CN108864263A - 腐蚀稳定性色谱分析用配体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，如，基于免疫球蛋白结合蛋白的配体，如，葡萄球菌A蛋白，以及制备和使用所述配体的方法。

Description

腐蚀稳定性色谱分析用配体
本申请是申请日为2009年12月23日的第201510532937.8号发明名称为“腐蚀稳定性色谱分析用配体”的中国专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求申请号为No.61/203,664，申请日为2008年12月24日的美国临时专利申请的优先权，其全部内容在此全部并入本申请。
技术领域
本发明涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，例如，基于免疫球蛋白结合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配体，以及包含此类配体的色谱分析基质。
背景技术
在亲和色谱分析中使用的配体通常赋予对靶分子的高选择性，因此导致了对靶分子的高收率以及快速而经济的纯化。基于葡萄球菌A蛋白(SpA)的试剂以及色谱分析基质达到了在捕获和纯化抗体的亲和色谱分析中的广泛应用，并且由于其结合IgG而对免疫球蛋白和抗体的亲和性没有显著影响的能力，其同样广泛应用于抗体检测方法。
据此，已经开发了多种包含A蛋白－配体的试剂以及介质，并且在商业上可获得，包括，例如，－vA High Capacity，vA Ultra和UltraPlus(Millipore)及Protein A SepharoseTM，MabSelectTM，MabSelect XtraTM和MabSelect(GE Healthcare)和Poros MabCaptureATM(Applied Biosystems)。
为了维持色谱分析用配体(所述配体包括，如，包含基于SpA的色谱分析用配体的树脂)的选择性和结合能力，需要对配体结合树脂(称作色谱分析基质)进行清洁，并且通常在碱性条件下清洗，如，使用氢氧化钠。举例来说，用于清洗和复原基质的标准过程是一种原位清洗(Cleaning-in-place，CIP)的碱性方案，一般包括使用pH14的1M NaOH对基质进行处理。但是，这种不太温和的处理经常是不期望的，当配体是一种蛋白或是基于蛋白的分子时尤其如此。
发明内容
本发明提供了具有碱稳定性的基于SpA的色谱分析用配体，例如，其能够耐受重复的原位清洗(CIP)循环。更特别的是，基于本发明的配体可以在延长的时间中耐受传统的碱性清洗，这使得所述配体成为引人注目的候选物，特别是对于免疫球蛋白进行低成本高效率且高水平的纯化而言尤为如此。
在本发明的一个方面，碱稳定性色谱分析用配体包含两个或更多个SpA结构域。例如，在这方面的一些实施方式中，提供了碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述两个或更多个B结构域或者两个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。
在基于该方面的一些实施方式中，所述配体包含三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的B结构域或者三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述三个或更多个B结构域或者三个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在另一些实施方式中，所述配体包含四个或更多个SpA B结构域或者四个或更多个SpA Z结构域，所述四个或更多个B结构域或四个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在其它实施方式中，所述配体包含五个或更多个SpA B结构域或五个或更多个SpA Z结构域；或包含六个或更多个SpA B结构域或六个或更多个SpA Z结构域；或包含七个或更多个SpA B结构域或七个或更多个SpA Z结构域，所述五个或更多个B结构域或五个或更多个Z结构域，六个或更多个B结构域或六个或更多个Z结构域，七个或更多个B结构域或七个或更多个Z结构域，被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。
基于本发明的另一方面，碱稳定性色谱分析用配体包含一个或多个分离的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z结构域，所述一个或多个分离的结构域包含位于n+1位的一个或多个突变为除半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸残基。在一些实施方式中，n代表分离的SpA结构域的23位天冬酰胺残基。在分离的SpA结构域的24位具有突变的示例性配体如表1所示，其中n代表天冬酰胺。
表1
天然氨基酸的单字母代码及其对应的编码每个氨基酸的三字母密码子在表2中列出。一般地，由于密码子的简并性，多于一个三字母密码子可以编码同一个氨基酸。
表2
本发明还包括一种包含基于本发明的一个或多个方面的配体的色谱分析基质，该基质偶联在固体支持物上，如，至少一种不溶的载体。
另外，此处提供了使用这种配体的方法。因此，提供了从样品中分离一种或多种靶分子(如，免疫球蛋白)的亲和纯化方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供包含一种或多种靶分子(如，免疫球蛋白)的样品；(b)在一种或多种靶分子(如，免疫球蛋白)同基质结合的条件下将样品与基于本发明的基质接触；和(c)在适宜的条件下，例如，合适的pH，通过洗脱而回收一种或多种结合的靶分子(如，免疫球蛋白)。
在一些实施方式中，在0.5M NaOH中温育5小时后，或10小时后，或15小时后，或25小时后，或30小时后，本发明的碱稳定性色谱分析用配体至少保留其95％的结合能力。
此处所述的能被多种配体结合的免疫球蛋白包括，如，IgG，IgA和IgM，或包含抗体或抗体任意片段的任何融合蛋白。
此处同样提供了编码多种所述配体的核酸分子，以及包含这些核酸分子的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞为原核细胞。在其它实施方式中，宿主细胞为真核细胞。
另外，本发明同样包括了包含此处所述的一种或多种配体及其功能性片段和变体的多肽库。在另一个实施方式中，本发明提供了核酸分子库，所述核酸分子编码本发明的一种或多种配体或编码其功能性片段和变体。
在一些实施方式中，本发明提供了基于SpA的配体，其与已知的SpA配体相比展示了变化的(上升或者下降的)结合免疫球蛋白的Fab片段的能力，但维持了同免疫球蛋白的Fc片段结合的能力。在一个实施方式中，基于本发明的一种基于SpA的配体显示了与野生型的SpA相比下降的结合免疫球蛋白的Fab片段的能力。在一个示例的实施方式中，基于本发明的碱稳定性色谱分析用配体进一步包括第29位的甘氨酸被丙氨酸取代。在另一个实施方式中，基于本发明的碱稳定性色谱分析用配体还包括第29位的甘氨酸被除丙氨酸或色氨酸外的氨基酸取代。
附图简述
图1描述了SpA的野生型(wt)的IgG结合结构域的核酸序列，如SEQ ID NO：1－5所示。SEQ ID NO：1表示wt E结构域的核酸序列；SEQ ID NO：2表示wt D结构域的核酸序列；SEQ ID NO：3表示wt A结构域的核酸序列；SEQ ID NO：4表示wt B结构域的核酸序列；SEQID NO：5表示wt C结构域的核酸序列。
图2描述了SpA Z结构域的核酸序列，如SEQ ID NO：6所示。
图3描述了SpA的野生型(wt)的IgG结合结构域(E、D、A、B和C)的氨基酸序列比对。SEQ ID NO：7表示wt E结构域的氨基酸序列；SEQ ID NO：8表示wt D结构域的氨基酸序列；SEQ ID NO：9表示wt A结构域的氨基酸序列；SEQ ID NO：10表示wt B结构域的氨基酸序列；SEQ ID NO：11表示wt C结构域的氨基酸序列。
