拍摄容器20的孔202内的细胞的荧光或透射光，则并没有特别限制，例如能够使用CCD(charge-coupled device(电荷耦合器件))相机。
在本实施方式中，对摄像装置316、第1光源302以及滤光片组配置在容器20的背面侧，并且第2光源314配置在容器的表面侧的图像摄像装置30进行了说明。但并不限定于此，也能够使用摄像装置316、第1光源302以及滤光片组配置在容器20的表面侧，并且第2光源314配置在容器的背面侧的图像摄像装置30。
将通过在摄像工序中拍摄细胞而获取的第4信息与来自细胞的第1信息建立关联从而例如输入并存储于流式细胞仪10的控制部120。由于在摄像工序中获取拍摄有细胞C的图像，因此能够从图像获取包含细胞的荧光强度、形状、颜色和大小中的至少一个的信息作为第4信息。由于在摄像工序中直接观察细胞而获取第4信息，因此能够判断已分取的细胞是否为目标细胞、目标外细胞、灰尘或细胞碎片。
本实施方式中，对使用了图6中示出的容器20的情况进行说明，但并不限定于此，能够使用图7中示出的容器20拍摄细胞。
能够对第2实施方式的基因分析方法的扩增工序(步骤S24)和分析工序(步骤S25)实施与第1实施方式相同的扩增工序(步骤S3)和分析工序(步骤S4)。接着对条件确定工序(步骤S26)进行说明。
＜条件确定工序(步骤S26)＞
在条件确定工序中，根据在扩增工序中获取的第2信息、在分析工序中获取的第3信息和在摄像工序中获取的第4信息中的至少一个信息，对分取工序中的提取条件进行再确定。
本实施方式中，在分取工序之后与第1信息建立关联而在扩增工序、分析工序以及摄像工序中获取第2信息、第3信息和第4信息中的至少一个。经由扩增工序、分析工序以及摄像工序，能够判断已分取的细胞是否为目标细胞。优选第2信息包含有无基因的扩增，因此能够判断已分取的细胞是活细胞还是死细胞。并且，第3信息包含基因信息，因此能够判断已分取的细胞是否为目标细胞。并且，第4信息包含细胞的荧光强度等，因此能够从所拍摄的图像判断是否为目标细胞。
由于第2信息、第3信息和第4信息中的至少一个与第1信息建立关联，因此根据第2信息、第3信息和第4信息，能够反馈到分取工序中的提取条件。因此，能够以更高的概率对能够分取目标细胞的提取条件进行再确定。
图12是针对图5的散点图，根据摄像工序的第4信息对提取条件进行再确定之后的散点图。与在摄像工序中获取的第4信息建立关联的第1信息例如反馈到流式细胞仪10的控制部120。控制部120能够根据所反馈的第4信息，对提取条件进行再确定。
根据再确定的提取条件对第1信息进行分析的结果，重新选择出区域W10。推测反映出基于区域W5中的第4信息的结果的区域W10是出现许多灰尘或细胞碎片的区域。通过对区域W10进行门输出，选择出新的区域W11。推测区域W11中出现许多除灰尘或细胞碎片以外的有核红细胞。
可以理解，通过根据第4信息对提取条件进行再确定，能够以高概率从其他群中分离出现许多除灰尘或细胞碎片等以外的目标细胞的区域W11。
图13是针对图12的散点图，根据扩增工序的第2信息对提取条件进行再确定之后的散点图。与在扩增工序中获取的第2信息建立关联的第1信息例如反馈到流式细胞仪10的控制部120。控制部120能够根据所反馈的第2信息，对提取条件进行再确定。
根据再确定的提取条件对第1信息进行分析的结果，重新选择出区域W6。推测反映出基于区域W11中的第2信息的结果的区域W6是出现许多未扩增的细胞(死细胞)的区域。通过对区域W6进行门输出，能够在区域W11中选择新的区域W7。推测区域W7中出现许多作为有核红细胞的活细胞。
可以理解，通过根据第2信息对提取条件进行再确定，能够以高概率从其他群中分离出现许多作为有核红细胞的活细胞的区域W7。
而且，与在分析工序中获取的第3信息建立关联的第1信息例如反馈到流式细胞仪10的控制部120。控制部120能够根据所反馈的第3信息，对提取条件进行再确定。
其结果，如图9的散点图所示，根据再确定的提取条件对第1信息进行分析的结果，重新选择出区域W8、区域W9。
推测反映出基于区域W7中的第3信息的结果的区域W8是出现许多来自母体的有核红细胞的区域，并且区域W9是出现许多来自胎儿的有核红细胞的区域。可以理解，通过根据第3信息对提取条件进行再确定，能够以高概率从其他群中分离出现许多目标细胞(为来自胎儿的有核红细胞的情况)的区域W9。
在本实施方式中，对根据第2信息、第3信息和第4信息对提取条件进行再确定的情况进行了说明，但也可以是根据第2信息、第3信息和第4信息中的至少一个信息对提取条件进行再确定的情况。通过根据至少一个信息对提取条件进行再确定，能够以更高的概率分取目标细胞，因此能够实现可靠性高的基因分析方法。
