CN108864226B - 一种从矮地茶中提取紫金牛素和槲皮甙的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从矮地茶中提取紫金牛素和槲皮甙的方法，具体步骤包括如下：将矮地茶粉碎，加入***回流浸提，过滤，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ；滤渣Ⅰ加入木霉和黑曲霉发酵液，25～35℃发酵，再加入乙醇回流提取，过滤，得滤液Ⅱ；滤液Ⅱ减压浓缩得浓缩液Ⅰ，加入两倍至四倍体积的***进行萃取，得萃取液Ⅰ和溶液A；溶液A与乙醇进行混合均匀后，上大孔树脂柱，用乙醇进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ，并减压浓缩得浓缩液Ⅱ，结晶重结晶得槲皮甙纯品；滤液Ⅰ和萃取液Ⅰ合并浓缩，上硅胶层析柱，用石油醚‑乙酸乙酯洗脱，浓缩至干，乙醇溶解，活性炭脱色，浓缩至结晶得紫金牛素纯品。

Description

一种从矮地茶中提取紫金牛素和槲皮甙的方法
技术领域
本发明属于天然产物化学的技术领域，涉及一种从矮地茶中分离纯化紫金牛素和槲皮甙的方法。
背景技术
矮地茶为紫金牛科植物紫金牛的干燥全株。全株长21.5～25厘米。多附有匍匐根茎。茎圆柱形或稍扁，直径2～5毫米，表面暗红棕色，具细纵纹及突起的叶痕，基部疏生须状不定根；顶端有时可见花梗或暗红色皱缩的球形小果，产于湖南省各地。全株入药。主要成分：紫金牛酚Ⅰ、Ⅱ，紫金牛素、槲皮甙、信筒子醌、冬青萜醇、酸金牛醌及槲皮甙、挥发油、杨梅树皮甙等。
公开号为CN1762348的中国专利介绍了一种岩白菜素滴丸的制作方法，将岩白菜素经定性定量，为白色结晶；按国家标准选购基质；将上述有效成分按权利要求2-4任何一项，将基质加热至85℃熔化；然后将药物加入到基质中，高速剪切超微乳化，注入储液罐，保温在85℃，打开阀门，调节真空和压力装置，定时定量滴入5～15℃的冷却剂中，在表面张力的作用下，自然收缩成丸，擦净晾干后即得。
公开号为CN101962385A的中国专利介绍了一种岩白菜素的制备方法，包含以下步骤：1)取原料粉碎，加入15-20倍量饱和石灰水渗漉提取，滤过得提取液；2)上述提取液加入超滤膜超滤，加适量水透析，收集透过液；3)上述透过液调节ph2-3沉淀，滤出沉淀物，沉淀物热水回流溶解，加入大孔树脂吸附，ph8-10的石灰水溶液洗脱，收集洗脱液；4)上述洗脱液调节ph3-5放置结晶，结晶物滤出，再用99％乙醇回流溶解重结晶，真空干燥得产品。
公开号为CN104345116A的中国专利介绍了一种支气管炎片的定性定量检测方法,包括：(1)采用薄层色谱法鉴别黄芩、甘草；(2)采用高效液相色谱法测定盐酸麻黄碱、矮地茶中岩白菜素的含量，每片含矮地茶以岩白菜素计不得少于2.1mg、每片含盐酸麻黄碱(C10H15NO·HCl)应为标示量的70.0％～110.0％。
公开号为CN104345117A的中国专利介绍了一种复方矮地茶片中岩白菜素的含量测定方法，包括鉴别：采用显微鉴别法鉴别矮地茶，薄层色谱法鉴别矮地茶、野菊花、甘草；含量测定：采用高效液相色谱法测定矮地茶中岩白菜素的含量；每片含矮地茶以岩白菜素(C14H16O9)计，不得少于1.5mg。
公开号为CN104597196A的中国专利介绍了一种治疗热哮症的中成药中矮地茶的鉴别方法，该中成药含有麻黄160g、矮地茶360g、黄芩210g、苦杏仁210g、桃仁170g、地龙165g、五味子140g、淫羊藿240g、女贞子265g、甘草105g，制备方法是：女贞子265g、五味子140g加65％乙醇加热回流提取两次，每次1.5小时，合并提取液，回收乙醇浓缩至相对密度为1.07-1.09，另取麻黄160g、苦杏仁210g、桃仁170g水蒸汽蒸馏，收集馏出液备用，药渣与矮地茶360g、黄芩210g、地龙165g、淫羊藿240g、甘草105g五味药材加水煎煮两次，每次1小时，合并煎液及上述蒸馏后的药液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.02-1.06，合并上述三种提取液，喷雾干燥，加适量蔗糖粉，制粒1000g，即得；该中成药中矮地茶成分的鉴别方法是：供试品溶液的制备：采用大孔吸附树脂柱吸附、用质量浓度为35％的乙醇洗脱；对照品溶液的制备：以岩白菜素对照样品；采用薄层色谱法：使用聚酰胺薄膜展开、乙酸乙酯-醋酸的混合溶液为展开剂。
