TWI599655B - 用於促進源自脂肪組織之幹細胞神經生成的塗層及培養基 - Google Patents

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Description

用於促進源自脂肪組織之幹細胞神經生成的塗層及培養基
本揭露內容關於用於幹細胞培養皿之塗層、用於製備經塗層之幹細胞培養皿及培養基的方法。該塗層、培養皿及培養基可用於促進源自脂肪組織之幹細胞(包括源自人類脂肪組織之幹細胞)神經生成。
由於大腦營養素具有促進大腦早期發育之能力，其已成為嬰兒、兒童及懷孕和哺乳期婦女之飲食中越來越重要之添加劑。此外，目前仍持續追尋可用於治療神經退化性疾病或腦損傷之化合物。神經毒性化合物(諸如環境、工業或膳食毒素)需要被鑑定出來，以除去或減少暴露於這類化合物。用於發現這類營養素和毒素之方法往往極為耗時且無效率。因此，有需要提供可靠、一致且快速之用於鑑定對神經系統發育有益之化合物的方法。此外，有需要鑑定對神經系統有害之化合物。
現已證明幹細胞(諸如源自脂肪組織之幹細胞(ADSC))可以可重複之方式分化成多種成熟之細胞表型，包括神經元細胞。尤其是，這已在源自人類脂肪組織之幹細胞(hADSC)中得到證明。hADSC為有用的研究工具，因為其可從商業來源或抽脂程序輕易取得，且其不涉及如同使用胚胎幹細胞所產生之可能爭議。此外，hADSC可很容易地從個別患者取得，從而提供機會予個人化醫學。因此，有需要提供用於促進ADSC中神經生成之程序，更具體地說，提供用於促進ADSC中神經生成之合適的培養皿和培養基。
本揭露內容之一種態樣係關於包含聚-L-鳥胺酸及牛纖維黏連蛋白之用於幹細胞培養皿的塗層。該幹細胞可為源自脂肪組織之幹細胞，諸如源自人體脂肪組織之幹細胞。於一些實施例中，該塗層有利地促進細胞附著、細胞生長和/或神經生成。
本揭露內容之另一態樣關於用於幹細胞之培養皿，該培養皿其上塗覆能夠促進神經生成的塗層，諸如包含聚-L-鳥胺酸及牛纖維黏連蛋白之塗層。
本揭露內容之另一態樣關於用於製備經塗層之幹細胞培養皿的方法，其包含：將培養皿與聚-L-鳥胺酸之溶液接觸，及將培養皿與牛纖維黏連蛋白之溶液接觸。該接觸步驟可以任何順序進行，或同時、或基本上同時 進行。
於一些實施例中，該聚-L-鳥胺酸溶液中之聚-L-鳥胺酸的濃度為約0.1至約1000微克/毫升。該將培養皿與聚-L-鳥胺酸之溶液接觸的步驟可能進行足以將該聚-L-鳥胺酸配置在該培養皿之至少一個表面上之時間(例如約10分鐘至約12小時)。該將培養皿與聚-L-鳥胺酸之溶液接觸的步驟可能在周圍溫度或升高之溫度(例如約20至約45℃)下進行。
於一些實施例中，牛纖維黏連蛋白中之牛纖維黏連蛋白的濃度為約0.1至約1000微克/毫升。該將培養皿與牛纖維黏連蛋白之溶液接觸的步驟可能進行足以將該牛纖維黏連蛋白配置在該培養皿之至少一個表面上的時間(例如約10分鐘至約12小時)。該將培養皿與牛纖維黏連蛋白之溶液接觸的步驟可能在例如約15至約40℃之溫度下進行。
本揭露內容之另一態樣關於根據此處所揭露之任何方法製備之經牛纖維黏連蛋白和聚-L-鳥胺酸塗覆的幹細胞培養皿。
本揭露內容之另一態樣關於用於幹細胞培養的培養基，其包含：神經細胞基礎培養基(neural basal medium)、表皮生長因子(EGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(b-FGF)及N2補充劑。例如，該培養基可包含神經細胞基礎培養基與約1至約100奈克/毫升之EGF、約1至約100奈克/毫升之b-EGF及約1X之N2補充劑。於一 些實施例中，該培養基進一步包含L-麩醯胺酸，例如約0.1至約10mM之L-麩醯胺酸。上述培養基可能有利地促進或支持神經生成。
此外，此處提供用於培養幹細胞之系統，其包含：幹細胞；幹細胞培養皿，該培養皿上已塗覆包含聚-L-鳥胺酸及牛纖維黏連蛋白之塗層；及培養基。
