CN106916065B - 从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种从牛蒡根中分离纯化绿原酸的方法，其特征是它包括如下步骤：（1）牛蒡根提取液的制备；取干燥的牛蒡根，粉碎，用碱水浸泡30min，采用超声或者微波进行提取，提取液调pH至11‑12之间；（2）净化富集；将（1）所得提取液上样阴离子交换柱，阴离子交换柱中的柱填料为弱碱性阴离子树脂，依次采用蒸馏水洗脱除去糖类等杂质，再用碱液洗脱，洗脱液用酸水调pH至2‑5，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩干燥得牛蒡根提取物；（3）采用高速逆流色谱法分离纯化绿原酸本发明以碱水为提取溶剂极大提高了绿原酸的溶解度，无需有机溶剂萃取富集，分离过程不需要使用固定载体且无死吸附，工艺简单、快速高效，重复性好，所得目标化合物纯度高。

Description

从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法

技术领域

本发明涉及从食品中提取、富集和分离其有效成分的方法，特别涉及一种从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的提取方法。

背景技术

牛蒡（ArctiumlappaL.）为菊科两年生草本植物，药食两用，从中国传入日本并被改良成优质蔬菜，在我国江苏的丰县、沛县和山东省的苍山等地区大量种植。牛蒡根为牛蒡的主要食用部位，具有极佳的保健价值，《本草纲目》记载其能“通十二经脉，除五脏恶气”、“久服轻身耐老”。医学研究证明，牛蒡根有健脾胃、清热解毒和保护血管等功效，对高血压、糖尿病、动脉硬化等疾病具有治疗作用。

牛蒡根富含菊糖、有机酸和甾醇类等成分，其中绿原酸是有机酸类化合物的主成分，目前常作为牛蒡根中重要的指标性成分进行质量评价。绿原酸具有广泛的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经***等作用，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。

对现有技术的文献检索发现：

中国专利申请号200510000484.0公开了从牛蒡叶中提取绿原酸的工艺，该工艺需要氯仿脱脂，脱脂后的样品用酸水提取后需再次经过乙酸乙酯的萃取富集，然后两次通过AB-8树脂柱进行洗脱、浓缩和重结晶等方法获得绿原酸，前期富集和后期两步富集的操作步骤繁琐，能耗大且消耗大量有机化学试剂。

中国专利申请号CN03111946.8也公开了一种从牛蒡叶中提取绿原酸的工艺，使用的提取溶剂为酸性有机溶剂，得到的牛蒡叶粗提物过聚酰胺柱，用水及甲醇洗脱，洗脱液经浓缩、精制，得绿原酸纯品。

中国专利申请号为201310726468.4的发明公开了一种细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法，用pH 为9的碱水浸泡破坏叶片上的角质层，然后用7倍的pH为 2的纯水动态常温提取2 h，用酸水重复提取，然后经膜处理、反渗透和树脂洗脱等工艺制备杜仲绿原酸。

中国专利申请号为201010542548.0的发明公开了一种从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，将杜仲叶的微波物通过乙酸乙酯/正丁醇/水作为溶剂体系进行高速逆流色谱分离纯化200min，制得高纯度绿原酸。

中国专利申请号201510316229.0的发明公开了一种利用高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，利用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为溶剂体系，通过高速逆流色谱法纯化100min，可以从十大功劳木乙醇提取物的乙酸乙酯相得到高纯度绿原酸18.32mg。

娄在祥学位论文《牛蒡功能性成分及其抗氧化、抗菌活性研究》（江南大学，2010：34-36）采用70%乙醇溶液为提取溶剂，提取物浓缩后经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取后得到四部分，其中乙酸乙酯组分经柱层析预处理后再通过高速逆流色谱正丁醇-乙酸-水（4︰1︰5）体系制备了纯度分别为98.3%的绿原酸。

陈德经等在《食品科学》（2008，29(11):298~299）“高速逆流色谱法分离纯化绿原酸研究”中发现利用正丁醇-冰乙酸-水（4︰1︰5，V/V）***，经6h制备可以从金银花提取物中获得纯度98.1%的绿原酸40 mg。

张霞等在《药物分析杂志》（2010，30(1)：106~109）“高速逆流色谱法分离纯化金银花中的绿原酸”中发现利用以正丁醇-乙酸-水（4∶1∶5）为溶剂体系，经4h制备可获得纯度为98.2%的绿原酸11.2mg。