公开号为CN101962385A的中国专利介绍了一种槲皮甙的制备方法，以虎耳草科植物岩白菜、落新妇或矮地茶为原料，粉碎，加入15-20倍量饱和石灰水渗漉提取，滤过，提取液加入超滤膜超滤，加适量水透析，收集透过液，调节pH2-3沉淀，滤出沉淀物，沉淀物热水回流溶解，加入大孔树脂柱吸附，pH8-10的石灰水溶液洗脱，洗脱液调节pH3-5放置结晶，结晶物滤出，再用99％乙醇回流溶解重结晶，真空干燥得产品。
综上所述，紫金牛素和槲皮甙均具有较强的药理作用，在医药学领域的应用前景广阔。目前矮地茶未得到综合开发利用，探索从矮地茶中同时提取紫金牛素和槲皮甙意义非凡。
发明内容
目前公开的文献资料仅研究从矮地茶中提取活性成份紫金牛素，但未对其他活性成分进行综合利用。针对矮地茶的活性成分未综合开发利用问题，本发明提供一种操作简单、工艺合理、快速同时提取紫金牛素和槲皮甙的生产工艺。
因此，本发明提供一种从矮地茶中提取紫金牛素和槲皮甙的方法，具体步骤包括如下：
(1)将矮地茶粉碎至80目～120目，加入***进行50～75℃回流浸提50～100min，过滤，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，其中矮地茶重量kg与***体积L比为1:2～4。
(2)将滤渣Ⅰ加入5～15％木霉发酵液，25～35℃发酵12～24h，再向其中加入5～15％黑曲霉发酵液，25～35℃发酵2～4天，再加入50～85％乙醇溶液，进行80～95℃回流提取50～150min，过滤，得滤液Ⅱ，其中加入乙醇溶液体积L与矮地茶重量kg比为2～3：1。
(3)滤液Ⅱ在45～55℃进行减压浓缩至原有体积的1/40～1/60，得到浓缩液Ⅰ，加入两倍至四倍体积的***进行萃取，得萃取液Ⅰ和含水溶液(溶液A)。
(4)将溶液A与等体积乙醇进行混合均匀后，上大孔树脂柱，用四倍至六倍柱体积的含有70～85％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ，并将洗脱液Ⅰ进行45～55℃减压浓缩至原来体积的1/20～1/30，得浓缩液Ⅱ。
(5)将滤液Ⅰ和萃取液Ⅰ合并，并在45～55℃减压浓缩至原有体积的1/50～1/80，上硅胶层析柱(200～300目)，用五倍至八倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱，收集洗脱液Ⅱ，在45～55℃减压浓缩至干得干燥物Ⅰ，其中石油醚与乙酸乙酯混合比例为1：2～3。
(6)干燥物Ⅰ加70～85％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，在45～55℃减压浓缩至结晶析出，放冷结晶，得紫金牛素纯品，加入乙醇溶液体积L与干燥物Ⅰ粗品重量kg比2～5：1。
(7)将浓缩液Ⅱ放置在4～8℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为槲皮甙粗品，再用60～85％乙醇溶液进行溶解，在45～55℃减压浓缩至原来体积的1/10～1/30，在4～8℃静置过夜重结晶得槲皮甙纯品，加入乙醇溶液体积L与槲皮甙粗品重量kg比3～8：1。
上述所采用的大孔树脂为KLFC-150、AB-8、LSA-20、S-9等。
上述乙醇溶液，是指乙醇水溶液，其中50％乙醇溶液的配制方法为50mL无水乙醇加入50mL水混合制成。
在一个实施方案中，步骤(2)中所述5～15％木霉发酵液和5～15％黑曲霉发酵液中％是指体积质量比，加入发酵液体积L与矮地茶重量kg比。
在一个实施方案中，步骤(2)中所述活性炭的量kg与干燥物Ⅰ重量kg比0.2～2：1。
在一个实施方案中，步骤(1)、(2)、(6)和(7)中所述过滤，是指采用0.2μm孔径大小的陶瓷膜过滤一次。
技术效果
1、通过微生物高效转化矮地茶，大大提高了矮地茶的利用率，提高了附加值；同时降低了槲皮甙和紫金牛素的生产成本，节省了矮地茶药用资源。
2、本发明原料采用醇回流提取，同时获得槲皮甙和紫金牛素醇提物，又提高了提取率，同时缩短了提取时间，又大大节省了能耗。
3、本发明采用大孔树脂柱层析与结晶相结合的方法，比大孔吸附树脂操作简单，重复性好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