图4描述了SpAZ结构域的氨基酸序列，如SEQ ID NO：12所示。
图5描述了质粒pJ56：8620的示意图。
图6描述了组氨酸标记的SpA的wt B结构域的氨基酸序列以及组氨酸标记的多种n+1突变体的氨基酸序列。SEQ ID NO：13表示组氨酸标记的SpA的wt B结构域的氨基酸序列，SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26分别表示n+1B结构域突变体E24M、E24I、E24F、E24T、E24P、E24W、E24R、E24V、E24L、E24Y、E24H、E24K和E24D的氨基酸序列。
图7描述了组氨酸标记的SpA的wt B结构域的核苷酸序列以及编码组氨酸标记的多种n+1突变体的核苷酸序列。SEQ ID NO：27表示编码组氨酸标记的SpA的wt B结构域的核苷酸序列，SEQ ID NO：28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40分别表示编码组氨酸标记的n+1B结构域突变体E24M、E24I、E24F、E24T、E24P、E24W、E24R、E24V、E24L、E24Y、E24H、E24K和E24D的核苷酸序列。
图8描述了汇总示例实验结果的条形图，该实验测量分析了组氨酸标记的多种n+1B结构域突变体的剩余IgG结合，n表示23位的天冬酰胺，该实验使用了本文所述的高通量的基于ELISA的检测。X轴表示多种不同的n+1B结构域突变体，其在24位有一个突变，Y轴表示在1N NaOH中暴露6小时后保持的IgG结合的百分比。如图中所示，在24位具有含大侧链的氨基酸的n+1B结构域突变体与wt B结构域相比显示了提高的腐蚀稳定性。
图9描述了汇总示例实验结果的条形图，该实验测量分析了多种SpA结构域三聚体(即，EEE、DDD、AAA、BBB、CCC和ZZZ)与琼脂糖树脂多点附着后保留的IgG结合能力的百分比。nPrA是指wt SpA。X轴表示腐蚀暴露的循环数，其中每个循环由在0.5N NaOH中暴露15分钟组成。Y轴表示结合的SpA配体保留的IgG结合能力。如图9中所示的，包含C或Z结构域三聚体的配体在腐蚀稳定性方面能力大致相当，比包含B结构域三聚体的配体具有更高的腐蚀稳定性，而包含B结构域三聚体的配体比包含A结构域三聚体的配体具有更高的腐蚀稳定性,包含A结构域三聚体的配体比包含E或者D结构域三聚体的配体具有更高的腐蚀稳定性。
图10描述了一个示例实验的结果，该实验测量分析了本发明的附着配体保留的IgG结合的结合能力的百分比，所述配体包括3个(B3)，或4个(B4)，或5个(B5)B结构域，附着在琼脂糖树脂的多位点上。并且，也使用了包含5个B结构域或7个B结构域并额外包含减少与Fab结合的突变(G29A)的附着配体，分别指的是B5－NF和B7－NF。nPrA是指wt SpA。X轴表示腐蚀暴露的循环数，其中每个循环由在0.5N NaOH中暴露15分钟组成。Y轴表示附着SpA配体的保留的IgG结合能力。如图10中所示，腐蚀稳定性的水平或程度直接与配体中B结构域的数量成比例，而不被降低与Fab结合的G29A突变体改变。
发明详述
本发明提供了基于SpA的碱稳定性色谱分析用配体，特别是，基于一个或多个SpA结构域的配体。现有技术描述了示例性的基于SpA的碱稳定性色谱分析用配体，包括，例如，在国际PCT专利申请no.WO2008/039141中描述的，其讨论了基于SpA C结构域的碱稳定性色谱分析用配体，该配体能够结合抗体的Fab部分，并用一种末端结合基团在单个位点上与一种不溶的载体联合；以及在美国专利No.6，831，161中描述的，其讨论了基于SpA的碱性基础的色谱分析用配体，该配体中的一个或多个天冬氨酸残基已经修饰。
为了使本发明公开的内容可能更易理解，首先定义了特定的名词。额外的定义在发明详述中给出。
I.定义
此处所用的，术语“SpA”或“葡萄球菌A蛋白”，指的是从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中分离的42Kda的多结构域蛋白。SpA经由羧基端的细胞壁结合区域结合于细菌细胞壁上，该区域指的是X结构域。在氨基末端区域，它包含5个免疫球蛋白结合结构域，指的是E、D、A、B和C(Sjodhal,Eur J Biochem.Sep 78(2):471-90(1977)；Uhlen et al.,J Biol Chem.Feb 259(3):1695-702(1984)。这些结构域中的每个都包含大约58个氨基酸残基，并且它们共有着65-90％的氨基酸序列相同性。SpA Z结构域是SpA B结构域的一个工程类似物，其包含在29位的一个替代了甘氨酸的丙氨酸(Nilsson,et al.,Protein engineering,Vol.1,No.2,107-113,1987.)。SpA E、D、A、B和C结构域的每一个均拥有不同的Ig结合位点。一个位点是为结合Fcγ(Ig中的IgG类的恒定区)，另一位点为结合特定的Ig分子的Fab部分(负责抗原识别的Ig的部分)。已经报道了每个结构域中都包含一个Fab结合位点。SpA中非Ig结合区位于C－末端，被命名为X区域或X结构域。
在美国专利No.5,151,350中描述了编码SpA基因的克隆，通过引用将其全部内容在此全部通过引用并入本文。
本发明提供了基于SpA的碱稳定性色谱分析用配体。根据本发明的一些方面，一种碱稳定性配体包含两个或更多个，或三个或更多个，或四个或更多个，或五个或更多个，或六个或更多个，或七个或更多个分离的SpAwt B或Z结构域。在根据本发明的其他一些方面，碱稳定性色谱分析用配体包含一个或多个分离的SpA E、D、A、B、C或Z结构域，其中一个或多个分离的结构域包括一个或多个在位置n+1处突变为选自色氨酸、精氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸组成的组中的氨基酸残基，其中n表示天冬酰胺。
在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种色谱分析用配体，其包含两个或更多个SpA B结构域，在树脂的多个位点上附着于色谱分析树脂。在另一个实施例中，本发明提供了一种色谱分析用配体，其包含两个或更多个SpA Z结构域，在树脂的多个位点上附着于色谱分析树脂。在另一个实施方式中，本发明提供了一种色谱分析用配体，其包含两个或更多个SpAC结构域，在树脂的多个位点上附着于色谱分析树脂。
本发明同样包含SpA的氨基酸变体，其可通过在母本氨基酸序列的任意位置取代、缺失和/或添加了一个或多个氨基酸而不同于其所来源的母本氨基酸序列，并且具有碱稳定性。在一些实施方式中，氨基酸序列变体与母本序列(即，wt SpA结构域或Z结构域)拥有至少约70％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％的序列相同性，所述变体具有碱稳定性。在一个具体的实施方式中，SpA的变体进一步包含第29位的甘氨酸残基被除丙氨酸、色氨酸外的氨基酸残基取代，而仍保留了碱性稳定性。
术语蛋白的“功能性变体”此处是指一种突变的蛋白，其功能，涉及到本发明被定义为具有碱稳定性，基本上保留下来。功能性变体包括，但不限于，包含多个SpA结构域的SpA变体，如，SpA各种结构域的二聚体，三聚体，多聚体，以及在一个或多个SpA野生型结构域上缺失、取代和/或添加了一个或多个氨基酸而仍保留此处所定义的碱稳定性的SpA变体。
此处所用的术语“母本分子”是指在根据本发明的修饰方法修饰之前的相应的蛋白形式或者引入本发明的突变之前的相应的蛋白形式。
术语“序列相同性”指的是两个核苷酸或氨基酸序列，当适当地排列时，例如使用默认缺口权重的GAP或者BESTFIT程序，共用着至少70％序列相同性，或至少80％序列相同性，或至少85％序列相同性，或至少90％序列相同性，或至少95％序列相同性或更高序列相同性。对于序列比对，通常一个序列作为参考序列(如，母本序列)，与检测序列进行比较。当使用序列比对算法时，检测序列和参考序列被输入到计算机中，如果必要，设定随后的坐标，然后确定序列算法程序的参数。随后序列比对算法基于设定的程序参数，计算出检测序列与参考序列的序列相同性的百分比。