石伯阳等在《食品科学》（2013，34(13):87~90）“紫甘薯中绿原酸及异绿原酸的高速逆流色谱分离”发现利用乙酸乙酯-甲醇-水（3︰1︰5）为溶剂体系经4h制备分离化合物从200mg紫甘薯萃取物得到纯度为98.5%的绿原酸28mg。

上述方法提取过程的溶剂均为水、酸水、水-醇、酸性醇溶液等中性或酸性提取溶剂，所得提取液中绿原酸基本保持分子状态；所得提取物经过乙酸乙酯萃取富集或者酸碱处理进行初步纯化，前处理操作步骤较为繁琐。已有专利涉及的细胞破壁低温提取杜仲绿原酸的方法中虽然用碱水进行了前处理，但是目标是破坏叶片的角质层，后期采用酸水进行提取，仍属于酸提范畴。此外，前期研究中所涉及的高速逆流分离过程存在制备量低，制备时间长的问题，一次制备量最多40mg，所需时间基本在100min以上。

发明内容

本发明提供一种快速高效地从牛蒡根中提取分离绿原酸的方法，该方法通过碱水提取、富集，高速逆流色谱分离纯化，从而得到高纯度的绿原酸（纯度>90% ）。该方案克服了以往提纯方法的制备量低、制备时间长和所需体系溶剂种类较多等问题，大大提高了生产效率、降低了生产成本。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种从牛蒡根中分离纯化绿原酸的方法，其步骤如下：

（1）牛蒡根提取液的制备；

取干燥的牛蒡根，粉碎，用碱水浸泡30 min，采用超声或者微波进行提取，提取液调pH至11-12之间；

（2）净化富集；

将（1）所得提取液上样阴离子交换柱，阴离子交换柱中的柱填料为弱碱性阴离子树脂，依次采用蒸馏水洗脱除去糖类等杂质，再用碱液洗脱，洗脱液用酸水调pH至2-5，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩干燥得牛蒡根提取物。

（3）采用高速逆流色谱法分离纯化绿原酸：将乙酸乙酯、甲醇和水按体积比4~5：0.1~1：4~5配成混合溶液置于分液漏斗中静止30min，取上层作为固定相，下层作为流动相；先泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，开启转速调节器，泵入流动相，待流动相流出且紫外检测器读数较稳定时，取（2）中所得牛蒡根提取物溶于等量的固定相和流动相并进样，观察色谱图，待目标峰出现时收集馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥得高纯度绿原酸。

本发明的具体特点还有，步骤（1）中所述碱水中的碱为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、甲醇钠和乙醇钠等碱性样品，浓度为0.1mol/L-1mol/L。

步骤（2）中，弱碱性阴离子树脂为二乙胺阴离子交换树脂、大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或者弱碱性阴离子交换树脂D301。

步骤（2）中，调节洗脱液pH值的酸水为1mol/L-5mol/L的盐酸、硫酸、磷酸、甲酸。

步骤（3）中，高速逆流色谱仪为同田TBE-3000C，流动相流速5-12mL/min。

本发明的有益效果是：与现有以中性和酸性提取剂的绿原酸提取技术相比，本发明开创性的利用碱水作为提取溶剂，使得绿原酸与碱反应形成盐，可以大幅提高绿原酸在提取剂中的溶解度，与先前文献中中性及酸性提取剂相比绿原酸溶解度可以提高50%以上；通过阴离子交换树脂及调pH后乙酸乙酯萃取等富集手段可大幅提高待制备样品中的绿原酸的纯度；所建立的高速逆流色谱分离方法流速快，制备时间短，制备效率是文献中的5-10倍，具有突出的效果。

附图说明

图1是高速逆流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

一种从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法，包括以下步骤：

（1）牛蒡根提取液的制备

将牛蒡根干饮片粉碎过40目筛，取100g样品，按料液比1︰10用0.1mol/L的氢氧化钠进行超声提取三次，时间分别为1.5h、1h和0.5h，合并提取液；用0.1mol/L的盐酸调pH至11-12。

（2）净化富集

取牛蒡根提取液加样至二乙胺阴离子交换树脂层析柱，上样速率为3BV/h，先用蒸馏水以5BV/h进行洗脱2h，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液以3BV/h洗脱1h，500mL作为一个单位接收，合并洗脱液；用1mol/L的盐酸调pH至4-5，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相并减压浓缩干燥得牛蒡根提取物3.6g。