於一些實施例中，該系統進一步包含啟動培養基(priming medium)。
第1圖為描繪根據本揭露內容之實施例的快速神經元分化平台(RNDP)之示意圖。將hADSC培養在合適之培養基及適量之候選化合物(處理)中24-72小時。然後，評估hADSC以決定神經生成的程度。
第2圖為描繪根據本揭露內容之實施例的延伸之神經元分化平台(ENDP)之示意圖。將hADSC培養在合適之啟動培養基中長達三天。然後，以合適之培養基(分化培養基)及適量之候選化合物取代該啟動培養基，並培養1至5天。然後，評估hADSC以決定神經生成的程度。
第3A圖描繪對照實驗中之ADSC的相位差影 像。第3B圖描繪在大腦營養素處理後之ADSC的相位差影像。
第4A圖為來細胞表現研究之對照影像，該研究中係以抗微管相關蛋白2(MAP2)(此為一種神經元標記)抗體為細胞染色。第4B圖為MAP2表現研究中以大腦營養素處理後之影像。紅色螢光(以白色條紋指示)顯示MAP2之表現。
第5A圖為來自細胞表現研究之對照影像，該研究中係以抗巢蛋白(nestin)(此為一種神經元標記)抗體為細胞染色。第5B圖為巢蛋白表現研究中以大腦營養素處理後之影像。紅色螢光(以白色條紋指示)顯示巢蛋白之表現。
第6A圖為來自細胞表現研究之對照影像，該研究中係以抗神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)(此為一種神經元標記)抗體為細胞染色。第6B圖為GFAP表現研究中以大腦營養素處理後之影像。紅色螢光(以白色條紋指示)顯示GFAP之表現。
第7A圖為來自細胞表現研究之對照影像，該研究中係以抗β Ⅲ微管蛋白(此為一種神經元標記)抗體為細胞染色。第7B圖為β Ⅲ微管蛋白表現研究中以大腦營養素處理後之影像。紅色螢光(以白色條紋指示)顯示β Ⅲ微管蛋白之表現。
詳細說明
本揭露內容之一種態樣關於用於幹細胞(諸如ADSC)之培養皿，該培養皿之至少一個表面上已配置一層包含聚-L-鳥胺酸及牛纖維黏連蛋白之塗層。雖然不受任何特定理論之約束，咸信，此處所描述之培養皿塗層模仿體內中樞神經系統環境，最大限度地提高細胞神經元分化活性並增進ADSC中之細胞附著。因此，於一些實施例中，該塗層促進神經生成。
“神經生成”係指來自幹細胞或源祖細胞之神經細胞在體外或體內分化、生長或增殖。神經生成之程度可藉由多種本技術領域中已知之技術測定，諸如觀察細胞之形態變化。任何用於細胞分析或可視化的方法均適合用於本發明之方法中。例如，ADSC中之形態學變化可使用顯微鏡技術(諸如相位差顯微鏡術)來觀察。指示神經生成之形態學變化包括，但不限於細胞質收縮和出現神經突、軸突和樹突。於其他實施例中，神經生成之程度係經由觀察指示神經生成之細胞生物標記測定，諸如使用生物標記表現實驗。這類生物標記之實例包括，但不限於蛋白質，諸如神經絲蛋白(neurofilaments)、髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein)、微管相關蛋白2(MAP2)、巢蛋白、β Ⅲ微管蛋白、神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、S100(一種鈣結合蛋白)、環核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)及GABA受體。生物標記表現實驗包括，但不限於細胞染色研究。
本揭露內容之另一態樣關於製備經塗層之幹細胞培養皿的方法，其包含：將培養皿與聚-L-鳥胺酸之溶液接觸及將培養皿與牛纖維黏連蛋白之溶液接觸。該接觸步驟可以任何順序、同時或基本上同時執行。例如，於某些實施例中係將該培養皿先與聚-L-鳥胺酸接觸，再與牛纖維黏連蛋白接觸。於其他實施例中係將該培養皿先與牛纖維黏連蛋白接觸，再與聚-L-鳥胺酸接觸，再於其他實施例中係將該培養皿同時或基本上同時與聚-L-鳥胺酸和牛纖維黏連蛋白接觸。該接觸步驟可能在該培養皿之一個表面或該培養皿之多個表面上執行。