为了比对，可进行序列的最佳对齐，例如，使用Smith和Waterman的局部同源算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981)，使用Needleman和Wunsch的同源对齐算法，J.Mol.Biol.48:443(1970)，使用Pearson和Lipman的查找相似度方法，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)，使用这些算法的计算机化的仪器(在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis的GAP、BESTFIT,FASTA、和TFASTA)，或使用直接研究结果(通常参见Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology)。适于确定序列相同性以及序列相似性的百分比的算法的一个实例是BLAST算法，其在Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990)中进行了描述。运行BLAST分析的软件通过美国国立生物技术信息中心可以公共获得(公共入口为国立健康中心NCBI因特网服务器)。通常地，可以使用默认的程序参数运行序列比对，虽然定制的参数也可以使用。对于氨基酸序列，BLASTP程序的默认参数为，字长(W)为3，预期值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
此处可互换使用的术语“E结构域”，“SpA E结构域”，以及“葡萄球菌A蛋白E结构域”，指的是如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽，或由例如SEQ ID NO：1所示的核酸序列编码的多肽。“E结构域”是一种51个氨基酸的多肽，折叠为三螺旋束结构。其可以通过螺旋1和2的表面的残基与Fc结合，或通过螺旋2和3的表面的残基与Fab结合。在一些实施方式中，根据本发明的E结构域与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或以上的序列相同性。
此处可互换使用的术语“D结构域”，“SpA D结构域”，以及“葡萄球菌A蛋白D结构域”，指的是如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，或由例如SEQ ID NO：2所示的核酸序列编码的多肽。“D结构域”是一种61个氨基酸的多肽，折叠为三螺旋束结构。其可以通过螺旋1和2的表面的残基与Fc结合，或通过螺旋2和3的表面的残基与Fab结合。在一些实施方式中，根据本发明的D结构域与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或以上的序列相同性。
此处可互换使用的术语“A结构域”，“SpA A结构域”，以及“葡萄球菌A蛋白A结构域”，指的是如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的多肽，或由例如SEQ ID NO：9所示的核酸序列编码的多肽。“A结构域”是一种58个氨基酸的多肽，折叠为三螺旋束结构。其可以通过螺旋1和2的表面的残基与Fc结合，或通过螺旋2和3的表面的残基与Fab结合。在一些实施方式中，根据本发明的A结构域与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或以上的序列相同性。
此处可互换使用的术语“B结构域”，“SpA B结构域”，以及“葡萄球菌A蛋白B结构域”，指的是如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽，或由例如SEQ ID NO：4所示的核酸序列编码的多肽。“B结构域”是一种58个氨基酸的多肽，折叠为三螺旋束结构。其可以通过螺旋1和2的表面的残基与Fc结合，或通过螺旋2和3的表面的残基与Fab结合。在一些实施方式中，根据本发明的B结构域与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或以上的序列相同性。
此处可互换使用的术语“C结构域”，“SpA C结构域”，以及“葡萄球菌A蛋白C结构域”，指的是如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，或由例如SEQ ID NO：5所示的核酸序列编码的多肽。“C结构域”是一种58个氨基酸的多肽，折叠为三螺旋束结构。其可以通过螺旋1和2的表面的残基与Fc结合，或通过螺旋2和3的表面的残基与Fab结合。在一些实施方式中，根据本发明的C结构域与如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或以上的序列相同性。
此处可互换使用的术语“Z结构域”，“SpA Z结构域”，以及“葡萄球菌A蛋白Z结构域”，指的是三螺旋的、59个氨基酸的多肽，其是A蛋白的B结构域的变体。Z结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。示例的Z结构域在Nilsson et al.,Protein Engng.,1:107-113(1997)中进行了描述，其全部内容在此通过引用并入本文。
此处所用的术语“具有碱稳定性的”，“碱稳定性”，“具有腐蚀稳定性的”或“腐蚀稳定性”，一般指的是根据本发明的色谱分析用配体的能力，其无论是单独的或者固定在色谱分析树脂上的，可以耐受重复的使用碱清洗的原位清洗(CIP)循环，而不丢失其结合能力。一般来说，设想一种树脂，其自身与本发明的配体结合固定化，在0.5M NaOH中浸泡长达30小时后，其稳定性变化低于5％。例如，在一些实施方式中，基于本发明的色谱分析用配体可以耐受延长时间内的通常的碱清洗，其赋予了配体诱人的候选性，特别是对免疫球蛋白进行低成本高效大规模的纯化过程尤为如此。在一些实施方式中，根据本发明的配体显示了在碱性环境中提高的化学稳定性，碱性环境可以被定义为，例如，具有提高的pH值如高于约10，或者高至约13或14。可选地，碱性环境可以由碱的浓度确定，如，约1.0M NaOH，或约0.7MNaOH，或约0.5M NaOH。在一个实施方式中，碱稳定性指的是根据本发明的碱稳定性色谱分析用配体的能力在0.5M NaOH中温育5小时后，或10小时后，或15小时后，或20小时后，或25小时后，或30小时后，保持了其至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％的结合能力。在另一实施方式中，碱稳定性指的是，在经过0.5M NaOH处理5小时，或7.5小时或10小时或15小时或20小时或25小时或30小时后，配体的结合能力的降低少于70％，或少于60％，或少于50％，或少于30％。
在一些实施方式中，根据本发明的基于SpA的色谱分析用配体与野生型的SpA相比显示了提高的或加强的碱稳定性。
碱稳定性可以使用常规实验和/或本文所述的方法以本领域的普通技术之一容易地测定。
此处使用的术语“色谱分析”，指的是一种动态的操作技术，其可以将目的被分析物(如，一种免疫球蛋白)从混合物中的其他分子中分离出来，并允许其被分离。一般地，在色谱分析方法中，一种流动相(液体或气体)运输着包含目的被分析物的样品通过或穿过一种静止相(通常是固体)介质。流动相运载着不同的被分析物时，与固定向的分离和亲和的差异导致不同的被分析物在不同的时间被分离出来。
此处所用的术语“亲和色谱分析”，指的是色谱分析的一种方式，被分析物通过与一种与被分析物特别的相互作用的分子(如，一种碱稳定性色谱分析用配体)之间的相互作用而被分离。在一个实施方式中，亲和色谱分析添加包含靶分析物(如，一种免疫球蛋白)的样品于一种固体支持上，该固体支持含有一种碱稳定性色谱分析用配体，如本文所述。