将100kg矮地茶粉碎至100目，加入350L***进行65℃回流浸提100min，过滤，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ。将滤渣Ⅰ加入15L木霉发酵液，28℃发酵24h，再向其中加入15L黑曲霉发酵液，28℃发酵3天，再加入80％乙醇溶液250L，进行85℃回流提取60min，过滤，得220L滤液Ⅱ。滤液Ⅱ在55℃进行减压浓缩至得到4L浓缩液Ⅰ，加入15L***进行萃取，得萃取液Ⅰ和溶液A。将3.5L溶液A与3.5L乙醇进行混合均匀后，上LSA-20大孔树脂柱，用六倍柱体积的含有80％乙醇溶液进行洗脱，得到80L洗脱液Ⅰ，并将洗脱液Ⅰ进行55℃减压浓缩得3L浓缩液Ⅱ。将滤液Ⅰ和萃取液Ⅰ合并，并在55℃减压浓缩至8L，上250目硅胶层析柱，用八倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(1：2)混合液洗脱，收集洗脱液Ⅱ，在55℃减压浓缩至干得2.33kg干燥物Ⅰ。干燥物Ⅰ加85％乙醇溶液5L溶解，加适量活性炭脱色，静置60min，过滤，在55℃减压浓缩至结晶析出，放冷结晶，得762g紫金牛素纯品。将浓缩液Ⅱ放置在5℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为2.72kg槲皮甙粗品，再用75％乙醇溶液15L进行溶解，在55℃减压浓缩至1L，在5℃静置过夜重结晶得2.11kg槲皮甙纯品。经HPLC进行检测，所获得的紫金牛素纯品中紫金牛素含量为96.53％、槲皮甙纯品中槲皮甙含量为98.38％。
对照实施例1
将100kg矮地茶粉碎至100目，加入350L***进行65℃回流浸提100min，过滤，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ。将滤渣Ⅰ加入30L水，28℃放置4天，再加入80％乙醇溶液250L，进行85℃回流提取60min，过滤，得220L滤液Ⅱ。滤液Ⅱ在55℃进行减压浓缩至得到4L浓缩液Ⅰ，加入15L***进行萃取，得萃取液Ⅰ和溶液A。将3.5L溶液A与3.5L乙醇进行混合均匀后，上LSA-20大孔树脂柱，用六倍柱体积的含有80％乙醇溶液进行洗脱，得到80L洗脱液Ⅰ，并将洗脱液Ⅰ进行55℃减压浓缩得3L浓缩液Ⅱ。将滤液Ⅰ和萃取液Ⅰ合并，并在55℃减压浓缩至8L，上250目硅胶层析柱，用八倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(1：2)混合液洗脱，收集洗脱液Ⅱ，在55℃减压浓缩至干得1.82kg干燥物Ⅰ。干燥物Ⅰ加85％乙醇溶液5L溶解，加适量活性炭脱色，静置60min，过滤，在55℃减压浓缩至结晶析出，放冷结晶，得457g紫金牛素纯品。将浓缩液Ⅱ放置在5℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为2.31kg槲皮甙粗品，再用75％乙醇溶液15L进行溶解，在55℃减压浓缩至1L，在5℃静置过夜重结晶得1.68kg槲皮甙纯品。经HPLC进行检测，所获得的紫金牛素纯品中紫金牛素含量为96.49％、槲皮甙纯品中槲皮甙含量为98.35％。
对照实施例2
将100kg矮地茶粉碎至100目，加入15L木霉发酵液，28℃发酵24h，再向其中加入15L黑曲霉发酵液，28℃发酵3天，再加入80％乙醇溶液250L，进行85℃回流提取60min，过滤，得220L滤液Ⅱ。滤液Ⅱ在55℃进行减压浓缩至得到4L浓缩液Ⅰ，加入15L***进行萃取，得萃取液Ⅰ和溶液A。将3.5L溶液A与3.5L乙醇进行混合均匀后，上LSA-20大孔树脂柱，用六倍柱体积的含有80％乙醇溶液进行洗脱，得到80L洗脱液Ⅰ，并将洗脱液Ⅰ进行55℃减压浓缩得3L浓缩液Ⅱ。将萃取液Ⅰ在55℃减压浓缩至8L，上250目硅胶层析柱，用八倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(1：2)混合液洗脱，收集洗脱液Ⅱ，在55℃减压浓缩至干得1.76kg干燥物Ⅰ。干燥物Ⅰ加85％乙醇溶液5L溶解，加适量活性炭脱色，静置60min，过滤，在55℃减压浓缩至结晶析出，放冷结晶，得435g紫金牛素纯品。将浓缩液Ⅱ放置在5℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为2.26kg槲皮甙粗品，再用75％乙醇溶液15L进行溶解，在55℃减压浓缩至1L，在5℃静置过夜重结晶得1.54kg槲皮甙纯品。经HPLC进行检测，所获得的紫金牛素纯品中紫金牛素含量为96.46％、槲皮甙纯品中槲皮甙含量为98.31％。