該聚-L-鳥胺酸和牛纖維黏連蛋白之濃度足以將該蛋白配置在該培養皿之至少一個表面上。例如，該聚-L-鳥胺酸溶液可能為其聚-L-鳥胺酸濃度在約0.1至約1000微克/毫升、約0.1至約500微克/毫升、約1至約500微克/毫升、約1至約100微克/毫升、約1至約50微克/毫升或約15至約20微克/毫升之範圍內的水溶液。
該牛纖維黏連蛋白之溶液可能為其牛纖維黏連蛋白濃度在約0.1至約1000微克/毫升、約0.1至約500微克/毫升、約0.1至約100微克/毫升、約0.1至約50微克/毫升、約0.1至約20微克/毫升或約1至約5微克/毫升之範圍內的水溶液。該牛纖維黏連蛋白可為緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝液。例如，該牛纖維黏連蛋白溶液可經由將市售之牛纖維黏連蛋白或牛纖維黏連蛋白之水溶液(諸如在細胞培養級水中)與合適之緩衝液(諸如Dubellco氏磷 酸鹽緩衝之鹽水(DPBS))組合來製備。
將聚-L-鳥胺酸之溶液與培養皿或該培養皿之至少一個表面接觸的步驟可經由本技術領域中任何已知之方法執行。於一些實施例中，該將聚-L-鳥胺酸之溶液與培養皿接觸的步驟係經由下述方法進行：以該溶液漂洗培養皿或將該溶液倒在培養皿上、將培養皿浸泡或浸沒在溶液中、將溶液與培養皿或在培養皿周圍混合或攪動、以該溶液噴灑培養皿、將培養皿在溶液中進行超音波處理或以上方法之任何組合。
將聚-L-鳥胺酸之溶液與培養皿接觸的步驟係 進行一段足以將該聚-L-鳥胺酸配置在該培養皿之至少一個表面上的時間，諸如約10分鐘至約12小時、約30分鐘至約6小時或約1小時。
於一些實施例中，該聚-L-鳥胺酸接觸步驟係在周圍或升高之溫度下進行。例如，將聚-L-鳥胺酸之溶液與培養皿接觸的步驟可在約20至約45℃、約25至約40℃、約30至約40℃或約37℃之溫度下執行。
將牛纖維黏連蛋白之溶液與培養皿接觸之步驟可經由本技術領域中任何已知之方法執行。於一些實施例中，該將牛纖維黏連蛋白之溶液與培養皿接觸的步驟係經由下述方法進行：以該溶液漂洗培養皿或將該溶液倒在培養皿上、將培養皿浸泡或浸沒在溶液中、將溶液與培養皿或在培養皿周圍混合或攪動、以該溶液噴灑培養皿、將培養皿在溶液中進行超音波處理或上述方法之任何組合。
將牛纖維黏連蛋白之溶液與培養皿接觸的步驟係進行一段足以將該牛纖維黏連蛋白配置在該培養皿之至少一個表面上的時間，諸如約10分鐘至約12小時、約30分鐘至約6小時或約1小時。
該牛纖維黏連蛋白與培養皿接觸的步驟可在周圍或升高之溫度下進行。於一些實施例中，該溫度為約15至約45℃、約15至約35℃、約15至約30℃、約23℃或約室溫下執行。
於某些實施例中，該用於製備經塗層之幹細胞培養皿的方法進一步包含清洗步驟。該清洗步驟可以水或水溶液進行，諸如水性緩衝液，例如DPBS溶液。在與聚L-鳥胺酸或纖維黏連蛋白溶液接觸之前可先將培養皿清洗一或多次。亦可在接觸步驟之間將該培養皿清洗一或多次，於接觸步驟之後將該培養皿清洗一或多次。於一些實施例中，在接觸步驟及任意之清洗步驟之後將該培養皿乾燥。
本揭露內容之另一態樣關於藉由上述任何方法製備之經塗層的幹細胞培養皿。於一實施例中，該塗層之幹細胞培養皿促進ADSC(諸如hADSC)中神經生成。欲被塗層之培養皿可為任何適合用於培養幹細胞之容器，包括，但不限於多孔盤、皿、玻片、管子等等，且可能塗層在一或多個表面上。