此处所用的术语“A蛋白亲和色谱分析”，指的是使用A蛋白或SpA配体从物质中的分开或分离，像本文所描述的，SpA或A蛋白配体被固定，如，固定在一种固体支持物上。本领域所熟知的A蛋白亲和色谱分析的介质/树脂的例子包括那些将A蛋白固定到一种受控制的微孔玻璃底板上，如，PROSEP ATM和PROSEP vATM介质/树脂(微孔)；那些将A蛋白固定到一种聚苯乙烯固相上，如，PIROS 50ATM以及Poros MabCapture ATM介质/树脂(AppliedBiosystems,Inc.)；以及那些将A蛋白固定到一种琼脂糖固体支持物上，如，rPROTEIN ASEPHAROSE FAST FLOWTM或MABSELECTTM柱上(Amersham Biosciences)。
术语“免疫球蛋白”，“Ig”或“抗体”(此处可互换使用)指的是一种蛋白质其包含基础的四多肽链结构，其中包括两条重链，两条轻链，所述的链是被稳定的，举例来说，使用链间的二硫键，其具有特异的结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(此处可互换使用)指的是一种蛋白质其含有一种双多肽链结构，包含一条重链和一条轻链，所述的链是被稳定的，举例来说，通过链间的肽接头，其具有特异地结合抗原的能力。术语“结构域”指的是包括稳定的肽环(如，包含3到4个肽环)重链或轻链多肽上的球型区域，例如，以β折叠片层形式和/或链间二硫键稳定。结构域此处进一步被称为是“恒定的”或“可变的”，这是基于，在“恒定的”结构域的各种结构域成员中，相关的序列缺少突变，而在“可变的”结构域的各种结构域成员中有明显的突变。抗体或多肽“结构域”经常指的是本领域中可互换使用的抗体或多肽“区域”。抗体轻链的“恒定的”结构域指的是可互换使用的“轻链恒定区”，“轻链恒定结构域”，“CL”区域或“CL结构域”。抗体重链的“恒定的”结构域指的是可互换使用的“重链恒定区”，“重链恒定结构域”，“CH”区域或“CH结构域”。抗体轻链的“可变的”结构域指的是可互换使用的“轻链可变区”，“轻链可变结构域”，“VL”区域或“VL结构域”。抗体重链的“可变的”结构域指的是可互换使用的“重链可变区”，“重链可变结构域”，“VH”区域或“VH结构域”。
免疫球蛋白或者抗体可能是单克隆或者多克隆的，并且可能以单体或多聚体形式存在，举例来说，IgM抗体以五聚体的形式存在和/或IgA抗体以单体、二聚体或多聚体的形式存在。术语“片段”指的是抗体或抗体链的一部分或区域，其与完整的或全部的抗体或抗体链相比包含较少的氨基酸残基。片段可以通过用化学或酶处理完整的或全部的抗体或抗体链获得。片段还可以通过重组方法获得。举例的片段包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fc和/或Fv片段。
名词“抗体结合片段”指的是免疫球蛋白或抗体的一个多肽部分，其结合抗原或与完整抗体(即，用其来源的完整的抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。结合片段可以通过重组DNA技术，或者酶法，或化学剪切完整的免疫球蛋白制备。结合片段包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fv，单链，以及单链抗体。
本发明也公开了包括抗体或其片段作为融合蛋白的一部分的融合蛋白。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”，此处可以互换使用，指的是任意长度，核糖核酸或脱氧核糖核酸的聚合物形式。这些术语包括单，双或三链DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，DNA－RNA杂交物，或者一种包含嘌呤和嘧啶基础的聚合物，或者其他天然的，化学的或生物化学修饰的，非天然的，或者衍生的核苷酸基础。多核苷酸的主链可以包括糖和磷酸基团(一般能出现在RNA或DNA中)，或者修饰的或者取代的糖或磷酸基团。另外，双链的多核苷酸可以通过化学合成的单链多核苷酸产物用合成其互补链或者在合适的条件下复性，或者使用适宜的引物用DNA聚合酶重新合成其互补链。核酸分子可以有多种不同的形式，如，基因或基因片段，一个或多个外显子，一个或多个内含子，mRNA，cDNA，重组多核苷酸，分枝多核苷酸，质粒，载体，任意序列的分离DNA，任意序列的分离RNA，核酸探针以及引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸以及核苷酸类似物，uracyl，其它糖以及连接基团如，氟代核糖和thioate以及核苷酸分枝。此处所用的，“DNA”或“核苷酸序列”包括但不限于基于A，T，C和G，还包括任何其类似物或者这些基础的修饰形式，如甲基化的核苷酸，核苷酸内修饰如不带电荷的连接以及thioate，使用糖类似物，以及修饰和/或任选的骨架结构，例如聚酰胺。在一个具体的实施方式中，核酸分子包括编码SpA变体的核苷酸序列。
术语“Fc结合”，“结合到Fc部”或者“结合至Fc部”指的是此处所述的碱稳定性色谱分子配体结合到结晶部(Fc)的能力。在一些实施方式中，基于本发明的配体以至少10－7M，或至少10－8M，或至少10－9M的亲和性结合到抗体(如，人IgG1，IgG2或者IgG4)的Fc部。
此处所用的，术语“与Fab结合”或“结合至Fab部”指的是此处所述的碱稳定性色谱分析用配体结合到抗体或者免疫球蛋白分子的Fab部的能力。术语“与Fab部降低的结合”指的是与野生型SpA相比，基于本发明的基于SpA的配体结合到免疫球蛋白的Fab(或F(ab)2)部的结合能力的任意的降低，所述配体进一步包括在一个或多个氨基酸上的突变。在一个示例的实施方式中，基于本发明的配体进一步包括29位的甘氨酸被丙氨酸取代。在另一实施方式中，基于本发明的配体进一步包括29位的甘氨酸被除丙氨酸和色氨酸之外的氨基酸取代。在一个实施方式中，与免疫球蛋白分子的Fab部的结合使用本领域的常规方法以及本文描述的方法不能被测出。与免疫球蛋白分子的结合可以使用包含本文描述的各种公知的技术进行检测，所述技术包括但不限于，例如，亲和色谱分析以及表面等离激元分析。在一些实施方式中，本发明公开的免疫球蛋白结合蛋白以至少10－10M的亲和性结合到免疫球蛋白分子上。
II.产生用作色谱分析用配体的基于SpA的分子
本发明公开的基于SpA的色谱分析用配体可以使用本领域已知的任意适合的方法制得。
例如，作为起始步骤，标准基因工程技术，如，在实验室手册，Sambrook，Fritsch和Maniatis写的《分子克隆》中描述的方法，可用来制备表达这里所述的SpA配体分子的核酸。
在一些实施方式中，编码一个或多个SpA结构域或其部分的核酸分子可以被克隆到一个合适的载体中以在合适的宿主细胞中表达。合适的表达载体是本领域熟知的，并且通常包括转录和翻译多种SpA编码序列的必要的元件。
此处所述的SpA分子还可被化学法合成，使用本领域熟知的方法从氨基酸前体形成片段，所述方法包括固相肽合成法如Boc(叔丁基－丁氧基肼基甲酸酯)或者Fmoc(9－芴甲氧羰基)方法(参见，如，美国专利No6,060,596；4,879,378；5,198,531；5,240,680)。
此处所述的SpA分子的表达可以在来源于真核细胞宿主的细胞中完成，所述宿主如酵母，昆虫或哺乳动物，或在原核宿主细胞内，如，细菌如大肠杆菌(E.coli)。
在一些实施方式中，SpA分子或其片段以及变体可在噬菌体的表面表达，从而导致每个噬菌体包含了编码一个独立的SpA分子的在其表面呈现的DNA序列。SpA分子对免疫球蛋白的亲和性可以使用本领域标准技术很容易地分析检测，以及使用这里所述的方法，如，ELISA以及BiacoreTM 2000标准装置(Biacore AB，Uppsala Sweden)。希望本发明的SpA对免疫球蛋白的结合亲和能力至少比得上其母本分子。进一步，希望SpA分子的碱稳定性与其母本分子相比普遍提高。
III.分析SpA分子的碱稳定性
在构建和纯化一种此处所述的适宜的SpA配体分子之后，可以使用本领域的标准方法或者本文描述的方法来检测分子的碱稳定性。例如，基于本发明的SpA分子的碱稳定性可以通过使用0.5M浓度的NaOH常规处理来分析，如，按照下文的实验部分的描述进行。
在一些实施方式中，碱稳定性SpA分子显示了提高的或增强的碱稳定性，意味着，与野生型的SpA相比，在经过了更长时间的碱性条件后，所述的分子是稳定的。以前，已经报道过基于野生型的SpA C结构域的SpA分子或者包含一个或多个天冬酰胺残基突变的SpA分子提供了增强的化学稳定性以及由此产生的降低的环境中的退化比，其中pH大于约10，如高至约13或14。