实施例2
将500kg矮地茶粉碎至100目，加入1200L***进行65℃回流浸提100min，过滤，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ。将滤渣Ⅰ加入70L木霉发酵液，28℃发酵24h，再向其中加入70L黑曲霉发酵液，28℃发酵3天，再加入80％乙醇溶液1200L，进行85℃回流提取90min，过滤，得1100L滤液Ⅱ。滤液Ⅱ在55℃进行减压浓缩至得到20L浓缩液Ⅰ，加入50L***进行萃取，得萃取液Ⅰ和溶液A。将19L溶液A与19L乙醇进行混合均匀后，上S-9大孔树脂柱，用六倍柱体积的含有80％乙醇溶液进行洗脱，得到400L洗脱液Ⅰ，并将洗脱液Ⅰ进行55℃减压浓缩得15L浓缩液Ⅱ。将滤液Ⅰ和萃取液Ⅰ合并，并在55℃减压浓缩至50L，上250目硅胶层析柱，用八倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(1：2)混合液洗脱，收集洗脱液Ⅱ，在55℃减压浓缩至干得11.87kg干燥物Ⅰ。干燥物Ⅰ加85％乙醇溶液30L溶解，加适量活性炭脱色，静置60min，过滤，在55℃减压浓缩至结晶析出，放冷结晶，得3.94kg紫金牛素纯品。将浓缩液Ⅱ放置在5℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为14.86kg槲皮甙粗品，再用75％乙醇溶液80L进行溶解，在55℃减压浓缩至1L，在5℃静置过夜重结晶得11.34kg槲皮甙纯品。经HPLC进行检测，所获得的紫金牛素纯品中紫金牛素含量为96.62％、槲皮甙纯品中槲皮甙含量为98.41％。

Claims (3)

1.一种从矮地茶中提取紫金牛素和槲皮甙的方法，具体步骤包括如下：
(1)将矮地茶粉碎至80目～120目，加入***进行50～75℃回流浸提50～100min，过滤，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，其中矮地茶重量kg与***体积L比为1:2～4；
(2)将滤渣Ⅰ加入5～15％木霉发酵液，25～35℃发酵12～24h，再向其中加入5～15％黑曲霉发酵液，25～35℃发酵2～4天，再加入50～85％乙醇溶液，进行80～95℃回流提取50～150min，过滤，得滤液Ⅱ，其中加入乙醇溶液体积L与矮地茶重量kg比为2～3：1；
(3)滤液Ⅱ在45～55℃进行减压浓缩至原有体积的1/40～1/60，得到浓缩液Ⅰ，加入两倍至四倍体积的***进行萃取，得萃取液Ⅰ和溶液A；
(4)将溶液A与等体积乙醇进行混合均匀后，上大孔树脂柱，用四倍至六倍柱体积的含有70～85％乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ，并将洗脱液Ⅰ进行45～55℃减压浓缩至原来体积的1/20～1/30，得浓缩液Ⅱ；
(5)将滤液Ⅰ和萃取液Ⅰ合并，并在45～55℃减压浓缩至原有体积的1/50～1/80，上200～300目硅胶层析柱，吸附30min后，用五倍至八倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱，收集洗脱液Ⅱ，在45～55℃减压浓缩至干得干燥物Ⅰ，其中石油醚与乙酸乙酯混合比例为1：2～3；
(6)干燥物Ⅰ加70～85％乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，在45～55℃减压浓缩至结晶析出，放冷结晶，得紫金牛素纯品，加入乙醇溶液体积L与干燥物Ⅰ粗品重量kg比2～5：1；
(7)将浓缩液Ⅱ放置在4～8℃静置过夜结晶，过滤得结晶物，即为槲皮甙粗品，再用60～85％乙醇溶液进行溶解，在45～55℃减压浓缩至原来体积的1/10～1/30，在4～8℃静置过夜重结晶得槲皮甙纯品，加入乙醇溶液体积L与槲皮甙粗品重量kg比3～8：1。
2.根据权利要求1的方法，所述采用的大孔树脂为KLFC-150、AB-8、LSA-20、S-9。
3.根据权利要求1的方法，步骤(1)、(2)、(6)和(7)中所述过滤，是指采用0.2μm孔径大小的陶瓷膜过滤一次。
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