本揭露內容之另一態樣關於可用於培養幹細胞(諸如ADSC，更具體地說，hADSC)之培養基。於一些 實施例中，該培養基能促進神經生成。例如，該培養基可能能夠引導ADSC分化成神經元細胞類型。於一些實施例中，該培養基包含神經細胞基礎培養基、表皮生長因子(EGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(b-FGF)、N2補充劑及L-麩醯胺酸，這些可從商業來源獲得，諸如Invitrogen公司。例如，該神經細胞基礎培養基可為從Invitrogen公司取得之NeurobasalTM培養基，其可包含表1中所列之成分：
N2補充劑可購自Invitrogen公司。Invitrogen N2補充劑可能包含下列成分：
於某些實施例中，該培養基包含神經細胞基礎培養基與適當濃度之EGF、b-FGF、N2補充劑及L-麩醯胺酸。例如，該培養基可能包含約1至約100、約5至約50、約10至約25或約20奈克/毫升之EGF。該培養基進一步包合約1至約100奈克/毫升、約5至約50、約10至約25或約20奈克/毫升之b-FGF。該N2補充劑在培養基中可能之存在濃度為約1X，且L-麩醯胺酸可能之存在量為約0.1至約10mM、約1至約5mM或約2mM。
此處所揭露之培養皿塗層及幹細胞培養基在使用ADSC鑑定神經生成調節化合物之方法中很有用。“神經生成調節化合物”係指影響神經生成之化合物，無論是促進或抑制神經生成。因此，於一些實施例中，神經生成調節化合物促進神經生成(“神經生成促進化合物”)，而於其他實施例中，該神經生成調節化合物抑制或減少神經生成(“神經生成抑制化合物”)。被鑑定為促進神經生成之化合物可能有利地作為嬰兒、兒童及孕婦和哺乳期母親之飲食補充劑，以促進和支持早期大腦發育。這些化合物於治療神經退化性疾病或神經損傷亦可能有用。被鑑定為抑制神經生成之化合物可能為嬰兒、兒童及孕婦和 哺乳期母親之飲食和環境中欲避免或欲除去的潛在毒素。這些化合物亦可能干擾神經系統疾病或損傷之治療或痊癒。因此，神經生成抑制化合物亦可能避免存在於患有神經系統疾病或損傷之個人的飲食和環境中。
“候選化合物”係指欲使用此處所描述之方法測試調節神經生成性能之任何化合物。該候選化合物包括，但不限於天然物質、合成之化合物或萃取物，諸如植物或動物組織、真菌或細菌之萃取物。該候選化合物可能單獨進行測試，或者可能與其他候選化合物或已知之神經生成調節化合物一起測試以觀察化合物之協同效果，或達到較高處理量篩選。因此，於一些實施例中，該培養基進一步包含約O.1nM至約10mM，或1nM至約1mM之候選化合物量。
於某些實施例中，該培養基實質上不含血清或較佳為，完全不含血清。實質上不含血清之培養基係指具有少於約10%血清，更具體地說，少於約2%或少於約1%之血清的培養基；於一些實施例中，實質上不含血清係指少於約0.5%之血清。完全不含血清之培養基不具有血清。雖然不受限於任何特定理論，咸信，血清可能含有不固定量之生長因子，這可能會影響神經生成的程度。因此，不含血清之培養基排除血清對神經生成程度之影響。因此，於培養在低血清或無血清培養基中之ADSC所觀察到之神經生成可以歸因於候選化合物，而非存有血清。
上述之培養基在快速神經元分化平台(“ RNDP”)中很有用。RNDP可能有利地用於快速篩選大量可能的神經生成調節化合物。化合物可能單獨篩選或與其他化合物組合篩選以取得大量結果。若需要時，在RNDP中鑑定的化合物可能進一步使用延伸的平台調查。於一些實施例中，用於RNDP之培養基包含神經細胞基礎培養基、EGF、β-FGF、N2補充劑及L-麩醯胺酸。
延伸之神經元分化實驗程序(ENDP)進一步包含啟動步驟。雖然不受限於任何特定理論，咸信啟動ADSC可以改善神經元形態。因此，於一些實施例中，該ADSC先被啟動再於候選化合物的存在下進行培養。例如，可將ADSC在合適之啟動培養基中啟動約1至約5天再將其與候選化合物一起培養。於其他實施例中係將ADSC啟動約1至約3天，或約3天。雖然未受限於任何特定理論，咸信在培養之前啟動該ADSC可提供ADSC額外的時間發育成神經元細胞譜系。