本发明是基于令人惊奇且出乎预料地发现了新的SpA分子，其显示了提高的碱稳定性，甚至当其是基于除C结构域以外的结构域或是含有除天冬酰胺以外的突变时也显示提高的碱稳定性。例如，本发明提供了基于B或Z结构域的碱稳定性SpA分子以及在n+1位氨基酸含有突变的SpA分子，n代表天冬酰胺(如，23位的天冬酰胺)。
在一些实施方式中，在构建了基于本发明的SpA配体之后，配体的碱稳定性通过使用一种新的高通量免疫学分析来评价，详细细节在下文实施例中。分析是基于假设的在延长的腐蚀暴露条件下的SpA的退化可以通过IgG结合的损失和减少反映出来。简言之，使用水或者1.0MNaOH处理可溶的基于SpA的配体约6小时。疏水反应被用来将微克级别的被中和的候选配体附着到ELISA板形式的固体支持物上，如，96孔板。随后评价每个候选配体在暴露于1.0M NaOH之前或之后的IgG结合能力。当暴露于腐蚀之后的保留下来的与配体结合的IgG超过野生型SpA或其所来源于的母本SpA时，说明腐蚀稳定性是增强的。
IV.用于制备色谱分析基质的支持物
在一些实施方式中，本发明公开的碱稳定性SpA配体附着到支持物上，如，固体支持物或者可溶支持物，来构建适宜分离生物分子，如，免疫球蛋白的色谱分析基质。
在一些实施方式中，基于本发明的配体附着至固体支持物上。不希望被理论束缚，任何合适的固体支持物都可以用来附着本发明的配体。例如，固体支持物基质包括，但不限于，控制尺寸的微孔玻璃、硅石、氧化锆、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、和聚苯乙烯。
预期任何多孔材料在0.5M NaOH中浸泡约30小时后对附着的配体的碱稳定性的造成的改变低于5％时，可以用作固体支持物。
用作固体支持物的多孔材料可能包括亲水化合物、疏水化合物、疏油化合物、亲油化合物或者其组合物。多孔材料可能包括聚合物或共聚物。适宜的多孔材料的离子包括，但不限于聚醚砜，聚酰胺，如，尼龙，聚多糖，例如，琼脂糖和纤维素，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚四氟乙烯，聚砜，聚偏1,1-二氟乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚碳酸酯,碳氟化合物，如，聚(四氟乙烯－共－氟(烷基乙烯醚))，玻璃，硅石，氧化锆，钛白，陶瓷和金属。
多孔材料可能包括一种有机或无机分子或者有机和无机分子的组合物，还可能包含一个或多个官能团，如，羟基，巯基，氨基，羰基，或者羧基，适宜于反应，如，构成共价键来进一步化学修饰，所述化学修饰的目的是为了在蛋白上添加共价键。在另一个实施方式中，多孔材料可能不包括官能团，但是可以被一种产生官能团如，羟基，巯基，氨基，羰基，或者羧基的材料片层包被。
在一些实施方式中，使用常规的亲和色谱分离基质，它们例如是有机性的以及基于对水性介质暴露出亲水性表面的聚合物，即，所述聚合物暴露羟基(－OH)，羧基(－COOH)，羰基(－CHO，或PCO-R’)，羧氨基(－CONH2，可能是N－取代形式)，氨基(－NH2，可能以取代形式)，位于其外部以及，如果有的话，还可能位于其内表面的寡或者聚乙二醇基团。在一个实施方式中，聚合物可能，例如，基于多糖，例如葡聚糖，淀粉，纤维素，支链淀粉，琼脂糖等，其优选是交联的，例如使用双环氧化物，表卤代醇，1，2，3－三卤代低烃，以提供合适的多孔性和刚性。在另一个实施方式中，固体支持物包含多孔的琼脂糖小珠。本发明使用的各种支持物可以通过本领域已知的标准方法很容易制备，例如，逆悬浮凝胶作用，其在如，Hjerten，Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)中描述过。或者，基础基质可以是可商业获得的产品，例如SepharoseTM FastFlow(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)。在一些实施方式中，特别优选适于大规模分离，支持物适应于提高其刚性，因此赋予了基质更适宜于高流速的性质。
或者，固体支持物可以基于合成的聚合物，例如，聚乙烯醇，多羟烷基丙烯酸酯，多羟基甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酸胺等。关于疏水聚合物，如基于二乙烯以及单乙烯取代苯，基质的表面经常是亲水化的以便将上文定义的亲水基团暴露于周围的含水液体。这样的聚合物可以按照标准方法很容易地生产，参见如，Arshady，Chimica e L'Industria 70(9)，70-75(1988)。或者，商业可获得的产品，例如SourceTM(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)以及Poros(Applied BioSystems，Foster City,CA)可能被使用。
在另一些实施方式中，固体支持物包含无机物支持物，例如，硅石，氧化锆等。无机基质的表面经常被修饰包含合适的活性基团，其可以进一步与SpA及其变体反应。实例包括CM Zirconia(Ciphergen－BioSepra(CergyPontoise，France)以及(Millipore)。
在一些实施方式中，聚合物可能，例如，是基于锆，或硅石，或控制的微孔玻璃，其可能被修饰包含活性基团和/或可耐受腐蚀浸泡，来与配体联用。
示例的固体支持物形式包括，但不限于，小珠，凝胶，膜，盒，柱，芯片，载玻片，平板或者整体塑制品。
关于基质的形式，在一个实施方式中，其是一种多孔整体塑制品的形式。在一个可选的实施方式中，基质是小珠或者微粒的形式，其可以是多孔的或者无孔的。小珠或微粒形式的基质可以作为填充床或悬浮形式使用。悬浮形式包括那些一致的作为延展床以及纯化的悬浮物，其中微粒或小珠可以自由移动。关于整体塑制品，填充床以及延展床，分离步骤一般紧随着使用浓缩梯度的常规色谱分析。关于纯化的悬浮物，将使用分批的形式。还有，以平面，芯片，毛细管或片层形式存在的固体支持物可能被使用。
基质同样可以是柱体的膜形式。膜可以是平坦的片层，螺旋的或者是中空的纤维形式。
在另一个实施方式中，基于本发明的配体附着到可溶的支持物上，如，可溶的聚合物。示例的可溶支持物包括，但不限于，生物聚合物如，蛋白或者核酸。在一些实施方式中，生物素可能作为可溶的聚合物使用，如，在美国专利公开号No.20080108053中描述的。举例来时，生物素可能结合到配体上，例如基于本发明的基于SpA的腐蚀稳定性配体，其结合到配体之后可以用来分离想要的蛋白，如，抗体或其片段，如，存在于在粗制混合物中，以及想要的蛋白可以经由沉淀的生物素－配体－蛋白聚合物络合物分离或者分开，以可逆的或者不可逆的形式。聚合物可能同样是合成的可溶聚合物，如，举例来说，包括但不限于，包含阴离子基团(羧基或磺基)、阳离子基团(季胺，叔胺，仲胺或伯胺基)，疏水基团(苯基或丁基)，亲水基团(羟基或氨基)的聚合物或其组合物。示例的合成的可溶聚合物可以在国际PCT专利公开号No.WO2008091740和美国公开号No.US20080255027中找到，上述每篇文献的全部教导在此通过引用并入本文。这些聚合物，在特定的一个或多个物理变化的条件下，如pH，导电性或温度，可以经由可逆或不可逆的沉淀过程来纯化想要的蛋白。合成的可溶聚合物可能单独使用或者与基于本发明的腐蚀稳定配体联用，用于经由可逆或者不可逆的沉淀过程来捕获/纯化想要的蛋白，如，抗体或其片段。
V.将配体附着至支持物上的方法
任何适宜的方法可能用来将配体附着至支持物上，如，包括本领域熟知的以及此处所述的那些固体支持物。例如，在一些实施方式中，配体可能通过一般偶联技术附着到支持物上，偶联技术使用，如，配体上的氨基和/或羧基基团。例如，二环氧化物，表氯环氧丙烷，CNBr，N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)等为已知的偶联试剂。在一些实施方式中，在支持物和配体之间引入间隔区，这样提高了配体的实用性以及促进配体到支持物上的化学偶联。可变的，配体也可以通过非共价键附着至支持物上，如物理附着或者生物特异附着。