另外，在本实施方式中，优选在染色工序之前具备提高目标细胞在溶剂中的浓度的浓缩工序。关于浓缩工序，将对母体血液中的有核红细胞进行浓缩的情况作为一例进行说明。
＜浓缩工序＞
优选在染色工序之前进行母体血液中的有核红细胞的浓缩，从而提高有核红细胞的密度。作为浓缩工序，能够使用公知的方法，例如，密度梯度离心分离法、MACS(Magneticactivated cell sorting(磁激发细胞分选))法、FACS(Fluorescence activated cellsorting(荧光激活细胞分选))法、凝集素法或过滤器过滤法等。其中，作为利用血细胞的特性的简单的浓缩方法，优选通过密度梯度离心分离法进行浓缩。作为浓缩工序的一例，在以下对密度梯度离心分离法进行说明。
〔密度梯度离心分离法〕
密度梯度离心分离法是利用血液中的成分的密度之差进行分离的方法。密度梯度离心分离法利用不使用分离用介质的方法、使用一种分离用介质并以该分离用介质的上侧和下侧进行分离的方法、或者使用两种分离用介质并且以使目标成分的密度区域夹在分离用介质之间的方式进行分离的方法等，能够聚集目标成分(在本实施方式中为有核红细胞)。而且，通过采集含有目标成分的组分，能够从母体血液中浓缩有核红细胞。
作为不使用分离用介质的方法，将作为血液试样的母体的外周血(可以通过稀释液进行稀释)填充于离心管，在进行离心分离之后，通过采集目标成分，能够浓缩有核红细胞。
作为使用一种分离用介质的方法，将分离用介质注入到离心管的底部，并且在分离用介质上层叠作为血液试样的母体的外周血(可以通过稀释液进行稀释)之后进行离心分离，通过采集离心分离后的分离用介质的上部(可以含有分离用介质的一部分)，能够浓缩有核红细胞。
在使用两种分离用介质的方法中，将第1分离用介质注入到离心管的底部，在第1分离用介质上层叠第2分离用介质，并且在第2分离用介质上层叠作为血液试样的母体的外周血(可以通过稀释液进行稀释)之后施加离心分离，通过采集离心分离后的第1分离用介质与第2分离用介质之间的层(可以分别含有第1分离用介质和第2分离用介质的一部分，或者含有任一个分离用介质的一部分)，能够浓缩有核红细胞。另外，如果在层叠第2分离用介质之前对层叠有第1分离用介质的离心管进行冷却，则能够抑制在第1分离用介质与第2分离用介质的边界区域中的混合。
国际公开WO2012/023298号公报中记载有含有胎儿的有核红细胞的母体血液的密度。基于该记载，假定的来自胎儿的有核红细胞的密度为1.065～1.095g/mL左右，母体的血细胞的密度中，红细胞为1.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒细胞为1.090～1.110g/mL左右，嗜中性粒细胞为1.075～1.100g/mL左右，嗜碱性粒细胞为1.070～1.080g/mL左右，淋巴细胞为1.060～1.080g/mL左右，单核细胞为1.060～1.070g/mL左右。
为了将密度为1.065～1.095g/mL左右的来自胎儿的有核红细胞与母体中的其他血细胞成分进行分离，因而设定层叠的分离用介质的密度。例如，在使用两种分离用介质的方法中，来自胎儿的有核红细胞的中心的密度为1.080g/mL左右，因此通过制作隔着该细胞的两个不同密度的分离用介质并将它们相邻重叠，能够在其界面聚集所希望的来自胎儿的有核红细胞。优选将第1分离用介质的密度设定为1.08g/mL以上且1.10g/mL以下，将第2分离用介质的密度设定为1.06g/mL以上且1.08g/mL以下。进一步优选将第1分离用介质的密度设定为1.08g/mL以上且1.09g/mL以下，将第2分离用介质的密度设定为1.065g/mL以上且1.08g/mL以下。作为具体例，通过将第1分离用介质的密度设定为1.085g/mL，将第2分离用介质的密度设定为1.075g/mL，能够从回收的所希望的组分中分离血浆成分、嗜酸性粒细胞以及单核细胞。并且，也能够分离红细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞中的一部分。在本实施方式中，只要能够实现本发明的效果，第1分离用介质与第2分离用介质可以是相同种类，也可以是不同种类，并没有限制，但优选方式为使用相同种类的介质。
作为在浓缩工序中使用的用于进行密度梯度离心分离的分离用介质，能够使用作为含有聚蔗糖和泛影酸钠的溶液的Histopaque(注册商标)、作为含有涂布有非透析性聚乙烯吡咯烷酮且直径为15～30nm的硅溶胶的溶液的Percoll(注册商标)、作为由蔗糖制成且侧链丰富的中性亲水性聚合物溶液的Ficoll(注册商标)-Paque等分离用介质。在本实施方式中，优选使用Histopaque和Percoll。