於一些實施例中，該啟動培養基包含神經細胞基礎培養基(諸如來自Invitrogen公司之Neurobasal MediumTM)及合適濃度之EGF、b-FGF和N2補充劑。EGF之合適濃度包括約1至約100奈克/毫升、約5至約50、約10至約25或約20奈克/毫升。b-FGF之合適濃度包括約1至約100、約5至約50、約10至約25或約20奈克/毫升。該N2補充劑於培養基中之存在濃度可能為約1X。該啟動培養基可能實質上不含血清或完全不含血清。啟動培養基實質上不含血清係指培養基具有少於約10%之 血清，例如少於約2%或0.1%之血清，而完全無血清之培養基不具有血清。此外，該啟動培養基可能實質上不含或基本上不含候選化合物。
於其中該ADSC先被啟動，再於候選化合物之存在下培養的實施例中，該ADSC隨後被培養在合適之培養基中約1至約5天。於其他實施例中，該ADSC被培養約1至約3天，或約3天。啟動後，移除該啟動培養基中，再將培養基加入ADSC中。該培養基包含，例如MesenPRO Complete，其可從Invitrogen公司取得。培養基中可能進一步包含合適量之候選化合物，例如約0.1nM至約10mM的，或1nM至約1mM之候選化合物。
於一些實施例中，上述之篩選方法進一步包含提供ADSC之陰性對照培養以與候選化合物相比較。因此，該方法可能進一步包含在沒有候選化合物的存在下培養ADSC，測定無候選化合物存在時所培養之ADSC中的神經生成程度，再將該在候選化合物之存在下所培養之ADSC中的神經生成程度與無候選化合物存在時所培養之ADSC中的神經生成程度相比較。與無候選化合物存在時所培養之ADSC中的神經生成程度相比較，在候選化合物之存在下所培養之ADSC中的神經生成程度增加時表示該候選化合物為神經生成促進化合物。另一方面，該在候選化合物之存在下所培養之ADSC的神經生成程度比無候選化合物存在時所培養之ADSC中的神經生成程度降低表示該候選化合物為神經生成抑制化合物。
於其他實施例中，該方法進一步包含提供陽性對照培養。因此，該方法可能進一步包含在已知之神經生成促進化合物的存在下培養ADSC，並測定在該神經生成促進化合物之存在下培養的ADSC中的神經生成程度。例如，已知DHA促進大腦之早期發育並可能作為陽性對照組。因此，該方法可能進一步包含在DHA的存在下培養ADSC。與DHA存在時所培養之ADSC中的神經生成程度相比較，在候選化合物之存在下所培養之ADSC中的神經生成程度增加表示該候選化合物為較DHA優越之神經生成促進化合物。
在神經生成期間，ADSC可能分化成神經元細胞、神經元細胞之先驅及具有神經元性能之細胞。因此，神經生成之程度可經由觀察細胞之形態變化測定。可為神經生成之指示的細胞形態變化包括，但不限於細胞質收縮、形成神經突、形成樹枝狀突起、形成軸突或彼等之組合。其他指示神經生成之細胞形態變化包括發展出類似於雙極、三極和多極神經元細胞的形態。
細胞形態學中之變化可藉由顯微鏡技術(諸如藉由相位差顯微鏡術)觀察。在培養ADSC之期間可能採取數次該ADSC之相位差顯微鏡影像。例如，在與候選化合物培養前可以採取影像，添加候選化合物後(諸如三小時後)可以採取一或多次，然後，每天採取一次。
在細胞生物標記之變化係在神經生成期間發生。因此，於一些實施例中係使用用於神經元標記之細胞 表現研究來測定神經生成之程度。這類生物標記之實例包括，但不限於蛋白質，諸如神經絲蛋白、髓鞘鹼性蛋白、巢蛋白、β Ⅲ微管蛋白、神經膠質原纖維酸性蛋白、S100(一種鈣結合蛋白)、CNPase及GABA受體。
於一些實施例中，該幹細胞為ADSC，hADSC。hADSC可以被保持在培養中且容易地被傳代以提供多個繼代培養。此外，hADSC可容易地取得，因為其可從在日常吸脂手術期間收集之人類脂肪組織分離出，並從初級培養冷凍保存。於一實施例中，hADSC可從個別患者取得。由此取得之hADSC可用於此處所描述之方法中以篩選用於個人化用途之候選化合物。因此，可取得個人化和最佳化之營養、藥物治療或對神經毒素之敏感性。