在本发明公开的多种实施方式中，配体附着到固体支持物，如，色谱分析树脂上的多于一个位点处，形成了色谱分析基质。
可以通过许多已知的不同的方法实现将基于SpA的碱稳定性色谱分析用配体附着于固体支持物上，其中大部分都是本领域已知的，以及本文描述的这些方法。参见，如，Hermanson等，Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,pp.51-136(1992)。
举例来说，蛋白配体可以通过固体支持物的表面或者蛋白配体的活性基团连接到固体支持物上，如，羟基，巯基，环氧基，氨基，羰基，环氧基或者羧基基团。附着可以使用已知的化学方法包括，但不限定，利用溴化氰(CNBr)，N－羟基琥珀酰亚胺酯，环氧(双环氧乙烷)活化作用，以及还原氨基化作用。
举例来说，直接巯基蛋白偶联在文件中被描述。参见，例如Ljungquist，等，Eur.J.Biochem.Vol 186,pp.558-561(1989)。这种技术已经应用于偶联SpA到固体支持物上。因为野生型SpA不包括巯基基团，附着通过重组***巯基包含位于SpA C末端的半胱氨酸而实现。参见，如，美国专利No.6,399,750。一些商业化的产品如MabSelectTM,MabSelectTM Xtra及MabSelectTM SuRe通过这种机制生产。已经报道了这个末端的半胱氨酸只与固体表面的环氧基反应，因此导致SpA的单个位点附着至固体支持物上。参见，如，Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry,CRC Press,2006,473页。
关于本发明，一些特定的实施方式中，通过无差别的多点附着，将包含两个或更多个SpA结构域的基于SpA的色谱分析用配体附着到一种固体支持物的多个位点上。一般来说，SpA包含来自各个结构域的大量赖氨酸的丰富的自由氨基基团。SpA结构域附着到固体支持物的多个位点上，如，一种包含环氧基和醛基的色谱分析树脂，可以通过SpA上的赖氨酸的氨基基团，分别经由环氧化物开环或者脱胺作用进行附着。在一些特定的实施方式中，多点附着可以通过包括自由羟基基团的SpA上的一个或多个天然存在的氨基酸与包含环氧基的支持物经由开环反应获得，所述自由羟基的基团如，丝氨酸和酪氨酸。可变的，多点附着是可以获得的，例如，通过包含自由羧酸基团的SpA上天然存在的氨基酸，例如，天冬氨酸和谷氨酸，与包含氨基基团的支持物经由，如，N，N’－羰二咪唑。配体多点附着于支持物上同样可以根据以上的机制进行组合获得。
为了使用B和Z结构域的多聚体获得碱稳定性，本发明排除了单个导致单位点附着的半胱氨酸突变。
基于SpA的色谱分析用配体可能还经由一种联合机制附着至固体支持物上。举例来说，联合基团可能与包含感兴趣的非共价的配体反应，经由离子，疏水的，或者联合反应，可以使感兴趣的配体附着到固体表面上。这样可以推进配体与固体基质的有效的联用，例如，如美国公开专利No.20070207500A1中所述的，因此，导致了配体比没有联用基团的配体密度更高。适于用于本发明的联用基团包括带电荷的，如离子的，以及不带电荷的，如疏水基团。联用基团可以修饰固体支持物，如，直接与固体支持物共价结合。适合的离子基团可能包括季胺，叔胺，仲胺，伯胺，磺基，羧酸，或其任意组合。适宜的疏水基团可能包括苯基，丁基，丙基或其任意组合。还考虑混合的种类可以被使用。联用基团可能与蛋白配体反应。因此在联用基团和蛋白配体之间的反应可能由一系列的反应组成，如，离子的以及疏水的。
联用的基团可能共价结合到固体支持物上，通过固体支持物上的一个官能团与联用基团上的一个官能团发生反应。适合的官能团包括，但不限于，氨基，羟基，巯基，羧基，亚胺，醛，酮，烯，炔，偶氮，腈，环氧基，氰根,以及活化的羧酸根。作为一个例子，琼脂糖小珠包含疏水基团，其可能与阳离子的联合基团的功能环氧基反应，所述联合基团如缩水三甲基氯化胺。本领域技术人员能够理解多数联合基团可能与提供的固体支持物偶联，至少使用一个双功能的联合基团。因此联合基团可能串联偶联至固体支持物上，或者它们可能单独地直接偶联到固体支持物上。
在一些实施方式中，本发明提供了联合基团和/或蛋白配体，其可能通过干涉接头偶联到固体支持物上。接头可能包含至少一个偶联到连接部的官能团。连接部可能包括任意可以与官能团连接的分子。例如，连接部包括任意一种烷基，烯基或炔基。连接部可能包括范围在1-30个碳原子的碳链。在一些实施方式中，接头可能包括大于30个碳原子。连接部可能包括至少一个杂原子如氮，氧或硫。连接部可能包括分枝链，不分枝的链或环链。连接部可能用两个或更多个功能区代替。
本领域技术人员有能力选择偶联蛋白配体和固体支持物的合适的缓冲液条件。合适的缓冲液包括任何无氨基的缓冲液，如碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐以及乙酸盐缓冲液。当使用联用的化学物时，缓冲液的盐浓度将取决于使用的联合基团。例如，盐浓度可能在5nM-100mM的范围内。当使用带电荷的种类，盐浓度可能至少5nM，但是小于0.1M，至少5nM但小于0.01M，至少5nM但少于0.001M。在特定的实施方式中，盐浓度可能是0.01M。当使用疏水种类时，通常需要高盐浓度。因此盐浓度可能高于0.001M，高于0.01M，或高于0.1M。
在一些实施方式中，当使用联合化合物时，在范围在0℃－99℃的温度下发生反应。在一些特定的实施方式中，反应方法在低于60℃，低于40℃，低于20℃，或低于10℃的温度下进行。在一些实施方式中，本发明的方法在大约4℃的温度下进行。在其他一些实施方式中，本发明的方法在20℃的温度下进行。
VI.分析附着配体的碱稳定性的方法
在附着于固体支持物之后所述配体的提高的碱稳定性可以通过本领域已知的技术以及使用此处所述的方法进行分析。例如，在一些实施方式中，附着于树脂上的SpA结构域的多聚体(例如，如此处所述的SpA B和Z结构域附着于一种色谱分析树脂上)的碱稳定性，可以通过用0.5M的NaOH处理树脂来确定。可以理解提高的稳定性指的是在长时间后保留了比野生型的SpA分子提高的初始的IgG结合能力。例如，在本发明的情况下，每个循环包括使用0.5N NaOH的15min的处理，100个循环之后，SpA配体，如，包括多个B或者Z结构域，保留的能力的百分比，比野生型的SpA高至少1.5倍以上，2.0倍以上，2.5倍以上，或3倍以上。在一个实施方式中，按照下文的方法测量结合配体的碱稳定性，其中测定是一段时间后保留的IgG结合能力。结合能力，指的是Qd 50％，通过获得50％初始IgG浓度的UV280nm的读数时上样IgG的体积进行测量。首先测量柱上的堆填的起始未处理树脂的Qd50％。然后树脂被暴露于0.8ml/min的0.5N NaOH中15min，约10个循环。再测Qd50％。这个过程一直重复到树脂暴露于0.5N NaOH中大约100个循环之后。最后再测一次Qd50％的值，不同配体的树脂的结果与野生型的SpA进行比较。
在另一个分析中，树脂的腐蚀或碱稳定性通过固定浸泡目的树脂来测量。通过将定量的树脂浸泡于0.5N NaOH中25小时，其间温柔地晃动，以及测量NaOH浸泡前和浸泡后地IgG结合能力，可以通过树脂保留的结合能力来确定碱稳定性。
VII.使用本发明的色谱分析用配体纯化靶分子的方法
在一些实施方式中，本发明提供了一种使用此处所述的碱稳定性色谱分析用配体从混合物中纯化一种靶分子的方法。靶分子可能是一种可以被此处提供的碱稳定性色谱分析用配体识别的任意一种分子，所述配体与固体支持物联用。靶分子的例子包括免疫球蛋白。免疫球蛋白可能是多克隆抗体或单克隆抗体或其功能性片段。功能性片段包括免疫球蛋白的任意片段，所述抗体包括一个仍然可以特异结合其抗原的可变区，同时保留了其特异性结合与固体支持物联用的蛋白配体的能力。
在一些实施方式中，使用本文所述的碱稳定性色谱分析用配体分离目的靶分子的方法包括如下步骤：(a)将包含附着有基于SpA的碱稳定性色谱分析用配体的固体支持物与包含目的分子的混合物在使靶分子可以特异地结合到配体上的条件下接触；以及(b)改变条件使得靶分子不再结合在配体上，因此可以分离出靶分子。
在一些实施方式中，改变的步骤包括改变pH，使得靶分子不再结合在配体上。在一个具体的实施方式中，pH以一种方式改变使得其比步骤(a)的pH条件更为偏酸性。例如，在一个实施方式中，步骤(a)可能在中性的pH下实行，或者pH在约6到约8的pH范围内，而步骤(b)可能在酸性pH下实行，如，在约1到约5的pH值的范围内。