（3）采用高速逆流色谱法分离纯化绿原酸

将乙酸乙酯、甲醇和水按照5︰1︰5的体积比，即乙酸乙酯1000mL，甲醇200mL和水1000mL倒于分液漏斗中，震荡均匀，静止30min备用。取上层作为固定相，下相作为流动相。取（2）中制得的牛蒡根提取物450mg，分别溶于15mL等量上下相组成的溶解体系，超声溶解，通过同田TBE-3000C高速逆流色谱进行分离。恒温循环器温度设定为25℃，开启紫外检测器，以40mL/min泵入固定相，待固定相充满管路后，开启主机调转速至800rpm，以10mL/min流速泵入流动相。当有流动相流出且极限平稳后，由进样阀进样并记录逆流色谱图，收集馏分（10mL /管），用高效液相色谱仪检测馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥得高纯度绿原酸。

（4）目标化合物的纯度检测

HPLC检测条件如下：Gemini NX-C18（ 250×4.6 mm，5 μm），柱温25℃；流动相：甲醇-0.1%甲酸水（27：73）；流速1mL/min；进样量10μL；检测波长330nm。

目标化合物的收集：经过对收集的馏分进行检测，发现目标化合物（绿原酸）在高速逆流色谱的23~38min之间流出。

目标化合物的纯度测定，收集高速逆流色谱的26~35min之间的馏分，去除有机溶剂，冻干后得到样品108.3mg，高效液相色谱面积归一化法测得纯度为93.1%。

实施例2：

本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于：一种从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法，步骤（3）采用同田TBE-3000C高速逆流色谱进行分离纯化绿原酸，将乙酸乙酯、甲醇和水按照4︰0.1︰4的体积比，即乙酸乙酯1000mL，甲醇200mL和水1000mL倒于分液漏斗中，震荡均匀，静止30min备用。取上层作为固定相，下相作为流动相。

目标化合物的收集：经过对收集的馏分进行检测，发现目标化合物（绿原酸）在高速逆流色谱的25~43min之间流出。

目标化合物的纯度测定，收集高速逆流色谱的28~37min之间的馏分，除有机溶剂冻干后得到样品80.1mg，高效液相色谱面积归一化法测得纯度为94.2%。

实施例3：

本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于：

（1）牛蒡根粗提物的制备：

将牛蒡根加工后废弃的外表皮，干燥粉碎过40目筛，取样50g，用500mL的1mol/L氢氧化钾溶液超声提取1 h；重复提取一次，合并提取液，用1mol/L盐酸调pH至3-4，等体积乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩干燥得牛蒡根提取物2.1g；

（2）高速逆流色谱分离：

将乙酸乙酯、甲醇和水按照5︰0.5︰4的比例，取（1）中制得的牛蒡根乙酸乙酯粗提物240mg，分别溶于5mL等量上下相组成的溶解体系，超声溶解。通过同田TBE-3000C高速逆流色谱进行分离，制备步骤及纯度检测方法同实施例1，蒸除有机溶剂冻干后得到样品59.4mg，高效液相色谱面积归一化法测得纯度为93.6%。

实施例4：

一种从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法，其主要步骤为：取干燥粉碎的牛蒡根100g，0.1mol/L的2000 mL氢氧化钾浸泡30min，采用超声提取60min，提取液调pH至12；将提取液过滤后上二乙胺阴离子交换树脂交换柱，依次采用1500mL蒸馏水洗脱除去糖类等杂质，再用1500 mL的0.1mol/L氢氧化钾洗脱，洗脱液用盐酸调pH至3；合并洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，浓缩至干的牛蒡根提取物；将乙酸乙酯、甲醇和水按体积比5︰1︰4配成混合溶液置于分液漏斗中静止30min，上层作为固定相，下层作为流动相使用同田TBE-3000C高速逆流色谱仪进行分离；观察逆流色谱图，待目标峰出现时收集馏分10mL/瓶，液相监测纯度，将纯度大于90%的样品合并，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥得高纯度绿原酸。

选择具有合适分配系数的溶剂体系，一般认为分配系数K值在0.5~2之间分离效果较好。从制备时间上来看，在满足纯度要求的前提下，时间越短，制备效率越高，单位时间产值越高。

K值测定：预先将分离体系达到平衡，分别取上下相各1mL置于5mL连盖离心管中，加入牛蒡根精制物（约1-3mg），震荡使其溶解。静置后，上下相各取0.5mL分别置于2mL连盖离心管中，氮气吹干，1mL甲醇溶解，进行HPLC检测，上下相的峰面积分别记为A₁和A₂，K= A₁/A₂，结果见表1。