本揭露內容之另一態樣關於用於鑑別神經生成調節化合物之系統，其包含：包含模擬中樞神經系統之塗層的培養皿及培養基。於一些實施例中，該塗層包含牛纖維黏連蛋白及聚-L-鳥胺酸。於可用於RNDP之系統中，該培養基包含神經細胞基礎培養基、EGF、b-FGF、N2補充劑和L-麩醯胺酸。可用於RNDP之系統進一步包含啟動培養基，諸如包含神經細胞基礎培養基、EGF、b-FGF、N2補充劑之培養基，及包含MesenPRO Complete之培養基。於一些實施例中，該系統進一步包含幹細胞，諸如ADSC。
實施例 hADSC
下列程序中所使用之hADSC係購自商業資源且生長在包含Complete MesenPRO RS培養基與補充劑和L-麩醯胺酸之維持培養基中。當細胞培養達到匯合(confluence)時進行hADSC之繼代培養。使用以下程序將hADSC傳代：i)從細胞吸出Complete MesenPRO RS培養基；ii)將Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)緩衝劑加入容器中細胞層附著之對側並將容器來回搖動數次以DPBS漂洗細胞層表面區域；iii)經由抽吸移除DPBS並丟棄之；iv)添加足夠體積之預先溫熱的無酚紅胰蛋白酶-EDTA溶液以覆蓋該細胞層，使細胞脫附；v)在37℃下培育約7分鐘；vi)在顯微鏡下觀察細胞以決定是否需要額外培育；vii)在培養盤中添加3毫升之維持培養基，混合細胞懸浮液，將懸浮液加入15毫升之離心管中並在210克離心5分鐘；viii)使用血球細胞計數器決定細胞總數和存活百分比；ix)在每個容器中添加Complete MesenPRO RS培養基以使最終之培養體積為每平方公分0.2毫升-0.5毫升；x)將適當體積之細胞加入每個容器中以接種細胞並將其在37℃，5%CO2和90%濕度下培育；及xi)接種後三或四天，完全除去培養基並以等體積之Complete MesenPRO RS培養基取代之。
塗層
將hADSC在新鮮培養盤上接種及傳代前，以 無菌DPBS溶液清洗培養之表面三次，再以無菌水漂洗多次。該塗層之第一層為聚-L-鳥胺酸。該塗層係經由添加約15至約20微克/毫升之聚-L-鳥胺酸並在37℃培育1小時來製備。以DPBS將培養盤清洗三次，每次清洗15分鐘。該塗層之第二層為牛血漿纖維黏連蛋白。將該纖維黏連蛋白之貯存液在DPBS中稀釋至1：1000，在各孔中添加500微升。將培養盤放置在室溫下一小時。每一孔以500微升DPBS清洗最後一次後立即使用該培養盤。
培養基
hADSC可保持在未分化狀態或使用不同的培養基來引導hADSC分化。某些培養基能夠引導ADSC分化成神經元細胞。示範性培養基列於表3、4和5中。
RNDP實驗程序
此處描述兩個命名為快速神經元分化平台(RNDP)及延伸之神經元分化平台(ENDP)的獨立實驗程序。RNDP實驗程序提供在相當短的時間內快速篩選大量候選化合物。RNDP允許快速鑑定能促進或抑制神經生成，或對神經生成沒有影響的化合物。RNDP之後可進行ENDP以進一步調查並確認結果。
將如上述之hADSC繼代培養基從培養皿移除，然後以5-10毫升之無菌DPBS輕輕清洗該培養皿。去除DPBS，並加入1.5毫升胰蛋白酶-EDTA以完全覆蓋該細胞層。將此培養皿放回培育箱中7分鐘。然後，輕輕拍打該培養盤以使細胞完全脫附，在培養盤中添加3毫升之維持培養基，混合細胞懸浮液後將懸浮液加入15毫升之離心管中。採取所需之細胞密度(1x104個細胞/孔)至另一個15毫升管中並在210g下離心5分鐘。將細胞沉澱小丸再懸浮於預先溫熱之適當體積的如表1中所列之不含血清的快速神經元分化培養基中，並將其接種在組織培養盤的各孔中。依序加入各孔之候選化合物。將培養盤放回培育箱中。使用相位差顯微鏡影像可迅速且很容易地觀察到候選化合物之效果，該影像通常係在處理前不久，處理後 3小時，及其後3天之每一天各採取一次。由於周轉時間快速，最好的結果通常會在36小時內出現。收集影像後，分析和比較數據以決定各化合物或化合物之混合物於調節神經生成之有效性。神經元分化係經由觀察神經元的形態來測定。一些細胞中的變化包括細胞質收縮、形成軸突和樹枝狀細胞質突出。這些變化從hADSC之細胞質朝向細胞核縮回以形成細胞質擴大之收縮細胞體開始。細胞最終發展出類似於雙極、三極和多極神經元細胞之形態。