在另一个实施方式中，步骤(b)包括改变使用的缓冲液中盐的浓度，使得靶分子不再结合在配体上。例如，在一个实施方式中，高盐浓度，如，>0.1M，可能用于步骤(a)中，而低盐浓度，如，<0.1M可能用于步骤(b)中。相反的，在一些实施方式中，低盐浓度，如<0.1M可能用于步骤(a)中，而高盐浓度可能用于步骤(b)中。在另一些实施方式中，pH和缓冲溶液的盐浓度可能在步骤(a)和步骤(b)间均发生了改变。
本领域技术人员可以很容易地确定适宜结合靶分子到配体上的条件，因此可以改变条件来破坏分子与配体的结合。
下面的实施例进一步图解说明了本发明，实施例不应认为作为限制。参考文献的内容，专利以及本申请中引用的公开的专利申请，以及其附图，在此通过引用并入本文。
实施例
实施例1：构建包含n+1突变的SpAB结构域变体，其中n代表一个天冬酰胺
在一个示例的实验中，从DNA 2.0(Menlo Park，CA)中获得编码A蛋白的“B结构域”的合成基因。基因的5’末端包括一个起始的甲硫氨酸的密码子，在基因的3’端包括6个组氨酸的密码子。基因存在于来自DNA 2.0的质粒pJ56：8620。母本质粒pJ56有氨卡青霉素，卡那霉素，氯霉素和庆大霉素抗性。为了随后的基因克隆至表达载体中，合适的限制型内切酶位点被引入至基因的5’端和3’端。质粒的图谱如图5所示。
随后通过使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)的基于PCR的方法，采用饱和度诱变将第24位的谷氨酸突变为除半胱氨酸(C)，丝氨酸(S)，丙氨酸(A)，甘氨酸(g),天冬氨酸(N)，和谷氨酰氨(Q)之外的其他天然存在的氨基酸。引物购自IDT DNA(Coralville，IA)，以100μM的溶液存于Tris EDTA缓冲液中。突变引物包含序列CTGCCGAACCTGAACNNSGAACAACGCAACGG(SEQ ID NO:41)，其中NNS代表编码24位氨基酸的3个碱基。PCR在50μL反应体系进行，包含dNTPs(每种0.2mM)，每种引物125ng，50ng模板质粒，和1U的Phusion酶。PCR按照表III中的方案进行。
表III
PCR反应物使用限制性内切酶DpnI(New England Biolabs，Ipswich，MA)进行处理以降低野生型背景。向每个50μL的PCR反应物加入大约1μL的DpnI酶，样品被置于37℃孵育大约1小时。
使用2μL的DpnI处理过的PCR反应物转化大肠杆菌NEB5α感受态细胞(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)。细胞在冰上解冻，并在25μL细胞中加入2μL的PCR反应物。在冰上孵育大约30分钟后，细胞在约42℃热休克30秒。细胞在冰上恢复约5分钟，随后加入125μL的SOC培养基(New England Biolabs)。细胞在37℃下大约孵育1个小时，然后将100μL铺于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上(Northeast Laboratory Services,Winslow,ME)，在37℃生长过夜。通过使用SDS PAGE检测总细胞裂解物中的表达蛋白来确定阳性克隆。
为了获得纯化的DNA，挑选单个克隆在包含100μg/mL的氨苄青霉素的LB中培养过夜。使用Qiagen(Valencia，CA)的spin mini－prep试剂盒进行DNA的纯化。
对Mini－prepped DNA进行测序来确定每个克隆(MWG,Biotech,Huntsville AL)的鉴定。构建得到的质粒按上文描述的方法用来转化大肠杆菌NEB5α感受态细胞。
在阳性克隆确定之后，35ml过夜培养物在含有100μg/mL的氨苄青霉素的TerrificBroth的培养基中培养，13,500g离心10分钟沉淀细胞。沉淀重悬于10ml含20mM咪唑的PBS(磷酸缓冲液)中，用超声破碎后13,500g离心30分钟沉淀不溶物。裂解物随后施于用10倍柱体积的含20mM咪唑的PBS预平衡过的750μl的Ni-NTA树脂上。在用20倍柱体积的含20mM咪唑的PBS洗涤过后，样品用含200mM咪唑的PBS从树脂上洗脱。纯化的蛋白用Pierce Slide-A-Lyzer 3.5 MWCO的透析盒逆PBS透析过夜。在透析之后，使用Pierce MicroBCA分析来完成总蛋白的定量，样品储存在-30℃。
野生型的组氨酸标记的B结构域和多种n+1的突变体的氨基酸序列和核苷酸序列如图6和图7所示。
实施例2：检测表达蛋白的碱稳定性
如实施例1中所述的亲和纯化的野生型的和突变型的SpA组氨酸标记的构建体以MilliQ水或NaOH稀释至终浓度为1N，在室温下孵育6小时。使用Biorad Micro Biospin 6凝胶柱来中和和缓冲交换每个样品中的50μL至PBS中。总蛋白的定量使用Pierce MicroBCA分析完成，为了在ELISA板上上样样品在PBS中被稀释至10μg/ml。大约200μl(2μg)处理过的PrA附着在ELISA板上的孔中，37℃下2-24小时。板在PBS的PierceSuperblock Blocking缓冲液(Superblock-PBS)中室温封闭约2小时。大约200μl的Sigma人伽马球蛋白在Superblock-PBS(10μg)中被稀释至0.05mg/ml，加入板的每个孔中，结合反应在室温下进行约1小时。接着用包含0.05％Tween20(PBS-T)的PBS冲洗3次，然后用200μl抗人IgG的1：10，000稀释的鸡IgY-HRP偶联物孵育平板，室温下约1小时。在最后使用PBS－T洗涤三次之后，平板用100μl Pierce 1-Step Slow TMB ELISA室温下30分钟进行显色。添加100μl 1N的HCL停止反应，并且通过450nm处的吸收值读数来定量主要的IgG结合。所有的样本都被三重检测，检测腐蚀处理之前和腐蚀处理之后的主要IgG结合的差异的数据。
图8的条形图中汇总了一个示例实验中分析多种n+1B结构域突变体的碱稳定性的结果。多种构建体被标于X轴上，相应的在暴露于1M NaOH中6小时后的保留的IgG结合的百分比置于Y轴上。如图8的条形图所示的，一些在B结构域24位包含大的氨基酸的n+1突变体显示了提高的腐蚀稳定性。
在另一个实施例中，使用上述方法分析包含两个或更多个SpA B结构域或者两个或更多个SpA Z结构域的SpA配体的碱稳定性。在另外的一个实施例中，使用上述方法分析包含三个B结构域(B3)，4个B结构域(B4)，5个B结构域(B5)，6个B结构域(B6)，或7个B结构域(B7)的SpA配体的碱稳定性。
在一个示例性的实验中，以此处所描述的基于ELISA的方法检测的配体B3，B4和B5的剩余IgG结合能力的百分比如下。B3配体在其暴露于1M NaOH中六小时后保留了大约79％的剩余IgG结合能力；B4配体在其暴露于1M NaOH中六小时后保留了大约86％的剩余IgG结合能力；B5配体在其暴露于1M NaOH中六小时后保留了大约83％的剩余IgG结合能力。野生型的SpA配体(nPrA)在其暴露于1M NaOH中六小时后只保留了大约49％的剩余IgG结合能力。
实施例3：将野生型SpA与SpA变体附着于固体支持物
在构建好各种SpA变体以及按照在实施例2中描述的本领域熟知的一种或多种分析方法确定了那些腐蚀稳定性变体之后，将SpA变体附着至支持物上，如，一种固体支持物。在一个示例性的实验中，琼脂糖小珠(Sepharose 4B)(GE Healthcare,Piscataway NJ)通过表氯环氧丙烷利用以前描述的方法(Porath和Fornstedt,J.Chromatography,51:479(1979))进行交联。琼脂糖小珠与正电荷联合组发生反应，所述正电荷联合组例如，阳离子，通过如下方法：将50mL小珠加入到40g 75％重量百分比的氯化缩水甘油三甲基铵(GTMAC)，水(Millipore Corp.,Billerica,MA)以及1.67g 50％重量百分比的氢氧化钠中。反应在摇床上强烈地振动(>100rpm)，室温下过夜。小珠随后被过滤以及使用3次100mL体积水(Millipore Corp,Billerica,MA)冲洗。