密度梯度离心分离的分离用介质能够通过混合稀释液或密度(比重)不同的分离用介质来制备为所希望的密度。例如，Histopaque(注册商标)能够使用市售的密度为1.077的介质和密度为1.119的介质，并将第1分离用介质和第2分离用介质调整为所希望的密度。并且，这些密度梯度离心分离用介质能够通过添加氯化钠(NaCl)等来调节渗透压。
符号说明
10-流式细胞仪，20-容器，30-图像摄像装置，102-喷嘴，104-流动池，106-光源，108、110-检测器，112、114-偏转电极板，120-控制部，202-孔，204-侧壁，206-识别标志，208-管，210-支撑部件，212-孔，302-第1光源，304-载置台，306-透镜，308-激发滤光片，310-分色镜，312-荧光滤光片，314-第2光源，316-摄像装置，C-细胞，L-鞘液，S-试样液体，W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、W10、W11-区域。

Claims (10)

1.一种基因分析方法，其包括如下工序：
染色工序，对细胞进行染色；
分取工序，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析所述第1信息，并从该分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器中；
扩增工序，扩增分取到所述容器中的细胞的DNA；
分析工序，对经扩增的所述DNA进行基因分析；以及
条件确定工序，根据在所述扩增工序中获取的第2信息和在所述分析工序中获取的第3信息中的至少一个信息，对所述提取条件进行再确定。
2.根据权利要求1所述的基因分析方法，其中，
所述细胞的染色是通过抗原抗体反应进行的免疫染色。
3.根据权利要求2所述的基因分析方法，其中，
所述第1信息是由所述免疫染色引起的荧光发光、前方散射光和侧方散射光中的至少一个信息。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因分析方法，其中，
在所述分取工序与所述扩增工序之间具备拍摄分取到所述容器中的细胞的摄像工序，并根据在所述摄像工序中获取的第4信息，对所述提取条件进行再确定。
5.根据权利要求4所述的基因分析方法，其中，
所述第4信息包含所述细胞的荧光强度、形状、颜色和大小中的至少一个。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因分析方法，其中，
所述第2信息包含有无所述DNA扩增，所述第3信息包含有无目标细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的基因分析方法，其中，
所述扩增工序包括聚合酶链反应。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的基因分析方法，其中，
所述基因分析选自由DNA微阵列法、数字PCR法、实时PCR法、测序法及其组合组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的基因分析方法，其中，
在所述染色工序之前具备提高所述细胞在溶剂中的浓度的浓缩工序。
10.一种基因分析方法，其包括如下工序：
染色工序，对细胞进行染色；
分取工序，通过流式细胞术获取来自试样液体的细胞的第1信息，根据已确定的提取条件分析所述第1信息，并从该分析结果将目标细胞分取到排列有多个孔的容器中；
摄像工序，拍摄分取到所述容器中的细胞；
扩增工序，扩增分取到所述容器中的细胞的DNA；
分析工序，对经扩增的所述DNA进行基因分析；以及
条件确定工序，根据在所述扩增工序中获取的第2信息、在所述分析工序中获取的第3信息和在所述摄像工序中获取的第4信息中的至少一个信息，对所述提取条件进行再确定。
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KRISTA EVANS等: "Assurance of monoclonality in one round of cloning through cell sorting for single cell deposition coupled with high resolution cell imaging", 《BIOTECHNOL PROG》 *

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