ENDP實驗程序
ENDP實驗程序提供用於進一步檢查RNDP之結果，並允許hADSC具額外之時間來啟動以進一步分化成各種神經元細胞譜系的方法。雖然不受限於任何特定理論，該啟動可驅動hADSC從中胚層譜系分化成神經外胚層。
將hADSC接種於具有塗層表面之培養盤上並生長在不含血清之ENDP啟動培養基(見表2)中至少72小時。移除啟動培養基並在存有或不存有至少一種候選化合物下將神經元分化培養基(見表3)加入其中。然後，將培養物培育一段延長的時間以使神經元進一步發育。培育3天後，在顯微鏡下檢查細胞形態之變化。神經突之百分比和長度可使用Image J之開放軟體，以合適之插件測量。該細胞可供進一步研究不同的神經元標記，以進一步確認神經元分化。
大腦營養素之發現
本調查之目的係使用RNDP和ENDP二種平台來測定各種營養素(候選化合物)對神經生成的影響。將候選化合物個別進行測試並與陽性對照組，二十二碳六烯酸(DHA)及陰性對照組相比較。預先溫熱之不含血清的培養基中包含神經基礎培養基與L-麩醯胺酸、20奈克/毫升之β FGF、20奈克/毫升之EGF及N2補充劑。將在不含血清之培養基中的各種濃度之候選化合物加入個別孔中。該候選化合物係選自下列群組：ARA、EPA(順式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)及白藜蘆醇(resveratrol)。將該化合物個別進行測試並與陽性對照組，二十二碳六烯酸(DHA)及陰性對照組相比較。以三重複方式進行該實驗。將經發現可促進神經生成或顯示出作為藥物之用途的營養素以各種組合進行篩選。這些實驗亦以三重複進行。
候選化合物之效果可很容易且快速地在相位差顯微鏡下觀察長達一週，影像通常係在以候選化合物處理前不久、處理後三小時及處理後三天之每一天各拍攝一次。由於周轉時間快速，最好的結果通常係在36小時內發生。收集影像後，分析並比較數據以決定各化合物或化合物之組合於促進神經生成之有效性。神經元分化係藉由神經元形態來測定。這些變化中之一些變化包括細胞質收縮及形成軸突和樹枝狀細胞質突出(神經突)。這些變化從hADSC之細胞質朝向細胞核縮回以形成細胞質擴大之收縮細胞體開始。細胞最終發展出類似於雙極、三極和多極 神經元細胞之形態(參見第3A和3B圖)。
亦使用各種神經元標記表現研究來觀察候選化合物之效果。具體地說，以抗MAP2、巢蛋白、GFAP及β-Ⅲ微管蛋白抗體染色之細胞顯示出以大腦營養素處理後可表現這些標記(如紅色螢光所指示者)，如第4A-7B圖中所描繪者。
在上述候選化合物中，白藜蘆醇、ARA、EPA、膽固醇及DHA為能有效促進神經生成之化合物實例。該測試濃度及有效濃度描述於表6中：
除非另有提及或明確暗示與前後文所述相反，本揭露內容之所有單數特性或限制之引用應當包括對應之複數特性或限制，反之亦然。
除非另有說明或明確暗示與前後文所述組合相反，如本文所使用之所有方法或過程步驟之組合可以任何順序執行。
本揭露內容之方法和組成物(包括彼等之元件)可包含本文所描述之實施例的必要元素和限制，以及本文所描述之任何額外或任意之成分、組分或限制，由本文所描述之實施例的必要元素和限制，以及本文所描述之任何 額外或任意之成分、組分或限制所組成，或基本上由本文所描述之實施例的必要元素和限制，以及本文所描述之任何額外或任意之成分、組分或限制所組成。