将小珠(50mL，过滤块)加入到装有15mL4.6M NaOH的瓶中。混合物被匀浆，随后加入19.5mL丁二醇二缩水甘油醚(BUDGE)。混合物在35℃下振荡2小时。小珠随后用水(Millipore Corp,Billerica,MA)冲洗，并且使用250mL的10mM的NaHCO3进行平衡。
紧跟着BUDGE活化步骤，将10mL过滤小珠块加入到含15g/L浓度的野生型SpA或者基于本发明的一种SpA配体的10mL的10mM NaHCO3溶液中。混合物被盖帽置于玻璃小瓶内，37℃下在杂交炉中晃动2小时。两小时后，使用30mL 水(Millipore Corp,Billerica,MA)冲洗小珠。将过滤的小珠块(10mL)加入装有10mL溶液的瓶中，该溶液包含1mL硫代甘油，以及9mL含0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的缓冲液。混合液被匀浆，然后在室温下振荡过夜。随后使用20mL如下缓冲液洗涤小珠：0.1M Tris缓冲液(pH8)，添加0.15M NaCl的0.1M的Tris缓冲液(pH8)，50mM乙酸(pH4.5)，添加0.002％叠氮化钠的PBS(pH7.4)。
结合不同的SpA变体的树脂样品标记如下：nPrA表示野生型SpA；Z3表示包含3个Z结构域的SpA配体；E3表示包含3个E结构域的SpA配体；D3表示包含3个D结构域的SpA配体；A3表示含3个A结构域的SpA配体，C3表示含3个C结构域的SpA配体；B3表示含3个B结构域的SpA配体；B4表示含4个B结构域的SpA配体；B5表示含5个B结构域的SpA配体；B5NF和B7NF表示含5或7个B结构域，分别地，还具有附加的在29位的一个G29A突变。在附着于树脂之后，检测各种SpA变体的碱稳定性。
实施例4：腐蚀循环前后树脂IgG结合能力(Qd50％)检测
在一个示例的实验中，根据本发明的各种SpA构建体在附着于支持物上之后测量分析其IgG结合能力。在一个示例的实验中，使用了用商品化的多克隆IgG来检测树脂/介质的动态能力的一种标准方法。简言之，树脂与根据本发明的一种SpA配体联用，填充置于在PBS，pH7.4中的Omnifit柱中(6.6mm×70mm)，流速设置为300cm/hr。填充柱使用10个柱体积(CV)的PBS平衡。多克隆IgG(Sigma-Aldrich，2mg/mL在pH7.4的PBS中)装入柱中直到UV280nm达到高于50％的起始IgG浓度。在用平衡缓冲液洗涤之后，IgG用0.1M pH 3.0的柠檬酸洗脱。在每次运行之后，介质使用6M的Guanidinine的氢氧化物进行消毒。Qd50％的计量是基于在UV280nm达到50％的起始IgG浓度时装入的IgG的量。
在起始的动态能力测量之后，介质被暴露于0.5N NaOH(流速100cm/hr)中15min，进行10个循环，然后进行另一个IgG的动态能力测量。随后介质与0.5N NaOH接触15min，再进行10个循环，接着进行另一个动态结合能力测量。动态结合能力测量在每个样本暴露于0.5N NaOH中15min，进行100个循环之后进行。
在一个示例的实验中，其结果如图9所示，包含天然的B结构域的接头的E、D、A、B、C和Z结构域的三聚体附着于一种琼脂糖树脂上，在经过100个腐蚀暴露循环后，通过动态结合能力的检测来测量其腐蚀稳定性，每个循环包括暴露在0.5N NaOH中15分钟。如图9的图表中所汇总的，循环的数目绘制于X轴，IgG结合能力绘制于Y轴。C和Z结构域三聚体显示了大致相同等级的腐蚀稳定性。B结构域三聚体比A结构域三聚体具有更高的腐蚀稳定性，而A结构域三聚体比E和D结构域三聚体的腐蚀稳定性更高。因此，腐蚀稳定性的顺序排列可以汇总如下C和Z>B>A>E和D。
在另一个示例的实验中，与B结构域变体联用的琼脂糖树脂：BBB(B3)，BBBB(B4)，BBBBB(B5)，BBBBB-NF(B5-NF)，以及BBBBBBB-NF(B7-NF)，使用上述的检测方法检测其同wtSpA (nPrA)比较在经过腐蚀暴露100个循环之后的IgG动态结合能力，其中每个循环包括在0.5N NaOH中暴露15分钟。如图10中的图表汇总的结果，腐蚀稳定性的程度与结构域的数量直接成比例，并且进一步，降低与Fab结合的G29A突变不影响腐蚀稳定性。
在此通过引用并入本文的详细说明的教导可以帮助更透彻地理解本发明的详细说明。在详细说明中的实施方式中提供了本发明的实施方式的图解，但不应被解释为限制其范围。本领域技术人员很容易认识到本发明还可以包括许多其他的实施方式。所有的公开出版物以及发明在此全部通过引用并入本文。在范围方面，引入参考的各种材料如果存在与本发明详细说明存在矛盾或者不一致的地方，本发明的详细说明将放弃任何这样的材料。此处引用的任何的参考文献并不被认为这些文献是本发明申请的在先的技术。
除了特别指出的，所有表达成分数量，细胞培养基，处理条件的数值，在此详细说明中列出的，以及包括权利要求，被理解为在任何实例中用术语“约”修饰。据此，除非特别相反指出，否则数量参数是大约的，并且可能根据本发明想获得的性质进行变化。除非特别指出的，在一系列组分之前的术语“至少”被理解为指的是这个系列中的每个组分。本领域技术人员可以知道，或者能够确定此处所述的本发明的特定的实施例的各种等效结果。这些等效结果也计划包括在下述的权利要求中。
本发明的许多修饰和改变可以不脱离其精神和范围被获得，这些对于本领域技术人员来说是显而易见的。描述的特定的实施方式拟只用作举例说明，而不意味着以任何方式进行限制。考虑到详细说明和实施例仅仅认为是示例，而如下的权利要求指出了本发明确定的范围和精神。

Claims (6)

1.一种碱稳定性亲和色谱分析用配体，所述配体包括通过多点连接附着于固体支持物的葡萄球菌A蛋白(SpA)的两个或更多个C结构域，其中至少一个结构域包含：
a)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:5所示的核酸序列所编码的氨基酸序列；或者
b)与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，或者与由SEQ ID NO:5所示的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；且
其中每个C结构域包含在29位用除丙氨酸或色氨酸外的氨基酸取代甘氨酸，且
其中所述配体在0.5M NaOH中温育5小时后，保留其至少95％的结合能力。
2.根据前述权利要求之一的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体与wtSpA相比能够结合至少1.5倍，或2倍，或3倍，或更多的IgG。
3.根据前述权利要求之一的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述C结构域包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:5所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，并包含在29位甘氨酸的所述取代。
4.根据前述权利要求之一的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述固体支持物选自以下组中：受控制的微孔玻璃、聚乙烯醇、氧化锆、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚苯乙烯。
5.一种色谱分析用基质，包含权利要求1-4之一的碱稳定性亲和色谱分析用配体。
6.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)提供含有一种或多种免疫球蛋白的样品；
(b)在一种或多种免疫球蛋白同基质结合的条件下，将所述样品与权利要求5的基质接触；和
(c)通过在适宜的条件下洗脱而回收一种或多种结合的免疫球蛋白。
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