分离效率考察：将下相按照不同的流速进行泵入，分别考察不同流速下绿原酸的分离效果，结果见表2。

从表1中可知，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体系中，测得的分配系数偏小，可见在固定相中的溶解度太小，在利用同田TBE-3000C高速逆流色谱进行分离时，目标化合物洗脱速度太快，难以进行有效的分离，在实际的高速逆流分离试验中，证实样品的溶解性不充分且目标化合物没有得到很好地分离纯化，因此不宜作为分离的溶解体系。从表2中可知，流速为10 mL/min也可以将目标化合物有效分离，制备的高速逆流色谱图见图1，收集待测组分经液相色谱分析，纯度大于90%。

本发明发现，在乙酸乙酯-甲醇-水和乙酸乙酯-乙醇-水的分离体系中，测得的分配系数较为适宜，因此选择该体系作为分离绿原酸的溶剂***。通过实验，乙酸乙酯-甲醇-水（4~5：0~1：4~5）相较其他比例的体系，在10 mL/min的高制备流速下，能够分离纯化纯度较高的目标化合物。

表2 不同流速制备目标成分的出峰时间

对比例一：

按照中国专利申请号CN03111946.8，将干燥粉碎的牛蒡根100g，用2000mL乙醇（pH2）分2次于78℃分别回流提取2h和1h，每次抽提后合并滤液，减压浓缩的牛蒡根粗提物。将牛蒡根粗提物上聚酰胺柱，用水及甲醇洗脱，洗脱液经浓缩精制，得高纯度绿原酸。

对比例二：

按照中国专利申请号CN200510000484.0，将干燥粉碎的牛蒡根100g加入1300mL氯仿回流提取80 min，过滤，弃去氯仿层；将经过氯仿提取后的样品加入1200 mLpH 3.5的硫酸水溶液回流提取2h，浓缩至100 mL的粗提物；将粗提物用2000mL乙酸乙酯分4次萃取，弃去乙酸乙酯部分；剩余溶液过AB-8大孔树脂，分别用pH 3.5酸水和30%的乙醇洗脱；乙醇洗脱液浓缩后再上样AB-8大孔树脂，分别用pH 3.5酸水和30%的乙醇洗脱，浓缩重结晶得高纯度绿原酸。

对比例三：

按照文章“高速逆流色谱法分离纯化绿原酸研究（《食品科学》，陈德经等，2008）”，将牛蒡根粉碎后精确称取50g，用70%乙醇溶液，料液比1︰10，pH4，在70℃水浴中提取2 次，每次提取1.5h，合并滤液，在60℃下减压浓缩至100ml 左右，依次用石油醚、乙酸乙酯分别萃取三次，在60℃下减压浓缩乙酸乙酯层。选择正丁醇-冰乙酸-水(4︰1︰5，V/V)***来分离，得高纯度绿原酸。

经大量试验结果显示，只有本发明技术方案能够在60min内从牛蒡根中得到纯度大于90%的绿原酸。

Claims (3)

1.一种从牛蒡根中分离纯化绿原酸的方法，其特征是它包括如下步骤：

（1）牛蒡根提取液的制备；

取干燥的牛蒡根，粉碎，用碱水浸泡30min，采用超声或者微波进行提取，提取液调pH至11-12之间；

（2）净化富集；

将（1）所得提取液上样阴离子交换柱，阴离子交换柱中的柱填料为弱碱性阴离子树脂，依次采用蒸馏水洗脱除去糖类等杂质，再用碱液洗脱，洗脱液用酸水调pH至2-5，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩干燥得牛蒡根提取物；弱碱性阴离子树脂为二乙胺阴离子交换树脂、大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或者弱碱性阴离子交换树脂D301；

（3）采用高速逆流色谱法分离纯化绿原酸：高速逆流色谱仪流动相流速5-12mL/min；将乙酸乙酯、甲醇和水按体积比4~5：0.1~1：4~5配成混合溶液置于分液漏斗中静止30min，取上层作为固定相，下层作为流动相；先泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，开启转速调节器，泵入流动相，待流动相流出且紫外检测器读数较稳定时，取（2）中所得牛蒡根提取物溶于等量的固定相和流动相并进样，观察色谱图，待目标峰出现时收集馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥得高纯度绿原酸。

2.根据权利要求1所述的从牛蒡根中分离纯化绿原酸的方法，其特征是步骤（1）中所述碱水中的碱为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、甲醇钠和乙醇钠碱性样品，浓度为0.1mol/L-1mol/L。

3.根据权利要求1所述的从牛蒡根中分离纯化绿原酸的方法，其特征是步骤（2）中，调节洗脱液pH值的酸水为1mol/L-5mol/L的盐酸、硫酸、磷酸、甲酸。

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