此處所使用之術語“約”應解釋為係指具體指定之兩個數目範圍內的任何數目。提及之範圍應被視為對在該範圍內之任何子集提供支持。

Claims (10)

  1. 一種用於培養源自人脂肪之幹細胞的神經元分化之培養基，其由下列組成：神經細胞基礎培養基(neural basal medium)，其由下列組成：甘胺酸、L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天冬醯胺酸、L-半胱胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-***酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、噻胺(thiamine)、維生素B12、i-肌醇、氯化鈣、硝酸鐵、氯化鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鋅、右旋糖、4-(Z-羥乙基)-1-哌乙磺酸、丙酮酸鈉、及彼等之混合物；表皮生長因子(EGF)，濃度約1至約100ng/mL，鹼性纖維母細胞生長因子(b-FGF)，濃度約1至100ng/mL，以及N2補充劑，濃度約1x，其中該培養基促進神經生成，且其中該神經元分化培養基係實質上不含血清及肝素。
  2. 如請求項1之培養基，其中該N2補充劑包含人轉鐵蛋白、全長鏈重組胰島素、孕酮(progesterone)、腐胺(putrescine)、及亞硒酸鹽。
  3. 如請求項1之培養基，其中該培養基藉由誘發經曝露至該培養基的一或多個細胞之一或多種形態變化而促進 神經生成，其中所觀察到的該一或多種形態變化包括至少一種選自下列所組成的群組：細胞質收縮(shrinkage)、促進神經突(neurite)形成、促進軸突形成、促進樹突形成、及彼等之組合。
  4. 如請求項3之培養基，其中經曝露至該培養基的一或多個細胞係源自脂肪細胞之幹細胞。
  5. 如請求項4之培養基，其中該源自脂肪細胞之幹細胞係源自人脂肪細胞之幹細胞。
  6. 一種用於培養源自人脂肪之幹細胞的神經元分化之培養基，其由下列組成：神經細胞基礎培養基，其由下列組成：甘胺酸、L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天冬醯胺酸、L-半胱胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-***酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、噻胺、維生素B12、i-肌醇、氯化鈣、硝酸鐵、氯化鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鋅、右旋糖、4-(Z-羥乙基)-1-哌乙磺酸、丙酮酸鈉、及彼等之混合物；以及表皮生長因子(EGF)，濃度約1至約100ng/mL，鹼性纖維母細胞生長因子(b-FGF)，濃度約1至100ng/mL，N2補充劑，濃度約1x，以及L-麩醯胺酸，濃度約0.1至約10mM， 其中該培養基促進神經生成，且其中該神經元分化培養基係實質上不含血清及肝素。
  7. 如請求項6之培養基，其中該N2補充劑包含人轉鐵蛋白、全長鏈重組胰島素、孕酮、腐胺、及亞硒酸鹽。
  8. 如請求項6之培養基，其中該培養基藉由誘發經曝露至該培養基的一或多個細胞之一或多種形態變化而促進神經生成，其中所觀察到的該一或多種形態變化包括至少一種選自下列所組成的群組：細胞質收縮、促進神經突形成、促進軸突形成、及促進樹突形成。
  9. 如請求項8之培養基，其中經曝露至該培養基的一或多個細胞係源自脂肪細胞之幹細胞。
  10. 如請求項9之培養基，其中該源自脂肪細胞之幹細胞係源自人脂肪細胞之幹細胞。
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